治疗神经元疾病的药物 本发明涉及治疗神经元疾病的药物，它包括促进糖(神经)鞘脂生物合成的物质作为有效成分。
已知糖鞘脂(下文称作GSL)以哺乳动物细胞的细胞表面膜的构成组分存在，它们通过生物活性物质的受体功能、细胞间的相互识别功能、细胞间的相互反应等与细胞功能例如繁殖、生长、分化、转化、免疫反应等密切相关。
其中，神经节苷脂是含有唾液酸的GSL，并且据说它具有恢复外周神经损伤和中枢神经失调的活性，即它可以加快神经的再生和神经传导的过程。迄今为止，已经对外源神经节苷脂对各种神经机能病模型的功效进行了研究。名为Cronassial的药物已经作为此类应用投放意大利市场，并且已经提交了与此有关的专利申请(日本临时专利公开34912/1977)。但是，没有发现产生抗神经节苷脂抗体的临床病例，因为服用该药物(即外源神经节苷脂)引起了多种神经官能症。例如已有关于肌萎缩性侧索硬化(其中产生了抗—GM2抗体)(Lancet，337，1109—1110，1991)和急性热病性多神经炎(其中产生了抗—GM1抗体)的报道(Lancet，338，757，1991)。
目前，研究神经节苷脂功能最常用的方法是将神经节苷脂加入外部实验系统中。在这种情况下，与内源神经节苷脂的关系就成了问题。也就是说，应该考虑到，向系统(该系统中存在于细胞膜中的内源神经节苷脂已经与各种细胞表面受体等形成复合物)中进一步加入神经节苷脂所得到地结果不能反映出内源神经节苷脂的真实细胞生理学重要性。因此，为了了解神经节苷脂在细胞生理学中的固有作用，需要一种特异性改变内源GSL生物合成的方法。本发明人先前已经合成了1-苯基-2-癸酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇(PDMP)，它与酰基鞘氨醇类似，并且已经证明D-苏-PDMP专一地抑制葡糖基酰基鞘氨醇生物合成酶，以及用葡糖基酰基鞘氨醇作为起始物质大大地降低了细胞内的所有GSL含量(J.Lipid.Res.，第28卷，565—571，1987)。再者，已有报道，D-苏-PDMP降低GSL含量，因此抑制了轴突的伸展(J.Biochem.，110，96—103，1991)。
另一方面，我们发现，作为旋光对映体的D-苏-PDMP，可以加速GSL的生物合成(J.Cell.Physiol.，141，573—583(1989))。但是，无论D-苏-PDMP是否增加神经细胞中的内源神经节苷脂含量，也无论其是否增加内源神经节苷脂的活性，神经细胞的功能是未知的，并且尚未进行过研究。
本发明的目的是提供一种药物，该药物用于治疗由中枢神经系统和外周神经系统紊乱引起的各种疾病，所使用的药物可促进神经细胞中内源GSL的生物合成，特别是神经节苷脂。
为了开发以新的机理为基础的用于治疗神经元疾病的药物，本发明人进行了广泛的研究，结果发现特定的2-酰氨基丙醇衍生物促进GSL的生物合成，并且显著加快了轴突的伸展和突触的形成，从而完成了本发明。
也就是说，本发明涉及用于治疗由外周神经系统和中枢神经系统紊乱引起的神经元疾病的药物，该药物包括式(I)所示的2-酰氨基丙醇衍生物或其可药用盐作为有效成分(下文中有时称作本发明化合物)：(I)其中R1表示苯基或环己基，它们各自可以被1—3个相同或不同的选自烷基、烷氧基、羟基和硝基的取代基取代，或者R1表示烷基，n表示0—16的整数。
再者，本发明涉及治疗神经元疾病的方法，该方法包括给患有因外周神经系统和中枢神经系统紊乱引起的神经元疾病的哺乳动物施用促进糖鞘脂生物合成、加快轴突伸展和/或加快突触形成有效量的上述式(I)所示的2-酰氨基丙醇衍生物或其可药用盐。
本发明还涉及含有上述式(I)所示的2-酰氨基丙醇衍生物、其可药用盐或同时含有这两者的药物组合物用于制备治疗由外周神经系统和中枢神经系统紊乱引起的神经元疾病的药物的用途。
本发明还涉及脂质体制剂组合物，该组合物含有至少上述式(I)所示的2-酰氨基丙醇衍生物或其可药用盐及磷脂。
下面将详细解释本发明。
在上述式(I)中，作为R1的苯基或环己基的取代基的烷基或烷氧基的碳原子数优选1—4。R1的烷基的碳原子数优选6—15，最优选10—15。烷基是例如己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基等。n是0—16的整数，优选4—16的整数、最优选6—12。
在上述式(I)所示化合物中，特别优选的是1-苯基-2-酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇，其中n是6-12，最优选的是1-苯基-2-癸酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇(下文称作PDMP)。在本发明化合物中存在立体异构体，并且可以使用任何一种立体异构体。也可以使用立体异构体的混合物，例如外消旋混合物等。尤其可以提及的是D-苏-异构体(1R，2R)、L-苏-异构体(1S，2S)、DL-苏-异构体、D-赤-异构体(1S，2R)、L-赤-异构体(1R，2S)和DL-赤-异构体。从加快糖脂生物合成作用的角度出发，特别优选的是L-苏-异构体(1S，2S)。
上述式(1)所示化合物是已知物质(US 5,041,441和日本临时专利公开254623/1989)，并且可以例如按照下列文献所述方法进行合成：J..Lipid.Res.，28，565—571，(1987)和J.Biochem.，111，191—196，(1992)。
所得4种异构体的混合物可以使用氯仿/乙醚分级结晶分离，分别得到DL-苏-异构体和DL-赤-异构体。然后再以二苯甲酰-D-酒石酸盐或二苯甲酰-L-酒石酸盐的形式结晶，分别得到D-苏-异构体和L-苏-异构体。
作为上述式(I)所示化合物的可药用盐，可以提及的是无机酸例如盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲酸等的盐；有机酸例如乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、草酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、三氟乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等的盐。
通过给患有因外周神经系统或中枢神经系统紊乱引起的神经元疾病的哺乳动物包括人施用有效量的上述式(I)所示的2-酰氨基丙醇衍生物或其可药用盐，可以治疗所述动物。可以提及的有代表性的疾病是各种预期可通过神经纤维再生治愈的中枢神经系统疾病，例如中风、脑梗塞、脑出血、脑损伤、记忆障碍、老年性痴呆、阿尔茨海默症、帕金森症等；以及各种外周神经系统疾病，例如胸腺机能障碍引起的多神经病、机械性(mechanical)神经病、中毒性神经病等。药物制剂
使用本发明化合物与载体、赋形剂、稀释剂和其它添加剂可以得到口服或非肠道施用的药物制剂。再者，本发明化合物可以通过血脑屏障(J.Lipid.Res.，32，713—722(1991))，因此可以预期注射液和口服药剂对脑神经元疾病有效。特别是，含有本发明化合物的细小尺寸的脂质体(例如脂质毫微球等)或脂质乳液制剂可以以约10倍于生理盐水溶液的量通过血脑屏障，所以，当本发明药物用于治疗脑神经元疾病时是特别有效的。
作为口服制剂，可以提及的是固体制剂，例如粉末、颗粒。胶囊、片剂等；和液体制剂，例如糖浆、酏剂、乳液等。
通过例如与赋形剂如乳糖、淀粉、微晶纤维素、乳酸钙、磷酸一氢钙、偏硅铝酸镁、硅酸酐等混合，可以得到粉末。通过加入上述赋形剂，以及如果需要，加入例如粘合剂如蔗糖、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，或者加入崩解剂例如羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙等，并将该混合物湿法或干法制粒，可以得到颗粒剂。通过将上述粉末或颗粒本身或者将其与润滑剂例如硬脂酸镁、滑石等一起压片，可以得到片剂。此外，上述片剂或颗粒剂通过用肠溶基质例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物等包衣，或者用乙基纤维素、巴西棕榈蜡、硬化油等包衣，可以制成肠溶制剂或持续作用制剂。通过将上述粉末或颗粒装入硬胶囊中可以制成硬胶囊。另外，通过将本发明化合物溶于甘油、聚乙二醇、芝麻油、橄榄油等中，并用明胶膜将该混合物包衣，可以得到软胶囊。通过将甜味剂例如蔗糖、山梨醇、甘油等和上式所示的化合物或其盐溶于水中，可以得到糖浆。除了甜味剂和水之外，还可以加入精油、乙醇等制成酏剂，或者加入阿拉伯胶、黄蓍胶、多乙氧基醚、羧甲基纤维素钠等制成乳液或悬浮液。再者，如果需要，可以向这些液体制剂中加入矫味剂、着色剂、防腐剂等。
可以提及的非肠道制剂是注射液、直肠内施用的制剂、阴道栓、局部(endermic)制剂、吸入剂、气雾剂、眼用制剂等。
通过向本发明化合物中加入pH调节剂例如盐酸、氢氧化钠、乳酸、乳酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠等；等渗剂例如氯化钠、葡萄糖等；和注射用蒸馏水，灭菌并过滤该混合物，然后将该混合物装入安瓿等中，可以得到注射液。另外，通过加入甘露糖醇、糊精、环糊精、明胶等并在真空下将该混合物冻干，可以得到在使用时可溶解的注射液。通过向本发明化合物中加入乳化剂例如卵磷脂、多乙氧基醚、聚氧乙烯硬化蓖麻油等，然后将该混合物在水中乳化，还可以得到注射用乳液。
另外，作为注射液，可以提及的是脂质体制剂，该制剂能够改善稳定性和向靶器官传送的速度。特别是毫微球脂质体(脂质毫微球)不仅不需进入网状内皮组织即可提高血液浓度和降低显示药物功效所需的最小有效剂量，而且还可以容易地通过血脑屏障，因而适用于治疗脑神经元疾病。可以按照已知的脂质体制备方法制备脂质体制剂(C.G.Knight，Liposomes：From Physical Structure to Thera-peutic Applications第51—82页，Elsevier，Amsterdam，1981；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75，4194，1978)。
即，作为形成脂质体膜的两亲物质，可以使用磷脂例如天然磷脂(蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、心磷脂等)、合成磷脂(二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺等)和其它物质。类似，为了改善膜稳定性、流动性和药物的膜通透性，可以加入已知的各种添加剂例如胆固醇类(胆固醇、麦角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、豆甾醇等)、已知的使脂质体带有负电荷物质(磷脂酸、磷酸二鲸蜡酯等)、已知的使脂质体带有正电荷的物质(硬脂酰胺和硬脂酰胺乙酸酯)、抗氧剂(生育酚等)、油状物质(豆油、棉籽油、芝麻油、鳕鱼肝油等)和其它物质。
可以例如通过下列方法制备脂质体。将上述两亲物质和添加剂以及本发明化合物分别溶于有机溶剂(单一的溶剂例如氯仿、二氯甲烷、乙醇、甲醇、己烷等或这些溶剂的混合物)中，将各溶液混合，在惰性气体(氮气、氩气等)存在下、在瓶例如烧瓶等中除去有机溶剂，在瓶壁上包上薄膜。然后，将该薄膜加入合适的含水介质(生理盐水、缓冲液、磷酸盐缓冲的生理盐水等)中，用搅拌器搅拌该混合物。为了得到小粒度的脂质体，用超声乳化器、加压型乳化器、French压力槽粉磨机等进一步分散该混合物。如上所述，通过用膜滤器处理液体(该液体中制备脂质体所需的两亲物质等和本发明化合物分散于含水介质中)得到粒度分布得以控制的毫微球脂质体(脂质毫微球；粒度约为25—50nm)，以此进行脂质体的制备。再者，可以对脂质体进行分级处理，例如超滤、离心、凝胶过滤等，以除去未载带的药物。
另外，通过加入除上述两亲物质物质和添加剂之外的β-辛基葡糖苷、L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、苯基氨基甘露糖苷或硫酯类作为成膜物质得到在膜上含有葡萄糖残基、丝氨酸残基、甘露糖残基或硫酯的脂质体，通过用该脂质体载带本发明化合物，脂质体可以容易地通过血脑屏障(该方法可参见日本临时专利公开69332/1992)。
通过向本发明化合物中加入栓剂基质例如椰子两性酸的单一、二—或三—甘油酯、聚乙二醇等，然后加热使该混合物熔融，倒入模中冷却，或者将本发明化合物溶于聚乙二醇、豆油等中，然后用明胶膜将该混合物包衣，可以得到直肠内施用的药剂。
通过向本发明化合物中加入白蜡、蜂蜡、液体石蜡、聚乙二醇等，(如果需要)加热该混合物并捏合，可以得到局部药剂。通过将本发明化合物与粘合剂例如松香、丙烯酸烷基酯聚合物等捏合，并将该混合物涂布在无纺纤维等上，可以得到带状药剂。通过例如将本发明化合物溶解或分散于推进剂例如可药用惰性气体等中，并将该混合物装入压力容器中，可以得到吸入剂。
用药方法
含有本发明的化合物作为有效成分的药物，其用药方法没有特别的限制，但是当其用于治疗因中枢神经系统紊乱所引起的神经元疾病时，优选肌内注射、静脉内注射、皮下注射或腹膜内注射。特别是当其用于治疗脑神经元疾病时，优选注射脂质体制剂或液体乳液制剂的方法。剂量
合适的剂量可以根据给药方法、患者的年龄、健康状况、体重等测定，但是一般为0.25—200mg/kg，优选0.5—100mg/kg，以每天单次剂量或分次剂量施用。急性毒性
将溶于非离子表面活性剂(Myrj 52)的L-苏-PDMP的盐酸溶液腹膜内给予ICR鼠(雄性，6周大，体重：约28至30克)。LD50值为350mg/kg。
将溶于DMSO(125mg/kg)的DL-苏-PDMP或DL-赤-PDMP的盐酸溶液腹膜内给予ICR鼠(雄性，8周大，体重：约38至40克)。DL-苏-PDMP的LD50值约为250mg/kg，DL-赤-PDMP约为700mg/kg。一般毒性
将分别溶于将溶于非离子表面活性剂(Myrj 52)的L-苏-PDMP的盐酸溶液和DL-苏-PDMP的盐酸溶液以100mg/kg/天的速率(以上述盐酸PDMP计算)连续对ICR鼠给药(腹膜内)10天。对两种化合物而言，由于骨髓的抑制观察到二者都不减轻体重也不减少中性白细胞、嗜酸白细胞等，并且观察3个月后，未见异常。
图1表示L-苏-PDMP及其具有不同酰基链长的类似物的糖脂生物合成加速作用。
图2是一个生物形态学的相对照显微照片，其表明L-苏-PDMP对初期培养的大鼠脑神经细胞的轴索牵伸加速作用(图中实线表示细胞的范围，总长为100nm)。
A：对照
B：加入5μM L-苏-PDMP
C：加入20μM L-苏-PDMP
D：加入40μM L-苏-PDMP
图3表示L-苏-PDMP对初期培养的大鼠脑神经细胞的轴索牵伸加速作用。
图4表示L-苏-PDMP和D-苏-PDMP对细胞内Ca2+波动频率(％)的影响，其反映了初期培养的大鼠脑神经细胞突触形成的数量。
(实施本发明的最好形式)
以下为本发明的实施例，但是本发明不因此受到限定。所有用于下述实施例的D-苏-PDMP或L-苏-PDMP都是盐酸盐，但是当使用其它药用盐时也可以得到相同的结果。实施例1
将怀孕18天的鼠胎取出，无菌提取鼠胎的前脑基底部分，并用剪刀切成小块。用番木瓜酶(在含有180U番木瓜酶、0.02％牛血清白蛋白和0.5％葡萄糖的0.02％ L-半胱氨酸的磷酸盐缓冲液中，pH 7.4，于37℃，30分钟)处理小块后，将其用1∶1的Dulbecco修饰的Eagle′s培养基和Ham′sF12培养基的混合溶液(DF培养基)洗涤，并悬浮在含有5％小牛血清和5％马血清的DF培养基中。将这种神经细胞悬浮液装入24井，1×106细胞/井的培养基(Falcon，Primaria)中。随后，加入20μM D-苏-PDMP或L-苏-PDMP，进行3天的神经细胞初期培养。培养完成后，将每个井中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，并用橡胶淀帚回收。然后，通过加入氯仿/甲醇/水(1∶2∶0.8)并振摇5分钟来萃取神经节苷脂部分。将神经节苷脂部分溶于50μl水中，利用Hara等的方法(Anal.Biochem.179，162—166，1989)测量结合唾液酸的神经节苷脂的量以确定神经节苷脂的含量。定义为100％的未添加的组(对照)与实验组对比，结果示于表1中。
表1 D-苏-PDMP和L-苏-PDMP对初期培养的
鼠大脑神经细胞神经节苷脂含量的影响神经节苷脂含量对照 100％D-苏-PDMP 63.4％L-苏-PDMP 127.1％
用20μM的D-苏-PDMP处理时，正如所预料，清楚的观察到了神经节苷脂水平的降低(基于葡糖苷酰鞘氨醇生物合成酶的抑制)。另一方面，在用20μM L-苏-PDMP处理3天的神经细胞中，与对照相比，神经节苷脂水平增加了约30％。这样，发现L-苏-PDMP对大鼠脑神经细胞具有GSL生物合成加速作用，并且可提高内源性神经节苷脂的水平。实施例2
将从神经外胚层获得的B16黑瘤细胞放入12井，1×105细胞/井的培养基中，在含有10％小牛血清的Dulbecco修饰的Eagle′s培养基中培养24小时。然后，用相同的含有5μM L-苏-PDMP或其类似物(改变了酰基链长)的培养溶液替换该培养基，并加入3H-半乳糖。24小时后，除去培养基，用1ml含有0.1％EDTA的磷酸盐缓中液洗涤细胞，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，将混合液在37℃放置5分钟。回收细胞后，加入未标记的B16黑瘤细胞(1.4×107细胞)，用磷酸盐缓冲液洗涤混合液，然后得到一团细胞。将4ml甲醇和氯仿连续加入到细胞团中以提取所有的GSL，接着蒸发干燥。残余物用含有0.2N氢氧化钠的氯仿∶甲醇(1∶1)进行碱性水解，用乙酸中和后蒸发干燥。将蒸发干燥的产物溶于水中，然后用Sep—Pakcartridge C18(Waters)脱盐。将吸收的GSL用1ml甲醇和4rnl氯仿∶甲醇(1∶1)溶出，然后在氮气流下蒸发干燥。接着，用吡啶—乙酸酐、Florisil柱和脱乙酰化(J.Lipid Res.，12，257—259，1971)通过乙酰化的常规方法纯化GSL，然后脱盐并蒸发干燥。将纯化的GSL部分溶于50μl氯仿∶甲醇(1∶1)中，把40μl溶液置于硅胶板(TLC)，用氯仿∶甲醇∶水(60∶35∶8)展开。然后，用碘显色法确认葡糖苷酰鞘氨醇、乳糖基酰基鞘氨醇和神经节苷脂GM3，将其分别从TLC刮下，用液闪计数器测量放射性。结果示于图1。从图1可清楚看出，发现在L-苏-PDMP及其类似物(酰基链长改变)中，n为6，8，10和12的通式(I)化合物显著增加了神经节苷脂的生物合成。
实施例3
无菌提取出生后0天的鼠脑的海马，按与实施例相同的方式用番木瓜酶碱性酶处理，然后用DF培养液洗涤。在96井、用聚-L-赖氨酸覆盖(密度为2×104细胞/cm2)的板中培养神经细胞，同时分别加入5μM、20μM和40μM的L-苏-PDMP。培养24小时后，用仲甲醛固定神经细胞，通过显微照片记录轴突牵伸的程度，然后观察。从图2的显微照片可清楚看出，L-苏-PDMP在鼠大脑神经细胞的初期培养中显示出显著的轴突牵伸作用。
而且，如图3所示，当用四个实验组的照片测量轴突的长度并进行统计学处理时，显然L-苏-PDMP加速了轴突牵伸(显著性差异为p＜0.005，浓度范围是1至40μM)。
这样，从实施例1到3，很明显本发明的L-苏-PDMP及其酰基链长改变的类似物具有显著的轴突牵伸加速作用，即，通过增加神经细胞的内源性神经节苷脂水平对神经细胞的差异加速作用。实施例4
(1)本发明人近来宣传一种“示踪电路”(“tracing circuit”)模型，其突触结合的动力变化甚至发生在人成熟大脑中，在电路外选择性移去突触并且电路内突触结合数量的增加是人体长期记忆的机制(Kurada Y.，Neurochem.Intern.，309—319，1989)。
另外，由于测量突触形成的方法相对简单容易，已发展了一种使用Fura—2的神经细胞中Ca2+的多点观察系统，并且已证实突触形成的数量与同时细胞内Ca2+波动的频率成正比(Br.J.Pharma-col.，89，191—198，1986；neurosci.Lett.，78，69—74，1987)。本发明人利用这一方法研究了在鼠大脑皮层神经细胞之间L-苏-PDMP和D-苏-PDMP对突触形成的影响，结果如下所示。
将怀孕18至19天的鼠胎大脑皮层神经细胞通过用番木瓜酶的酶处理分离，并如实施例1相同的方式培养。从培养的第一天起通过加入L-苏-PDMP或D-苏-PDMP并且测量细胞内Ca2+波动的频率，检查突触形成的程度。结果示于图4，可以清楚地观察到突触形成数量的增加(依赖于L-苏-PDMP的剂量)。这样，L-苏-PDMP不仅可以加速轴突的牵伸，而且可以加速突触的形成，因此很明显其在治疗各种神经元疾病有可能有效。另外，具有GSL生物合成抑制作用的D-苏-PDMP抑制性作用于突触的形成，从而发现内源性GSL，特别是神经节苷脂在突触形成过程中起到了重要作用。
(2)类似于(1)使用怀孕16天的鼠胎的大脑皮层，通过下述方法进行移植培养以证实本发明药剂治疗神经元疾病的效果。
即，按照J.Neurochem.，61，2155—2163(1993)中的方法，将上述大脑皮层切成小块，当将含有大脑皮层神经元的组织培养基通过在不含血清的培养基中培养小块处理时，作为给药组，把L-苏-PDMP或D-苏-PDMP加入培养基中使浓度为5至20μM，培养2天混合液。培养后给药的轴突牵伸作用通过测量具有外植体(培养组织中)中轴突的神经细胞数量而确定。
结果，在给予10μM L-苏-PDMP组中的上述神经细胞的数量约是未给药组的1.5倍。另一方面，在给予10μM D-苏-PDMP组中未观察到象L-苏-PDMP中的轴突牵伸加速作用。
如上所述，即使在大脑皮层的组织培养基中，也显示出L-苏-PDMP对轴突牵伸的作用，因此很明显通过显示体内类似的作用，当本发明治疗神经元疾病的药剂给予哺乳动物(包括人)时，其可有效地治疗伴有大脑皮层神经元退化(例如早老性痴呆等等)的神经元疾病。
实施例5
胶囊的制备实例
均匀混合100mg盐酸L-苏-PDMP、150mg马铃薯淀粉、50mg轻质二氧化硅、10mg硬脂酸镁和765mg乳糖，将200mg这种混合物按比例分配并装入硬胶囊。片剂的制备实例
混合100ag盐酸L-苏-PDMP、670mg乳糖、150mg马铃薯淀粉、60mg结晶纤维素和50mg轻质二氧化硅，将30mg的羟丙基纤维素的甲醇溶液(10％重量的羟丙基纤维素)加入混合物中。捏合混合物并成粒。然后，将颗粒挤压通过0.8mm的筛而得到细颗粒。干燥颗粒后，加入15mg硬脂酸镁，每200mg的混合物成片。注射剂的制备实例
将丙二醇加入100mg盐酸L-苏-PDMP中使总量为10ml以溶解盐酸L-苏-PDMP。将此溶液灭菌及过滤后，每0.2ml/分装入安瓿中并封好安瓿。
在每个制备实施例中，将100mg盐酸L-赤-PDMP代替盐酸L-苏-PDMP以分别制备得胶囊、片剂和注射剂。
实施例6
脂质体的制备及体内动力学
如实施例3和4所示，L-苏-PDMP可作用于中枢神经系统组织(大脑皮层和大脑的海马)，因此其必须能透过血脑屏障并且通过静脉内给药提高大脑内的浓度。L-苏-PDMP是脂溶性物质，其在生理盐水中的溶解度最大为0.5mg/ml，因此当用表面活性剂增溶以使其可以静脉内给药后，其在到达靶器官前先被网状内皮组织摄取，这样其就不能在作用位点达到有效的药物作用浓度。
鉴于上述情况，本发明者研究了一种提高从血液转运至中枢神经组织(特别是大脑皮层和大脑的海马)的方法，随后发现可以通过如下试验将L-苏-PDMP混合到毫微球的脂质体中而解决上述问题。
即，将L-苏-PDMP混合到毫微球的脂质体中并将此混合物静脉内给予大鼠，可获得在大脑中显示药物作用的有效浓度。
(1)脂质体的制备
混合将含有缩醛磷脂酰胆碱的氯仿溶液(18μmol)、缩醛磷脂酰丝氨酸(3μmol)和胆甾醇(9μmol)及[14C]-L-苏-PDMP(0.5mg，5.5μCi)的氯仿∶甲醇(2∶1)溶液，浓缩混合物并在氮气流中于烧瓶内蒸发干燥。进入lml生理盐水，搅拌混合物，超声处理10分钟后通过膜滤器(CORNING一次性无菌注射过滤器，25mm，0.2μ，乙酸纤维素膜)而制备含有L-苏-PDMP的毫微球脂质体液体。制备毫微球脂质体的方法本身是已知方法(见Japan Medicine So-ciety，the 14th Annual Meeting，Summaries of Lectures 4，p.32，Sub-ject No.13—127(1994))。
(2)体内动力学
将上述(1)方法制备的[14C]-L-苏-PDMP的脂质体溶液(4.54μtCi)及0.5mg/ml[14C]-L-苏-PDMP的生理盐水溶液(4.54μtCi)分别从股动脉静脉内给予Wistar系雄性大鼠(10周大)30秒，在时间间隙收集血液。按照常规方法将L-苏-PDMP从血样定量(J.Lipid.Res.，vol.32，713—722，1991)。通过检测时间间隙血液浓度的变化，获得可以用典型二室模型分析的结果。利用简单的非线性最小平方方法程序MULTI，计算药学动力学参数。结果，在第一相消失的半衰期为2.56分钟(脂质体)和2.77分钟(生理盐水)，第二相为25.2分钟(脂质体)及27.5分钟(生理盐水)。
从上述结果可观察到血中药物浓度时间曲线下的面积(AUC；浓度曲线下的面积)由于脂质体的制备增加了略少于9倍，并且血中L-苏-PDMP残余性质由于脂质体的制备也提高。通过模拟确定的结果，当二室模型周边室的浓度为最大时，其为10分钟，这样估计大脑中的浓度在10分钟后也为最大。因此，在10分钟和60分钟(此时建立了室的平衡态)时测量大脑中的浓度及血液中的浓度。L-素-PDMP在大脑中的浓度也按照常规方法定量(J.Lipid.Res.，vol.32，713—722，1991)。结果示于表2中。
表2对大鼠静脉内给入L-苏-PDMP后血内浓度和脑
内浓度
脂质体 生理盐水溶液血内浓度 10分钟 60分钟 10分钟 60分钟(pmol/ml) 1789.1 170.5 451.2 118.0大脑浓度(μM) 25.7 1.0 2.5 未测血/脑浓度比 0.0144 0.0060 0.0056 未测
从表2结果看出，很明显由于制备脂质体，与给予生理盐水溶液相比，大脑中的浓度提高了约10倍。
利用给予脂质体的稳态(60分钟)大脑浓度/血浓度的比值进行周边室模拟连续静脉内注射，很明显其提高连续静脉内注射4小时可能达到稳态大脑浓度的1％限。
体外实验表明，通过以25μM的浓度在B16黑素瘤细胞(由神经外胚层获得)培养24小时、以40μM的浓度在鼠胎大脑皮层神经细胞培养物中培养8小时以及以5至20μM的浓度在鼠胎大脑皮层小块培养物中培养观察药物作用。将这些条件用于体内实验进行模拟。通过计算、模拟获得结果，所需达到的大脑预定稳态浓度的连续静脉内注射速率和液体量如表3所示。
表3
在脑中达到稳态浓度的连续静脉注的速度和液体量 在脑中的 连续静脉注射脂 脂质体的液体量 连续静脉注射生理盐水 生理盐水溶液的液体量 稳态浓度 质体的速度 (ml) 溶液的速度 (ml) (μM) (pmol/h) (ml/h) 4小时* 28小时 (pmol/h) ml/h 4小时** 28小时 50 177620.0 0.152 0.608 4.256 1672200.0 1.427 5.708 39.956 25 88810.0 0.076 0.304 2.128 836100.0 0.713 2.852 19.964 10 35524.0 0.030 0.120 0.840 334440.0 0.285 1.142 7.980 5 17762.0 0.015 0.060 0.420 167220.0 0.143 0.572 4.004*，**：在4小时在脑中达到不超过1％的稳态浓度
从上述模拟的结果看出，在生理盐水溶液中，如果在大脑中的稳态浓度为50μM，则液体量为39.956ml/28小时，如果在大脑中的稳态浓度为25μM，则液体量为19.964ml/28小时，因此可以看出连续静脉注射的液体量比大鼠的总体液量大得多。相反，在脂质体溶液中，如果在大脑中的稳态浓度为50μM，则液体量为4.256ml/28小时，如果在大脑中的稳态浓度为25μM，则液体量为2.218ml/28小时，因此可以说该液体施用量在生理可接受的液体量范围内。
从上述结果看出，很明显将L-苏-PDMP转化为脂质体，通过静脉内连续注射合适液体量即可对哺乳动物(包括人)显示出有效的药学作用。
(工业实用性)
本发明治疗神经元疾病的药剂通过提高神经细胞的内源性GSL，特别是神经节苷脂的生物合成而加速了轴突牵伸和突触形成，因此其可有效地治疗各种中枢神经系统和周围神经系统疾病。其对于各种期望通过再生神经纤维的中枢神经系统疾病有效，例如大脑卒中、脑梗塞、脑出血、脑损伤、记忆障碍、老年性痴呆、早老性痴呆、帕金森神经机能障碍等等。同样，其也对于各种周围神经系统疾病，例如由cacochymia、机械性神经病、毒性神经病引起的多神经病有效。
本发明治疗神经元疾病的药剂可以通过血脑屏障(J.LipidRes.，32，713—722(1991))，因此其作为注射剂或口服制剂对大脑神经元疾病是有效的。特别地，载有本发明治疗神经元疾病药剂的毫微球脂质体(脂质毫微球)不仅可以增加血药浓度而不被摄入网状内皮组织从而减少了所需药物作用的最小有效量，而且其与生理盐水溶液相比可以约10倍地通过血脑屏障，因此当本发明治疗神经元疾病的药剂用于治疗大脑神经元疾病时特别有效。