水凝胶微囊包封的疫苗 本发明是一种以水溶性聚合物或水凝胶为基础的具有微球构形的疫苗载体。
本发明是1993年7月12日提交的，名为“用作免疫佐剂的磷腈(Phosphazene)聚电解质”的U.S.S.N08/090841申请之后续申请。通过粘膜表面诱导的免疫反应
大部分病毒均利用粘膜表面作为感染的主要部位。视病毒而异，感染或者仅局限于粘膜表面，或者扩散形成全身性感染。形成局部感染病毒的典型实例是于呼吸道粘膜繁殖的流感病毒，副流感病毒和普通感冒病毒，以及在肠粘膜中复制的轮状病毒和诺瓦克因子。从粘膜扩散诱导全身性病毒感染的病毒实例有麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、A型肝炎及B型肝炎病毒、疱疹病毒。
在过去几年中，有关诱导粘膜免疫的情报大量增加。例如，在肠中，免疫反应局限于埋入肠粘膜中的集合淋巴结。这些位置的淋巴样组织暴露于肠腔(肠共生淋巴样组织(GALT))中，可使腔的成份按恒定量抽样。称之为支气管共生淋巴样组织(BALT)同样的淋巴样组织则位于呼吸道粘膜中。
目前，大部分病毒疫苗在注射其减毒活病毒制剂或灭活病毒制剂之后，能形成全身性保护免疫状态。此种疫苗的成功，在于接种者体内诱导出细胞介导免疫反应和/或体液免疫反应。该全身性免疫可通过在粘膜中减少病毒复制和避免病毒向重要靶器官扩散，从而预防疾病的发作。
注射疫苗已极大地降低了许多病毒疾患地发病率。然而，这些疫苗的使用却伴有某些不良反应。减毒活疫苗可引起全身性并发症，而灭活疫苗则可引起局部反应，甚至引起过敏症状。这些疫苗付反应的两个重要结果是其低顺应性和可争议性。前者导致免疫性降低及增加天然感染的比例，而后者则阻碍了目前新疫苗开发的发展。
代替使用注射疫苗的方法是口服抗原，特别是减毒活病毒。此种疫苗诱导很强的粘膜及全身性免疫力，该免疫力酷似野型病毒天然感染引起的免疫反应。此种免疫反应不仅消除了病毒的全身性扩散，而且也避免了粘膜中病毒的复制。因此由复制口服疫苗所引起的免疫反应，优于由注射活的或灭活疫苗所诱导的免疫反应。此种类型疫苗的最佳例子是减毒的口服活脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。但是，口服活病毒仅仅局限于通过胃尚能存活，且不容易回复到致病力的病毒。
迄今为止所开发的最有效非复制的抗病毒疫苗是灭活的病毒颗粒。肽和亚单元疫苗的功效在动物模型中取得了有限的成功，而目前尚无使用这些制剂的供人用的疫苗。早期的重组DNA工程研究中，许多团体满心期望不仅开发出保护性免疫，而且也解决由非传染性病毒抗原所引起的安全性问题。但是，人们不断清楚地看出，没有理由假定由实验室表达载体产生的、高纯度的、并注射入接种对象的病毒蛋白，将会在体内一致，即使该体内环境间接地近似于天然感染中所发现的抗原状况。到目前为止，成功的重组衍生疫苗仅有在真核(酵母)表达体系中合成的B型肝炎表面(HBS)抗原。
不断有大量证据证明，微粒态的非复制口服给予抗原既可诱导粘膜免疫也可诱导全身免疫，该免疫作用极为酷似天然感染所诱导的免疫作用。这与用非复制的可溶解抗原口服给药的免疫作用正好相反，该可溶解抗原不仅不能诱导全身免疫，而且通常诱导出全身耐受性。此外，与用同样抗原经肠道外免疫作用相比，引起所述免疫作用所需要的口服抗原剂量要低得多。上述微粒态疫苗制剂固有的主要优点是给药容易并十分安全。佐剂
现代分子生物学的出现提供了前所未有的以容易和精密方式生产免疫原的方法。但不能令人满意的是，这些新的方法虽能产生纯的免疫原，而这些免疫原在无有效佐剂存在时，一般均不能诱导出强的免疫反应。因此用于人的改进的疫苗佐剂的开发变成优先的研究领域。但有关佐剂的研究，却严重地滞后于有关免疫原的工作。几十年来广泛用于人的唯一佐剂是明矾。皂素及其纯化的成份Quil A，Freund氏完全佐剂以及其它用于研究和兽药应用中的佐剂均有毒性，限制了在人用疫苗中的应用。新的化学上限定的制剂，例如胞壁酰二肽和单磷酰脂A正在被研究中。
有关佐剂如何起作用的传统观点是，佐剂(例如矿物油乳剂或氢氧化铝)在注射部位形成抗原贮备，以使其慢慢释放。然而，三天之后注射部位消除，人们发现免疫反应的影响很小。近期的研究表明，借助细胞因子释放，通过刺激特异性的，有时候是很窄的免疫反应支路，佐剂便可提高免疫反应。正如A.C.Allison和N.E.Byar在“Vaccines：New Approaches to Immunological Problems”(R.W.Ellis，ed.，p.431，Bullerworth-Heinemann，Oxford，1992)一书中所作综述一样。人们期望得到一种能简单贮备抗原，并可在很长时间内释放出抗原的佐剂。
过去几年中，开发佐剂研究的领域是在疫苗制剂中应用合成的聚合物。Hunter，R.L.在题为Vaccine Adjuvant Research一书(D.R.Spriggs and W.C.Koff(Eds)，pp.89-98，CRC Press，1991)中介绍过非离子型嵌段共聚物表面活化剂，其分子量约低于10000，结构简单，它是由位于单嵌段疏水性聚氧化丙烯(POP)侧面的二嵌段亲水性聚氧化乙烯(POE)组成。它们被认为是毒性最小的表面活化剂，并广泛应用于食品、药物和化妆品中。某些大的疏水共聚物是有效的佐剂，但尚无紧密相关的制剂。这些共聚物的佐剂活性与POE及POP不同的链连接方式有关。目前这些佐剂用于油和水乳液中。
由Petrov等人在Sov.Med.Rev.Section D.Immunology，4：1-113(1992)中叙述了有不同分子量的各种聚电解质具有佐剂活性。带有正电荷或负电荷的大分子，显示出相似的免疫刺激活性。该聚电解质与抗原通过静电和疏水键形成复合物。另一方面，中性的和不带电荷的聚合物对免疫反应没有影响。药物和抗原的有控释放
开发可控释放疫苗目前引起极大的关注，因为时下可获得的几种疫苗的主要缺点是需反复给药。可控释放疫苗能避免多次加强免疫接种，这对于发展中国家来说特别有利，在这些国家医务人员和接种对象反复接触通常是很困难的。越来越有力的证据表明，存留于卵泡树突细胞外膜和淋巴节器官上的抗原，参与B记忆细胞的募集作用，形成抗体分泌细胞。循环抗体的连续释放暗示该募集作用连续发生。当抗体水平降低时，该募集作用使得充分产生抗体亲和力成熟的现象出现。确信抗原存留的概念对疫苗开发有重要意义。若能配制在很长时间内抗原均存在于免疫系统，特别是存在于卵泡树突细胞的疫苗，确实是非常有利的。
很多聚合物曾用于包裹抗原，以及其它蛋白质和化合物。早期的此种例子是由Kreuter，J.报道的，在直径小于1微米(1000毫微米)的甲基丙烯酸甲酯小球中的流感抗原的聚合作用，形成所谓毫微米颗粒(参见Microcapsules and Nanopaxticle in Medicine andPharmacology M.Donbrow(Ed)，p.125-148，CRC Press)。该抗体反应以及对于流感病毒感染的保护作用，明显地优于施用与氢氧化铝结合的抗原。用其它颗粒所作实验证明，这些聚合物的佐剂效果取决于颗粒大小及疏水性能强弱。
微囊包封法所用具体聚合物的选择由几个因素来决定。所有必需考虑的因素是：聚合物合成和微囊包封方法的可重复生产性、微囊包封法材料和工艺的成本、毒理学表现、释放动力学以及该聚合物与该抗原的物理化学相容性。
可生物降解的聚合物可以根据许多类型不稳定键之一来设计。这些例子是聚碳酸酯、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚原酸酯及聚酰胺。使用合成聚合物作微囊包封而不用天然存在的聚合物，其优点之一是在中性条件下，这些键的相对水解速度可由聚合物骨架上的取代基来调节。取代基改性作用还可用以改变聚合物的溶解性和亲水性/疏水性。
对于药物，以及近来对于抗原来说，通常选择的载体是聚(D.L-丙交酯共乙交酯)(PLGA)。通过认可的调节力使任何抗原输送体系保持相当大的阻力。聚合物PLGA是可生物降解，并且也是可生物相容的聚酯，许多年来，它被用作再吸收的缝合线，见Eldridge，J.H等人在Micxobiology and Immunology 1989，146：59-66中所作综述。抗原包裹在1-10微米直径的PLGA微球中表明具有佐剂效果。
PLGA体系的主要缺点是要使用有机溶剂，且抗原的微囊包封需很长的制备时间。该方法是利用油包水乳剂的相分离作用。将所研究的化合物配制成水溶液，而PLGA则溶解于适当的有机溶剂例如二氯甲烷和乙酸乙酯中。通过高速搅拌，将此两种不混溶溶液共乳化。然后加入不溶解聚合物的溶剂，这样，聚合物便围绕水溶液液滴沉淀出来形成初始微胶囊。收集该微胶囊，用聚电解质例如聚乙烯醇(PVA)、明胶、藻酸盐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或甲基纤维素使其稳定，或用真空干燥，或用溶剂提取来除去原来的溶剂。如J.H.Eldridge等人(参见Infection and Immunity 9：2978(1991))所证明的，如果上述制备条件对于各种肽类药物及较为坚固的免疫原，例如葡萄球菌肠毒素B和孔花青甙的微囊包封是成功的话，那么对于复合不稳定免疫原(例如包封的病毒)来说，使用PLGA包封需要高剪切力，需应用有机溶剂及所需很长制备时间，则是很严重的弊病。
因此，本发明的一个目的是提供经肠胃外或粘膜给予疫苗的微囊包封和输送的材料，它不需应用有机溶剂或不需很长的制备时间。
本发明的另一个目的是提供输送抗原到粘膜表面，特别是通过口服输送的体系。
本发明的又一目的是提供输送能引起广谱致免疫反应之抗原的输送体系。
本发明的再一个目的是提供输送能提高疫苗致免疫力的疫苗输送体系。
本发明的又一个目的是提供能可控释放抗原的可生物降解的输送体系。本发明概述
水溶性聚合物和聚合的水凝胶被用于微囊包封抗原，以便使输送至粘膜表面并在粘膜表面以可控方式释放抗原，或者包封注射用抗原(非肠道给药)。最优选的实施方案中，该微囊包封抗原经口服或经鼻腔内给药。聚合物可以是任何生物相容性的、可交联的水溶性聚合物或聚合的分子水凝胶，它们在温和条件下可用于形成直径200微米或更小的微颗粒，并且不会使与之结合的抗原变性。优选的天然水溶性聚合物包括藻酸盐，明胶、果胶及胶原；优选的合成水溶性聚合物包括聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙酸乙烯酯、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、磷腈聚电解质和聚乙烯醇；优选的通过离子交联形成水凝胶的聚合物包括聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的盐、磺化聚苯乙烯、聚胺或聚乙烯吡啶的鎓盐，以及这些聚合物或其单体的混合物或共聚物。最为优选的聚合物是藻酸盐、聚磷腈及其混合物。
为制备包封的抗原，将抗原与聚合物溶液混合，无需使用大量有机溶剂便很快形成聚合物和抗原的微粒，将聚合物进行离子型或共价型交联，便形成稳定的、可生物降解的微粒。这些微粒可粘附于粘膜表面，例如胃肠道粘膜内壁，在抗原的整个释放期间，提高了网状内皮组织对抗原的吸收。聚合物若是优选的藻酸盐或聚磷腈，最优选的交联方式是以多价离子或二价阳离子，例如氯化钙来进行离子型交联。
实施例证明，聚合物包封的抗原(这种抗原本身或其与粘膜刺激剂例如霍乱毒素的组合)提高了致免疫力。同时实施例也表明了怎样处理聚合物，使之经非肠道、口服或鼻腔内给药途径时能改变释放速度及体液反应。
有关附图的简要说明：
图1是聚磷腈(polyphosphazene)微球的渗透性图解，作为包封蛋白分子量和聚合物浓度的函数，以百分释放率表示。彩虹蛋白标示物被微囊包封于三种不同浓度的聚[二(羧基(carboxylato)苯氧基)磷腈共二(羧甲氨基(glycinato))磷腈](PP)中：3.3％(虚点长方框)，2.5％(斜线长方框)和1.5％(黑色长方框)，在上清液中的蛋白量进行分光光度测量之前，于室温下，在HEPES缓冲液(pH7.4)中保温24小时。
图2是聚磷腈微球的分子量对融蚀程度的影响，以按天数计其质量百分失去率表示：PC-GIP 130KDa(方形)、PCPP 3900KDa(菱形)、PC-GIP 170KDa(园形)和PCPP 400KDa(三角形)。
图3a和3b是具有不同初始分子量的磷腈的PCPP水凝胶，以天数计其分子量降解情况：Mw分子量，Mn数量平均分子量，初始Mw3900KDa(图3a)和Mw 400KDa(图3 b)。
图4是Mw 170KDa的PC-GIPP水凝胶以天数计其分子量降解的情况，并将基质中的聚合物分子量与溶液中聚合物的分子量进行比较。
图5是聚苯乙烯珠粒从用不同分子量的聚L-赖氨酸包衣的聚磷腈微球中的释放百分率：12000mw(方块)、62500mw(菱形)、140800mw(园形)和295000mw(三角形)。直径为20nm的萤光聚苯乙烯(PS)珠粒包封于聚合物1中，并用不同分子量的聚L-赖氨酸包衣。这些包衣的珠粒在HEPES缓冲液(pH7.4)中，于室温下保温。释放于上清液中的聚苯乙烯珠粒通过定量萤光测定法测定，并以初始包封珠粒的百分数表示。
图6a、6b和6c分别是以流感病毒悬浮液免疫(图6a)，以与霍乱毒素(CT)结合在藻酸盐微球中包封的流感病毒免疫(图6b)，和以藻酸盐微球中包封的流感病毒免疫(图6c)的动物血清中流感特异性反应，以第7、14、21和28天的抗体放价表示(从左至右为：IgM黑色长方块；IgG斜线长方框；IgA虚点长方框)。
图7是包封于藻酸盐中与CT结合的流感病毒口服给予后的流感特异性抗体反应，在免疫后第7、14、21、28和35天进行测量，IgM为黑色长方框；IgG为斜线长方框；IgA为虚点长方框。
图8是与CT结合的藻酸盐微囊包封的流感病毒经口服给予后并经口服加强剂量，其粪便样品中的流感特异性抗体反应，分别于加强剂量后第7、14、21、28和35天测量，IgM为黑色长方框；IgG为斜线长方框；IgA为虚点长方框。本发明的详细描述
一般来说，输送抗原的微球通过共价或离子交联水溶性聚合物或形成水凝胶的聚合物生成。优选实施方案中，该聚合物是例如藻酸盐或聚磷腈等水溶性聚合物，它们与二价阳离子(例如钙离子)进行离子型交联，形成包封抗原的水不溶性水凝胶。交联之前，抗原与聚合物溶液混合，以便保证抗原在形成微球过程中彻底分散。若用聚电解质(例如聚氨基酸)进一步交联该微球，则可形成更为稳定的微球。制造微球所用的聚合物
所述聚合物几乎可以是能在温和条件下形成直径10微米或更小的微球，并且不会使加入其中的抗原变性的任一生物降解的交联水溶性的聚合物或聚合的水凝胶。本文使用的水凝胶是指任何水溶胀的聚合物。水溶性聚合物是指在水中、水缓冲盐溶液中或醇水溶液中至少部分溶解(一般达到至少0.001％重量)的聚合物。优选的天然水溶性聚合物包括藻酸盐、明胶、果胶和胶原；优选的合成水溶性聚合物包括聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙酸乙烯酯、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、磷腈聚电解质和聚乙烯醇；优选通过离子交联形成水凝胶的聚合物，包括聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸、磺化的聚苯乙烯、聚胺或聚乙烯吡啶的鎓盐；以及上述聚合物或其单体的混合物和共聚物。最优选的聚合物是藻酸盐、聚磷腈及其混合物。
所述聚合物可进行离子交联、共价交联或物理交联，使水溶性聚合物变成水不溶性的。在室温下，将以水为基础的聚合物溶液通过离子交联而凝胶化，避免了需长时间受有机溶剂作用、需提高温度以及溶于有机溶液中的聚合物需干燥等弊病。可将聚合物在含有与其侧链基团电荷相反的多价离子的水溶液中进行交联，例如，假若该聚合物带有酸性侧基团，便用多价阳离子，若该聚合物带有碱性侧基团，则用多价阴离子。聚合物优选通过钙、铜、铝、镁、锶、钡、锡、锌及铁等二价或三价金属离子或通过聚氨基酸、聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、多糖以及其它可形成聚电解质复合物的多价阳离子来进行交联。藻酸盐类
最精心研究的可离子交联的聚合物是天然存在的藻酸盐，它是从用作食品的褐藻类制备的，例如Protanal LF20/60(Pronova，Inc.，Portsmouth，NH，USA)。
该聚合物用多价离子，优选使用氯化钙或其它二价或多价阳离子来进行交联。聚磷腈类(polyphosphazenes)
由H.R.Allcock和S.Kwon在Macro-molecules 22，75-79(1989)中阐明的一类可离子交联的水溶性聚磷腈，可生成包含抗原的微球，整个制备过程仅暴露于水溶液环境中。
本文所用术语“氨基酸”是指天然和合成的氨基酸，包括(但不限于)丙氨酰、缬氨酰、亮氨酰、异亮氨酰、脯氨酰、苯丙氨酰、色氨酰、蛋氨酰、甘氨酰、丝氨酰、苏氨酰、半胱氨酰、酪氨酰、天冬酰胺酰、谷氨酰胺酰、天冬氨酰、谷氨酰、赖氨酰、精氨酰和组氨酰。
术语“氨基酸酯”是指天然或合成氨基酸的脂肪族、芳香族或杂芳族羧酸的酯。
本文所用术语“烷基”是指饱和的直链、支链或环烃、或为其组合，一般为C1-C20，具体包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、庚基、辛基、壬基和癸基。
术语“(烷基或二烷基)氨基”是指分别带有一个或二个烷基取代基的氨基。
本文中所用术语“链烯基和炔基”是指分别带有至少一个双键或三键的C2-C20直链或支链的烃。
本文中所用术语“芳基”是指苯基或取代的苯基，其中取代基为卤素、烷基、烷氧基、烷硫基、卤代烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、亚甲二氧基、氰基低级烷基、-CO2H、-SO3H、-PO3H、-CO2烷基、酰氨基、氨基、烷氨基及二烷氨基，其中该芳基可以有至多3个取代基。
术语“脂肪族”一般指C1-C20的烃，可含有一个烷基，或为烷基、链烯基或链炔基的组合，它可以是直链，支链或环状的，或为其组合。
本文所用术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
术语“芳烷基”是指带有烷基取代基的芳基。
术语“烷芳基”是指带有芳基取代基的烷基，包括苄基、取代的苄基、苯乙基或取代苯乙基，其中所述取代基为上面所定义的芳基。
本文所用术语“杂芳基”或“杂芳”是指芳香环中包括至少一个硫、氧或氮原子的芳香基团，它可以任意按上述芳香基所定义的方式被取代。非限制性例子有呋喃基、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基(carbozolyl)、噁唑基、噻唑基、异噻唑基、1，2，4-噻二唑基、异噁唑基、吡咯基、吡唑基、喹唑啉基、哒嗪基、吡嗪基、噌啉基、2，3-二氮杂萘基、喹喔啉基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、蝶啶基、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基以及吡唑并嘧啶基。
术语“药物学可接受的离子”是指携带电荷，并可作为磷腈聚电解质的抗衡离子给药的有机或无机基团。
本文所用的术语“杂烷基”是指碳链或碳链末端中包含氧、硫或氮杂原子的烷基(由氢或氧使其价键饱和)。
本文所用的术语聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]、聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(羧甲氨基)磷腈-共-(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]、和聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(羧甲氨基)磷腈]是指同一聚合物。
优选的磷腈含带电荷侧基，或者以酸或碱的形式与其抗衡离子平衡，或者以其离子盐的形式存在。
优选的聚合物是可生物降解的，并且当其施用于动物(包括人)时表现出极小的毒性。磷腈聚电解质的选择
聚磷腈是骨架由交替的磷和氮原子组成，并交替以单键和双键隔开的聚合物。每个磷原子上共价键合两个侧基(R)。聚磷腈的重复单元有如下通式：其中n是整数。
取代基(R)在该聚合物中是可以在很广范围内改变的基团，包括(但不限于)脂肪基、芳基、芳烷基、烷芳基、羧酸、杂芳基、碳水化合物(包括葡萄糖)、杂烷基、卤素、(脂肪基)氨基-(包括烷氨基-)、杂芳烷基、二(脂肪基)氨基-(包括二烷氨基-)、芳氨基-、二芳氨基-、烷基芳基氨基-、-氧基芳基(包括，但不限于-氧基苯基CO2H、-氧基苯基SO3H、-氧基苯基羟基及-氧基苯基PO3H)、-氧基脂肪基(包括-氧基烷基)、-氧基(脂肪基)CO2H、-氧基(脂肪基)SO3H、-氧基(脂肪基)PO3H、和-氧基(脂肪基)羟基(包括-氧基(烷基)羟基)、-氧基烷芳基、-氧基芳烷基、-硫基芳基、-硫基脂肪基(包括-硫基烷基)、-硫基烷芳基、-硫基芳烷基、-NHC(O)O-(芳基或脂肪基)、-O-[(CH2)xO]y-CH2)xNH2、-O-[(CH2)xO]yCH2)xNH(CH2)xSO3H和-O-[(CH2)xO]y-(芳基或脂肪基)，其中x是1-8的整数，而y是1-20的整数。这些基团可以通过例如氧、硫、氮或碳等原子键合到磷原子上。
一般来说，聚磷腈有一种以上的侧基，这些基团在整个聚合物中可以没有规律的变化，因此该磷腈是无规共聚物。磷可键合两个同样的基团，或可键合两个不同的基团。将聚(二氯代磷腈)与所希望的一个或多个亲核试剂按所希望比例进行反应，可产生带两种或多种侧基的聚磷腈。聚磷腈中所生成的侧基的比例由许多因素决定，包括用于生成聚合物所用的初始原料的比例，亲核取代反应进行所用的温度，以及所用的溶剂体系。虽然所生成的聚合物中，基团的精确取代情况很难测定，但聚合物中基团的比例却很容易由本专业技术人员测定出。
在一个优选方案中，可生物降解的聚磷腈有下述通式：其中A和B在聚合物中可各自分别改变，它们可以是：
(i)在使用的条件下对水解敏感的基团，包括(但不限于)氯、氨基酸、氨基酸酯(通过氨基键合)、咪唑、甘油、葡糖基，或
(ii)在使用的条件下对水解不敏感的基团，包括(但不限于)脂肪基、芳基、芳烷基、烷芳基、羧酸、杂芳基、杂烷基、(脂肪基)氨基-(包括烷氨基-)、杂芳烷基、二(脂肪基)氨基-(包括二烷氨基-)、芳基氨基-、二芳基氨基-、烷基芳基氨基-、-氧基芳基(包括，但不限于-氧基苯基CO2H、-氧基苯基SO3H、-氧基苯基羟基和-氧基苯基PO3H )、-氧基脂肪基(包括-氧基烷基)、-氧基(脂肪基)CO2H、-氧基(脂肪基)SO3H、-氧基(脂肪基)PO3H、-氧基(脂肪基)羟基(包括氧基(烷基)羟基)、-氧基烷基芳基、-氧基芳基烷基、-硫基芳基、-硫基脂肪基(包括-硫基烷基)、-硫基烷芳基或-硫基芳烷基；
其中，聚合物含有至少1％或更多，优选10％或更多，更优选30-90％或更多，但少于100％的，在所用条件下对水解不敏感的重复单元；
其中n是4或更大的整数，优选10-20000。
应当注意，某些基团，例如除咪唑之外的杂芳基，在中性水溶液条件下，例如在血液中，以极慢的速度水解，因此在本文中一般将其当作非水解基团。然而在某些条件下，例如低pH值下(像胃中所发现的条件)，正常的非水解基团(如除咪唑之外的杂芳基)的水解速度，可以增加到能影响聚合物的生物降解性质的程度。本领域普通技术人员使用已知技术，可以很容易地确定在所用条件下，侧基是否能以相当大的速度水解。本领域普通技术人员，也能确定如本文所述不同结构之聚磷腈的水解速度，并能选择出为特定目的使用的，能提供所需生物降解特性的聚磷腈。
聚合物的水解降解程度，是对水解敏感的侧基的百分含量和可水解基团水解速度的函数，可水解基团若在水溶液环境中以羟基来代替，以提供P-OH键，该键则将其水解不稳定性传递给聚合物。
在另一实施方案中，该聚磷腈是：(i)非生物降解的聚磷腈，其中在所使用的条件下，在该聚合物中没有或者说实际上没有铡基是对水解敏感的，或(ii)完全可生物降解的聚磷腈，其中在所使用的条件下，所有基团均对水解敏感(例如聚[二(乙氧羰基甲基氨基)磷腈])。
磷腈聚电解质在本文中定义为含离子化的或者被离子化侧基的聚磷腈，这些侧基使得该聚磷腈为阴离子型，阳离子型或两性型。所述离子基团可以是盐的形式，或者要么是酸或碱，要么至少可以是能部分离解的。任何药物学上可接受的单价阳离子均可用作盐的抗衡离子，包括(但不限于)钠、钾和铵。磷腈聚电解质也可含非离子侧基。磷腈聚电解质在使用条件下可以是生物降解的或非生物降解的。离子化或被离子化的测基在使用条件下最好对水解不敏感。
优选的磷腈聚电解质含有包括羧酸、磺酸或羟基的侧基。虽然酸性基团在非水解型侧基中是常用的，但它们也可与水解基团结合，或者位于可水解基团上。一种带羧酸基团测链的磷腈聚电解质的例子以下述通式表示：其中n是整数，优选10-10000之间的整数。该聚合物的化学名为聚[二(羧基苯氧基)磷腈]，或者聚[双(羧基苯氧基)磷腈](PCPP)。
磷腈聚电解质优选可生物降解型。本文所用的术语“可生物降解”意指在所需应用中，于一适当的期限内，该聚合物可降解，于约25℃-37℃，一旦暴露于pH6-8的生理溶液中时，该期限一般为小于约5年，而最优选小于约1年。
最优选的聚合物是聚(有机磷腈)，它包含在使用条件下不水解的羧酸基侧基，并且它包含在使用条件下对水解敏感的侧基。优选的带有水解敏感基团的磷腈聚电解质实例是聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(氨基酸)磷腈-共(羧基苯氧基)(氨基酸)磷腈]，特别包括聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(羧甲氨基)磷腈-共-(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]，以及聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(氯代)磷腈-共-(羧基苯氧基)(氯代)磷腈]。
聚磷腈的毒性可使用本领域技术人员已知的细胞培养试验来测定。例如，聚[二(羧基苯氧基)磷腈]的毒性可用聚[二(羧基苯氧基)磷腈]涂覆细胞培养皿进行细胞培养来测定。将鸡胚胎成纤维细胞接种进涂覆的陪替氏培养皿中。接种鸡胚胎成纤维细胞三天之后，细胞变得扁平并形成纺锤状体。在相差显微镜下，观察到有丝分裂形象。上述试验提供了聚[二(羧基苯氧基)磷腈]对细胞复制无毒性的证据。
将磷腈聚电解质与多价金属阳离子，例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍或镉结合，便可制备交联聚磷腈。磷腈聚电解质的合成
聚磷腈(包括磷腈聚电解质)，可根据本领域技术人员已知的方法，使聚(二氯磷腈)与很宽范围内的化学试剂或试剂混合物进行大分子亲核取代反应来制备。优选通过聚(二氯磷腈)与能代替氯的一种或多种合适的亲核试剂反应制备磷腈聚电解质。聚合物中所期望的可水解侧链与非水解侧链之比例，可通过调节与聚(二氯磷腈)反应相应的亲核试剂的量及所需的反应条件来达到。
例如，将聚(二氯磷腈)的氯原子与对羟基苯甲酸丙酯和甘氨酸乙酯盐酸盐进行亲核取代反应(PC-GIPP合成法)，来制备聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈](PC-GIPP)。随后使获得的聚[(芳氧基)(羧甲氨基)磷腈]酯进行水解成相应的聚(羧酸)。其它聚磷腈可按下述各文献所载方法来制备：Allcock，H.R.；et al.，Inorg.Chem.11，2584(1972)；Allcock，H.R.；et al.，Macromolecules 16，715(1983)；Allcock，H.R.；et al.，Macromolecules 19，1508(1986)；Allcock，H.R.；et al.，Biomaterials 19，500(1988)；Allcock，H.R.；et al.，Macromolecules21，1980(1988)；Allcock，H.R.；et al.，Inorg.Chem.21(2)，515-521(1982)；Allcock，H.R.；et al.，Macromolecules 22：75-79(1989)；U.S.Patent Nos.4,440,921，4,495,174，4,880,622 toAllcock，H.R.；et al.，；U.S.Patent No.4,946,938 to Magill，etal.，U.S.Patent No.5,149,543 to Cohen et al.，and thepublication of Grolleman，et al.，J.Controlled Release 3,143(1986)，上述技术及各文献中所公开的聚合物均列入本文作为参考。抗原的选择
抗原可从细胞、细菌或病毒颗粒，或其部分中得到。正如本文所定义的，抗原可以是蛋白、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸或其结合物，抗原可在动物，例如哺乳动物、鸟类或鱼类等体内产生致免疫反应。正如本文所定义的，免疫反应可以是体液或细胞介导的。如果该致免疫反应欲针对的物质抗原极少，则可使用标准共价结合技术，使之与白蛋白或半抗原等载体结合，例如采用几种市售试剂药盒之一来进行。
在一个具体方案中，聚合物被用来输送编码抗原的核酸到该核酸表达的细胞中。
优选的抗原的实例包括病毒蛋白(例如流感蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白、流感嗜血杆菌、B型肝炎蛋白)和细菌蛋白以及脂多糖，例如格兰氏阴性细菌细胞壁和淋病奈瑟菌蛋白。
培养物中细胞的病毒感染产生两种病毒颗粒，即成熟的传染性病毒和某些缺乏核酸的非传染性类病毒颗粒。优选采用灭活的成熟病毒颗粒于口服疫苗中，在这些情况下，于细胞培养物中病毒复制达到高效价。对于不可能在细胞培养物中生长的病毒或致瘤病毒来说，人们可使用重组DNA技术生产非复制类病毒颗粒(VLPs)。使用重组技术，人们可以从某些病毒构建出显示其表面保护性抗原特性的类病毒颗粒(斑疹热病毒)，而这些病毒因其固有的复杂性，不能借助上述两种方法中任何一个方法来进行。上述所有抗原是病毒颗粒结构成份，然而，并不是所有能产生保护性免疫力的抗原均是结构抗原。在保护性抗原是非结构成份的情况下，人们便可以用遗传学手段将此种抗原融合入自装配类病毒颗粒的表面。佐剂
在某些实施方案中，可望包括供粘膜或非肠道输送的包封抗原的佐剂。口服给药的佐剂
已知口服微量霍乱毒素(CT)(霍乱毒素亚基A，或霍乱毒素亚基B，或二者)和第二种抗原的混合物，能刺激针对该协同作用抗原的粘膜免疫力。而且，针对第二种抗原存在极强的体液免疫反应，而不致出现口服输送单种抗原所产生的免疫耐受性。因此，粘膜输送的CT起到粘膜和体液免疫的强力免疫刺激剂或佐剂的作用。该佐剂作用的机理，可能是由于CT能与复盖集合淋巴结的穹窿细胞(或M细胞)特异性结合，并以有利于产生针对抗原(可能或一般不可能与穹窿细胞结合的抗原)的免疫反应的方式来改变淋巴样细胞的缘故。目前所知，该结合功能定位于霍乱毒素(CT-B)分子的非毒性B亚基处。业已证明，抗原中加入CT-B，将产生酷似由CT产生的针对同样抗原的免疫反应。因此，往往优选在微囊包封疫苗中加入CT来提高口服给予抗原的致免疫力。非肠道给药佐剂
此类佐剂的实例包括胞壁酰二肽，胞壁酰三肽，胞质分裂素、白喉毒素及外毒素A。市售佐剂包括Cambridge Biosciences，Worcester，MA生产的QS-21，以及Ribi Immonochem生产的单磷酰脂A(MPLA)。
本文中也证明，聚磷腈在口服或非肠道给药时也具有佐剂效果。特别是，几个实例证明，95％藻酸盐和5％聚磷腈(PCPP)所形成的微球能提高致免疫力。致免疫组合物的制备
例如使用Cohen等人的US专利5149543号，或Lim等人的US专利4352883号的方法(该两专利之技术列入本文作为参考)，或将聚合物和抗原的溶液进行喷雾干燥，可将聚合物用于包封抗原。此外，若将各成份在水溶液中简单混合，然后通过机械力使聚合物与其它物质凝结在一起形成微粒，由此也可制备含抗原和佐剂的微球。
本文所使用的术语“微胶囊”是指微粒、微球和微胶囊，除非另有说明。一般来说，所用微胶囊的直径在1-200微米之间，对于口服应用，优选1-15微米，虽然针头的大小是注射的限定因素，但对于注射应用，优选1-100微米。
在优选的实施方案中，首先于搅拌下将抗原溶解于1份3％Na2CO3中，接着将PCPP加入并搅拌，直至溶解，然后慢慢加入3份磷酸盐缓冲液(pH7.4)，由此制备聚磷腈/抗原溶液。将表面活性剂Brij58加入搅拌的聚合物溶液中，使其最终浓度为0.2％。而PCPP的最终浓度为2.5％。将适当量的抗原溶解于去离子水中，再慢慢于该抗原溶液中加入藻酸盐使藻酸盐的最终浓度为1.25％，由此制备藻酸钠/抗原溶液。需在恒速搅拌下，并慢慢将聚合物加入抗原中，以便获得均一的溶液。
在制备口服输送微球的最优选实施方案中，使用注射泵(速度150μl/min)将聚合物和抗原溶液抽入装配有18号规格钝端针头的喷雾嘴(Turbatak，Qttawa Canada)或超声喷嘴(Medsonic，Inc.，Farmingdale，NY)中产生微球。该针头能将溶液直接输送到喷嘴的喷雾点。然后在每平方英吋约35磅的空气压力下，将含分散抗原的聚合物溶液强制通过1.0mm的喷嘴孔。就聚磷腈来说，当其微滴冲击离喷嘴35cm远的7.5％CaCl2，0.5％Brij58浴时，该微滴即进行交联。加入Brij58是为避免微滴聚集。1.5％CaCl2浴(无Brij58)则用于藻酸盐微球的凝胶化。然后将该微滴很快转移到离心管中，并轻轻振荡约30分钟以便完成交联过程，且避免微球从CaCl2浴中沉降时聚集在一起。聚集作用可能是由于微球表面裸露的羧酸基之间的Ca++交联和/或微球间的疏水性相互作用的结果。30分钟以后，于4℃，2800rpm离心处理15分钟收集该微球。弃去上清液，将沉淀洗涤一次并再悬浮于无菌去离子水中。于4℃贮存该微球直至进行分析。于以上条件下生成的聚磷腈微球，约90％其直径为1-10微米。
采用较大的孔和较低的空气压力可制得较大的微球。聚合物-抗原结合
采用本领域技术人员已知的方法，可使聚合物与抗原共价结合，得到水溶性结合物，通常是使抗原上的氨基或羧基和聚合物上可离解的侧基之一共价连接。给予致免疫组合物
含抗原的水凝胶微球可通过粘膜或非肠道途径给药。输送到粘膜表面之途径的非限制性例子是鼻内(或一般是鼻共生淋巴样组织)、呼吸道、阴道和直肠给药。非肠道输送的非限制性例子包括皮内、皮下和肌内给药。
抗原既可包封于天然藻酸盐中，也可包封于合成聚磷腈中。所产生之免疫反应随加载的抗原水平、释放动力学和微球大小分布而改变。剂量则由加载的抗原和确定每种抗原剂量和给予每种抗原时间的标准技术来决定，而它们又是根据给予聚合物-抗原所产生的抗体效价而定，正如下面实施例所演示的一样。
本领域技术人员应了解，该致免疫疫苗组合物可以含有其它生理学上可接受的成分，例如水、盐水或DrakealTM、MarkolTM和角鲨烯之类的矿物油，结果形成乳液，或者与缓冲水溶液结合，或者包封于胶囊中，或者为肠溶包衣(使其在通过胃时保护该微胶囊不被降解)。致免疫组合物的贮存
离子交联的微球需贮存于缓冲液中，有利于保持其完善。保持该微球完善以及使抗原包封于聚合物基质中的条件已被限定，于4℃，在无菌去离子水中，含抗原微球贮存七天是稳定的。标准缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)不可使用，因为若其钠代替了钙离子，则导致基质液化。而用氨基酸聚合物，例如聚L-赖氨酸或其它交联剂包衣的微球则允许贮存于PBS中。
参考下述非限制性实施例，可进一步了解本发明。 实施例1
毒性研究
藻酸盐被批准用于人体。使用标准方法可试验证明聚磷腈无毒性。聚磷腈从前已被证明对活细胞无毒性。如M.C.Bano等人在Bio/Technology，9：468(1991)中所报道的，将杂交瘤细胞包封于直径150-200微米的聚磷腈微球中，该包封的杂交瘤细胞能进行细胞分裂，包封之后10天微球基本上充满了活细胞。其它研究于本文中介绍。
第一个试验中，用聚磷腈包涂细胞培养皿，然后将鸡胚胎成纤维细胞接种到该经涂覆的陪替氏培养皿中。接种鸡胚胎成纤维细胞后三天，细胞变得扁平并形成纺锤状，于相差显微镜下可观察到有丝分裂状况。这证明聚磷腈在细胞培养中是无害的。
在体内试验中，评价藻酸盐和聚磷腈对6-8周龄Sprague-Dawley大鼠的体内急性毒性。该试验分成四组，每组5只鼠。将其禁食过夜之后，采用管饲法，每组中各鼠得到一次口服5000mg聚合物/kg(于水中)的剂量，该剂量的体积是20ml/kg。其中第一组只给水作为对照组，第二组服藻酸盐微球，第三组服包涂聚L-赖氨酸(M.W.68000)的藻酸盐微球，而第四组服聚[二(羧基苯氧基)磷腈]微球。这些动物经临床观察7天。其体重在免疫接种前和安乐死时均按天记录。用CO2麻醉安乐死后，通过后眼窝房窦穿刺获得血液样品，动物取血前要禁食过夜。检查组织并留待验尸。
服用微球的大鼠和空白对照大鼠之间体重增加无明显区别。所有各组鼠的血液学和临床化学检测结果均正常。尸检中任何器官未观察到任何相关异常的迹象。该试验证明，口服5000mg/kg剂量聚磷腈和藻酸盐微球不会引起急性中毒。 实施例2
掺入蛋白及微球的释放特征
为使微囊包封的抗原产生免疫反应，抗原必需从微球中释放出来。抗原从微球中释放通过两种不同的，但并不相互排斥的过程，即扩散和融蚀。如果水凝胶对分散抗原来说是可渗透的，那么在水相充填微球基质之后，抗原便可很简单地从微球中扩散出来。因此，抗原的释放是微球基质对抗原渗透性的表征。相反地，如果抗原吸附聚合物基质，那么将会使抗原从微球中扩散出来的可能性减小或者消失。
释放动力学特征：将蛋白分子量标示物(Amercham)和FITC-标记的牛血清白蛋白(Sigma)进行微囊包封，以便研究溶解蛋白的释放动力学。20nm聚苯乙烯小珠(Duke Scientific)的释放动力学用作对照。
微球中蛋白的定量测定：为进行致免疫性研究，微球中的蛋白含量，既在微球生成之后直接测定评估其掺入百分比，也在临注入动物之前测定，以保证输入已知量的抗原。微球中的蛋白含量不能用标准方法(例如Bio-Rad蛋白质测定法)进行评估。虽然通过螯合对形成水凝胶起作用的Ca++可使蛋白从微球中释放出来，但加入含二价阳离子的Bio-Rad试剂会引起聚合物再交联，结果使抗原不能利用染色试剂。
离子交联的微球中包封的抗原蛋白，可通过以SDS-PAGE，对已知量完整的微球进行电泳来定量测定。电泳期间，蛋白从微球基质中移出并进入聚丙烯酰胺凝胶中。将其与同该微球制剂平行测定的已知量包封蛋白的电泳结果进行比较，便可确定该蛋白浓度。
微球大小的测定：1-15微米的微球被认为有佐剂效果，因此作为优选。使用Coulter LS 100颗粒大小测定器可测量藻酸盐和聚磷腈微球的大小。该大小被记为1-10微米球所占的百分数。
抗原从聚磷腈微球中释放的调整
聚合物浓度和抗原分子量的影响
将在聚丙烯酰胺凝胶电泳中通常使用的，分子量范围14000-200000Da的蛋白分子量标示物(RainbowTW蛋白分子标示物(Amersham Corporation))进行包封，以研究聚[二(羧基苯氧基)磷腈]的渗透性。用分光光度法测定上清液，检测蛋白的释放。
其结果示于图1。特定蛋白质，例如14.3KDa分子量的溶菌酶的渗透性受凝胶中聚合物浓度的影响。当聚合物浓度由1.5％升至3.3％时，从微囊基质中扩散出的蛋白则明显下降。同样，当蛋白分子量增加时，从基质中扩散出的蛋白也减慢。例如，200KDa分子量的肌红蛋白，在24小时内不能从3.3％聚磷腈基质中扩散出来。
聚合物分子量和组成的影响
通过融蚀组成微球的聚合物基质，抗原可从微球中释放出来为第二释放机理。通过凝胶化反应之逆反应则出现融蚀作用，导致聚合物分子增溶，并使其回到所处水溶液环境中。在盐水溶液(pH7.4)中，通过检测质量的减少，聚合物基质以分子量和可溶性产物的形成来研究聚磷腈微球的降解作用。不同分子量PCPP微球的融蚀情况示于图2。分子量高的PCPP微球在溶液中浸泡20天时仍未观察到可检测出的质量减少现象，而此时间期限还可延至180天。然而在同样长时间内，CTPC数据显示该聚合物分子量都大大降低(图3a)。降解机理明显地涉及分子内羧酸基的催化作用。使用低分子量PCPP作微球制剂在前10天内可导致水凝胶明显融蚀，并且降低聚合物分子量(图3b)。此时可检测出实际与基质中分子量相同的水溶性聚合物产物。
这些数据表明，该体系中聚磷腈从基质释放到溶液中的分子量极限值约为200KDa。但是，聚合物的溶解性还取决于该基质所拥有的钙离子(或其它多价阳离子或聚合物)量以及大分子的离解程度。所观察到的PCPP融蚀的差别对设计抗原输送体系来说极为重要。
通过引入适当铡基，可以有效地修饰各种聚磷腈，以得到一系列可控性质(包括水解降解性能)。引入对水解敏感的侧基，例如羧甲氨基，可增加其在水溶液环境中的降解速度。裂解氨基磷腈在中性介质中出现的外P-N键，可产生赋予聚合物水解不稳定性的羟基衍生物。
含10％羧甲氨基的聚[二(羧基苯氧基)磷腈共二(羧甲氨基)磷腈](PC-GIPP)被用于制备微球并进行降解试验。这些聚合物水凝胶的融蚀速度也取决于聚磷腈的分子量。重均分子量为130KDa的PC-GIPP在3天之内的质量损失为100％，如图2所示。GPC的基质和水溶性产物的分析示于图4，该图表明240天浸泡于水溶液中引起聚合物主键断裂，生成分子量低于1KDa的片断和无机磷酸盐。用聚-L-赖氨酸(M.W.62KDa)包衣水凝胶微球，得到的聚电解质复合物膜可极大地降低其融蚀速度(约2.5倍)，这明显地是因为空间位阻的原因，由此提供了另一个控制聚磷腈微球的降解和稳定性的方法。交联剂的影响
第三种调节抗原从微球中释放的方法，是以聚-L-赖氨酸或相似多离子包衣聚磷腈微球，使微球外表形成半渗透膜。然后可加入螯合剂(如EDTA，能逆转凝胶化过程)使微球核液化，并使聚磷腈基质增溶解。可通过在包衣过程中所用多离子的大小来调节渗透程度。用聚-L-赖氨酸交联，从分子量范围为12-295KDa的微球中的释放百分数示于图5。当聚-L-赖氨酸分子量增加，包衣物渗透性亦增加，结果使得20nm聚苯乙烯珠从微球中的释放也增加。
改变聚磷腈在微球中浓度，变化聚合物上侧链和用聚-L-赖氨酸包衣微球，能配制出以脉动和/或以持续释放动力学方式释放抗原的微球。配合凝胶化和形成微球的很温和条件，该聚合物体系的巧妙处置使得该聚合物体系成为开发能产生抗体和细胞免疫反应的单剂量疫苗特别合乎需要。
实施例3由体外和体内免疫反应试验所测量的给小鼠口服藻酸盐包封的流感病毒疫苗之效力
经口服途径将微囊包封的抗原给小鼠免疫接种。首先通过体外检测体液的免疫力来确定免疫反应动力学。使用体内试验，可测定影响抗体分类转换的能力、剂量的影响和加快、增强及延长免疫反应的免疫接种途径，以及是否需要加强激发该免疫反应。如下所述，将ELISA方法用来评估总抗原特异性反应以及IgG反应的亚类。CTL检测可用于评估细胞介导反应。
正如下面详细叙述的，将破伤风类毒素(ConnaughtLaboratories)和流感病毒包封用于致免疫性研究。按上面的介绍制备微囊包封的抗原并定量测定。由SDS-PAGE测定的藻酸盐和聚磷腈微球中的抗原浓度，在给药之前用灭菌去离子水调节。
将7-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成5组，用插管法口服给予30微克流感抗原。从CO2麻醉小鼠的后眼窝房窦抽取血样。于吸入室中以CO2将小鼠安乐处死。
由Novak等人(Vaceine 11：55-60(1992))所研究的鼠流感发病模式，可用以研究用微囊包封流感病毒接种所产生的保护作用。接种之后，于不同时间使鼠受病毒攻击，并测定各器官的病毒复制水平。虽然以前的研究证明，非肠道接种不完全保护鼻和气管，但它确实对肺部的病毒繁殖起完全的保护作用。因此，疫苗效果可根据肺部病毒复制的水平来评价。
根据标准方法，使流感病毒在鸡胚中生长，并由蛋白试验，血凝试验和空斑试验等方法定量测定。加入38％甲醛溶液至最终稀释度为1∶4000使流感病毒灭活。病毒的感染性也可通过暴露于60Co源1.2×106radγ射线来灭活。
以10μg/ml流感感染MDCK细胞溶胞物的碳酸钠缓冲液(pH9.6)涂覆96孔微滴平板，用ELISA法来测定鼠血清中抗流感病毒特异性抗体。涂覆和洗涤之后，蛋白非特异性结合的位点通过加入含2.5％BSA的PBS溶液来加以阻隔。阻隔和洗涤之后，以1％BSA/PBS进行二倍系列稀释的血清被加入到各孔中。洗掉未结合的血清，并加入辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG。洗除非结合的共轭物，加入底物0-亚苯基二胺二盐酸盐检测血清中抗体。加入2M H2SO4使反应停止，于490nm波长处读出吸光度。终点效价是最大样品稀释度的倒数，与相同稀释度的抗体阴性样品相比，所述最大稀释度能产生明显较大的信号。
通过检测与抗原相合的鼠抗体，可确定ELISA活性流感病毒特异性抗体的IgG同型。将鼠IgG亚类1、2a、2b和3特异性的辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠抗体，在ELISA平板中与结合抗原的鼠抗体反应。
用热失活的鼠血清(该血清与除去非特异性抑制因子的10％鸡血红细胞一起保温过30分钟)进行流感病毒凝血作用抑制抗体试验。将二倍稀释的血清加到96孔微滴平板中，每孔中加入相同体积的8HA单位病毒悬浮液，并于室温下保温30分钟。0.5％鸡血红细胞悬浮液加入到每孔中，并于室温下保温45-60分钟。HI效价以完全抑制红细胞凝血作用的最高稀释度之倒数表示。
第一组试验中，5组BALB/c小鼠(每组2只)以插管法分别进行如下各种口服接种试验：灭菌去离子水(第I组)、空白藻酸盐微球(第II组)、含30μg流感病毒的藻酸盐微球(第III组)、含30μg流感病毒加10μg霍乱毒素(CT)混合物的藻酸盐微球(第IV组)或30μg溶解流感病毒(第V组)。免疫接种后分别于第7、14、21和28天收集血液和粪便样品，测定流感病毒抗体反应性的分类特异性。
按上述方法，分别以包封于藻酸盐中的流感病毒抗原，仅有抗原或该抗原与霍乱毒素相结合三种方式给动物接种。
以藻酸盐包封的流感病毒抗原接种之结果示于图6a、6b和6c中。未得到流感病毒抗原的对照鼠(第I、第II组)表明无特异性血清IgM或IgG反应。溶解流感病毒(第V组)在第7天诱导出低的IgM效价，并持续至少14天，但检测不出IgG反应，如图6a所示。接种后14天，包封流感病毒及CT组诱导出高水平流感特异性IgG，如图6b所示。此种水平一直保持到第28天。只包封流感病毒的藻酸盐组诱导出的流感特异性IgG效价，与接种流感病毒-CT混合物微球的动物所观察到的水平相当，如图6c所示。良好抗体效价早在14天即能观察到，同时高效价IgG持续至少77天。
用藻酸盐包封的流感病毒加霍乱毒素免疫接种的动物，于初次接种后35天再加强接种。其结果示于图7。用流感病毒与霍乱毒素结合加强接种后，检测粪便样品发现有IgA产生。
扼要地说，藻酸盐包封的流感病毒，诱导血清中抗原特异性IgM和IgG不需要粘膜佐剂CT。藻酸盐包封的流感病毒所获得的结果表明，单剂量口服不存在CT的该疫苗产生强的流感病毒特异性血清IgG反应。图7的结果表明，用藻酸盐包封流感病毒与CT进行单剂量口服加强接种之后，诱导出IgA抗体。
实施例4用聚磷腈包封流感病毒疫苗给小鼠口服给药，对抗体产生进行体外和体内免疫反应的研究
按上面所述方式，用仅有流感病毒的聚磷腈微球包封，或用流感病毒与霍乱毒素结合的聚磷腈微球包封，对动物按同样方法免疫接种。
其结果示于图8。无霍乱毒素时，在血清或粪便中都未产生可检测出的抗流感病毒抗体。而流感病毒抗原和霍乱毒素结合，则产生IgM，其方式与藻酸盐包封抗原(图6b)的情况相似，尽管启动稍滞后一些。
实施例5用微囊包封的破伤风类毒素给小鼠鼻内免疫接种
将小鼠分成四组，分别按如下方式经鼻腔内接种：(1)破伤风类毒素于水中(9只动物)；(2)破伤风类毒素包封于藻酸盐微球中(9只动物)；(3)破伤风类毒素包封于PCPP微球中(10只动物)；(4)破伤风类毒素包封于含95％藻酸盐/5％PCPP的微球中(9只动物)。每例均给予50μg抗原。分别于2周(血清)和3周(支气管和鼻腔洗涤物)后用ELISA方法检测抗体之产生。其结果列于表1。
这些结果清楚地表明，鼻内施用聚磷腈包封的抗原或藻酸盐/聚磷腈包封的抗原微球均可诱导血清IgG反应。并且，该结果也证明，当抗原包封在藻酸和PCPP中时，该给药方法可用于产生IgA分子。
表1
用微囊包封的破伤风类毒素鼻腔内免疫接种组/动物编号 用抗-破伤风类毒
素处理的效价(log2) 1 破伤风内毒素 IgG IgA 2 破伤风内毒素 ＜256(＜8) 3 破伤风内毒素 ＜256(＜8) 4 破伤风内毒素 ＜256(＜8) 5 破伤风内毒素 ＜256(＜8) 6 破伤风内毒素 256(8) 7 破伤风内毒素 256(8) 8 破伤风内毒素 ＜256(＜8) 9 破伤风内毒素 ＜256(＜8) 10 藻酸盐微球包封的破伤风类毒素 ＜256(＜8) 11 藻酸盐微球包封的破伤风类毒素 ＜256(＜8) 12 藻酸盐微球包封的破伤风类毒素 ＜256(＜8) 13 藻酸盐微球包封的破伤风类毒素 ＜256(＜8) 14 藻酸盐微球包封的破伤风类毒素 ＜256(＜8) 15 藻酸盐微球包封的破伤风类毒素 ＜256(＜8)16 藻酸盐微球包封的破伤风类毒素 ＜256(＜8)17 藻酸盐微球包封的破伤风类毒素 ＜256(＜8)18 藻酸盐微球包封的破伤风类毒素 ＜256(＜8)19 PCPP微球包封的破伤风类毒素 512(9) ＜2(＜1)20 PCPP微球包封的破伤风类毒素 2048(11) ＜2(＜1)21 PCPP微球包封的破伤风类毒素 512(9) ＜2(＜1)22 PCPP微球包封的破伤风类毒素 512(9)23 PCPP微球包封的破伤风类毒素 2048(11)24 PCPP微球包封的破伤风类毒素 512(9)25 PCPP微球包封的破伤风类毒素 1024(10)26 PCPP微球包封的破伤风类毒素 1024(10)27 PCPP微球包封的破伤风类毒素 1024(10)28 PCPP微球包封的破伤风类毒素 512(9)29 藻酸盐/5％PCPP ms包封的破伤风类毒素 4096(12) 8(3)30 藻酸盐/5％PCPP ms包封的破伤风类毒素 4096(12) 32(5)91 藻酸盐/5％PCPP ms包封的破伤风类毒素 512(9) 8(3)32 藻酸盐/5％PCPP ms包封的破伤风类毒素 256(＜8)33 藻酸盐/5％PCPP ms包封的破伤风类毒素 2048(11)34 藻酸盐/5％PCPP ms包封的破伤风类毒素 2048(11)35 藻酸盐/5％PCPP ms包封的破伤风类毒素 2048(11)36 藻酸盐/5％PCPP ms包封的破伤风类毒素 2048(11)37 藻酸盐/5％PCPP ms包封的破伤风类毒素 1024(10)
实施例6以微球包封的破伤风类毒素给小鼠肠道外免疫接种，并与用一般佐剂接种进行比较
从传统来看，大多数注射用非复制疫苗要达到具有保护性的足够血清抗体需多剂量给药。很明显，以单剂量接种即能达到保护作用是更为期望的。
因此，聚磷腈对于抗原致免疫力的影响，用小鼠经皮下以单剂量免疫接种进行检测。在水、明矾和完全Freund氏佐剂中配制的抗原也包括在多个实验中作为参照物。
将配制在由藻酸盐或聚磷腈组成的聚合物微球中的破伤风类毒素抗原的致免疫力，与溶解的破伤风类毒素，以及在标准佐剂，明矾和完全Freund氏佐剂(CFA)中的破伤风类毒素之致免疫力进行比较。五组小鼠用20μg破伤风内毒素经皮下途径免疫接种。
其结果示于表2。用ELISA方法检测抗破伤风类毒素血清免疫反应。溶解的破伤风内毒素抗原和藻酸盐微囊包封的破伤风类毒素，到约13周诱导出最大效价512。含破伤风类毒素的聚磷腈微球，在接种后早期，与明矾或完全Freund氏佐剂破伤风类毒素相比较产生较高的抗体效价。而且含破伤风类毒素的聚磷腈微球，在接种后13周时，其诱导的抗体效价仍升高。在晚期，在聚磷腈微球中的包封破伤风类毒素产生效价为65536，这相当于溶解破伤风类毒素所观察到的反应强度的100倍，并且也与明矾和完全Freund氏佐剂同样好，或者还稍好些(2-4倍高)。就破伤风内毒素的抗体诱导作用而言，很清楚，聚磷腈微球优于藻酸盐微球。
表2
破伤风类毒素皮下接种小鼠体的ELISA效价 anti TT ELISA效价 3周 5周 7周 9周 13周在水中TT ＜256 256 256 256 512在藻酸盐微球中TT 256 512 512 512 512在明矾中TT 2048 8192 16384 32768 32768 CFA中TT 2048 16384 16384 32768 16384聚磷腈微球中TT 8192 16384 32768 32768 65536
用聚磷腈微球或完全Freund氏佐剂配制的不同剂量破伤风类毒素给小鼠接种，以检测破伤风类毒素免疫作用的剂量依赖性。
其结果示于表3。与完全Freund氏佐剂配制的破伤风类毒素相比，聚磷腈微球包封破伤风类毒素的致免疫力要好得多。在所有时间点和所有破伤风类毒素剂量，两种制剂的ELISA效价均相互以二倍稀释度进行。表3：破伤风类毒素经皮下接种小鼠的ELISA效价TT(μg)
抗-TT ELISA效价
TT＋聚磷腈 TT＋完全Freund氏佐剂
3周 5周 7周 9周 3周 5周 7周 9周25 32768 65536 131072 131072 16384 131072 262144 2621445 8192 32768 65536 655362.5 4096 16384 32768 163841 4096 16384 65536 65536 16384 32768 32768 327680.2 2048 4096 8192 8192 1024 4096 4096 40960.04 ＜256 ＜256 256 256 ＜256 ＜256 ＜256 ＜256
实施例7用聚合物微球或其它佐剂配制的流感病毒颗粒经肠外给小鼠免疫接种
用聚合物微球，明矾和完全Freund氏佐剂配制的5μg福尔马林灭活的流感病毒颗粒给小鼠接种，以测定包封病毒的这些制剂与破伤风类毒素的相对效力是否一样。
其结果示于表4。再次证明，聚磷腈微球诱导很高的抗流感免疫反应效价，其效力与完全Freund氏佐剂同，而远远高于水、明矾或藻酸盐微球之效力。与破伤风类毒素的结果相反，明矾佐剂流感病毒不优于溶解流感病毒，而藻酸盐微囊包封的流感病毒产生相当低的抗流感病毒反应效价。综合起来看，这些结果证明，含抗原的聚磷腈微球诱发的抗体反应等于完全Freund氏佐剂配制的抗原。
表4
用X-31流感病毒经皮下给小鼠接种后的ELISA效价
3周 5周 7周 9周 13周水中流感病毒 256 1024 1024 512 512藻酸盐微球中流感病毒 512 1024 2048 2048 2048明矾中流感病毒 ＜256 512 1024 2048 2048 CFA中流感病毒 8192 16384 32768 32768 16384聚磷腈微球中流感病毒 8192 32768 32768 8192 16384
通过血凝抑制作用与中和作用检测，试验小鼠血清中存在功能性抗体。凝血作用检测结果示于表5。如HAI检测所示，含流感病毒的聚磷腈微球产生的抗体效价到第7周时为1280，而Freund氏佐剂流感病毒，以及明矾及藻酸盐微球中流感病毒所产生的HAI效价或者检测不出，或者极低。
表5用X-31流感病毒接种的小鼠其凝血抑制作用检测效价
HAI效价
3周 5周 7周 9周 13周水中Flu 阴性 阴性 阴性 40 阴性藻酸盐微球中Flu 阴性 阴性 40 40 40明矾中Flu 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性CFA中Flu 阴性 阴性 阴性 40 阴性聚磷腈微球 中Flu 320 640 1280 1280 1280水* 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
*由于非特异性血清凝血抑制剂的影响，该阴性对照效价为20即阴≤20。
以50％空斑减小试验检测中和流感病毒感染性的抗体。到13周时，包封于聚磷腈微球中的流感病毒诱导出可检测的效价800，而于水和完全Freund氏佐剂中的流感病毒则未产生可检测量的抗体效价。该HAI及中和试验对流感病毒是敏感的功能性抗体检测法。因此，由聚磷腈微球产生的免疫反应优于完全Freund氏佐剂。 表6 流感病毒空斑减小试验
第13周聚磷腈微球中的流感病毒 800水中流感病毒 ＜200CFA中流感病毒 ＜200正常鼠血清 ＜200
采用ELISA试验测定由这些制剂所诱导的抗体IgG同型。其结果列于表7。正如所预期的。明矾佐剂流感病毒产生单纯的IgG1反应。配制存完全Freund氏佐剂中的流感病毒主要诱导IgG1反应，其峰值为第7周，而到第13周衰退。配制在藻酸盐和聚磷腈微球中的流感病毒也大量诱导IgG1反应，第7周时比配制在明矾中的流感病毒所产生的值更高。并再次证明，与完全Freund氏佐剂配制的抗原相比，聚磷腈微球配制的抗原诱导的效价更高得多。聚磷腈微球像完全Freund氏佐剂一样也能诱导显著水平的IgG2a和IgG2b抗体。在IgG3同型活性水平检测中，发现该免疫反应明显有差别。聚磷腈微球是能诱导明显IgG3抗体效价唯一的制剂。
表7：流感病毒ELISA同型检测结果 3周 7周 13周 IgG1 IgG2A IgG2B IgG3 IgG1 IgG2A IgG2B IgG3 IgG1 IgG2A IgG2B IgG3藻酸盐微球中Flu 1024 ＜256 256＜256 65536 1024 512＜256 8192 512 ＜256 ＜256PPP微球中Flu 8192 4096 512 512 131072 16384 1024 4096 16384 16384 2048 1024明矾中Flu 512 ＜256 ＜256＜256 16384＜256 ＜256＜256 8192 ＜256 ＜256 ＜256CFA中Flu 8192 1024 4096＜256＞52428 8192 4096＜256 32768 2048 2048 ＜256水中Flu 256 512 256＜256 2048 1024 256＜256 1024 512 ＜256 ＜256
显然，本发明仍有关聚合物佐剂及其合成方法以及在疫苗组合物的应用，熟悉本技术领域的专业人员可以根据上面详细的叙述进行修改和变化。此类修改和变化内容包括在所附权利要求书之范围内。