用于制备1-(4-氟苯基)-3(R)-[3(S)-羟基-3-(4-氟苯基)丙基] -4(S)-(4-羟苯基)-2-β丙内酰胺的立体选择性微生物还原反应 【发明背景】
1-(4-氟苯基)-3(R)-[3(S)-羟基-3-(4-氟苯基)丙基]-4(S)-(4-羟苯基)2-β丙内酰胺于1995年3月30日公开的WO95/08532中被公开作为降胆固醇剂。美国专利US5618707公开了一种在利用微生物拜列氏接合糖酵母或八孢裂殖糖酵母将β丙内酰胺制备成相应羟基中间体的过程中使用的酮基中间体(4-(4-氟-苯甲酰基)丁酸或其苯基噁唑烷酮(phenyloxazolidinone)缀合物)的立体选择性微生物还原反应。
发明概述
本发明涉及一种微生物还原羰基的方法，该方法包括利用向其中加入了酮化合物的培养基、培养基和缓冲液、培养基和溶剂、或培养基和缓冲液与溶剂的混合物中的微生物(从环境资源部门(environmental sources)和培养物保藏中心，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得)，以便形成、积累和分离一种含有所需立体化学特性的羟基化合物。
尤其是，本发明涉及一种将1-(4-氟苯基)-3(R)-[3-氧代-3-(4-氟苯基)丙基]-4(S)-(4-羟苯基)-2-β丙内酰胺立体选择性还原成1-(4-氟苯基)-3(R)-[3(S)-羟基3-(4-氟苯基)丙基]-4(S)-(4-羟苯基)2-β丙内酰胺的方法，该方法包括将1-(4-氟苯基)-3(R)-[3-氧代-3-(4-氟苯基)丙基]-4(S)-(4-羟苯基)-2-β丙内酰胺加到含有微生物的培养基、培养基和缓冲液、培养基和溶剂、或培养基和缓冲液与溶剂的混合物中，培养所得到的混合物，并分离1-(4-氟苯基)-3(R)-[3(S)-羟基3-(4-氟苯基)丙基]-4(S)-(4-羟苯基)-2-β丙内酰胺。
发现选自下列属中的微生物在本发明的还原反应中是有用的：曲霉属(Aspergillus)、弯孢属(Curvularia)、束孢霉属(Doratomyces)、地霉属(Geotrichum)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、糖酵母属(Saccharomyces)、Scytalidium、毕赤氏酵母属(Pichia)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、链孢霉属(Neurospora)和红球菌属(Rhodococcus)。上述属中的下列菌种是优选的：雪白曲霉(Aspergillusniveus)、新月弯孢(Curvularia lunata)、发网菌状孢霉(Doratomyces stemonitis)、白地霉(Geotrichum candidum)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、总状毛霉和卷枝毛霉(Mucor racemosus and circinelloides)、啤酒糖酵母和葡萄汁糖酵母(Saccharomyces cerevisiae and uvarum)、Scytalidium lignicola、Pichiamethanolitica、发酵有孢圆酵母(Torulaspora fermentati)和发酵有孢圆酵母属各种，粗糙链孢霉(Neurospora crassa)和红串红球菌、藤黄红球菌、紫红红球菌(Rhodococcus erythropolis，fascians，rhodoehrous)和红球菌属各种。
尤其是，本发明涉及一种微生物还原1-(4-氟苯基)-3(R)-[3-氧代-3-(4-氟苯基)丙基]-4(S)-(4-羟苯基)-2-β丙内酰胺(以下通式II)的羰基地方法，该方法包括将所述化合物加到含有微生物的培养基、培养基和缓冲液、培养基和溶剂、或培养基和缓冲液与溶剂的混合物中，尤其是其中所述微生物是藤黄红球菌ATCC No.202210或真菌分离物白地霉ATCC No.74487，培养所得到的混合物，并分离1-(4-氟苯基)-3(R)-[3(S)-羟基-3-(4-氟苯基)丙基]-4(S)-(4-羟苯基)-2-β丙内酰胺(以下通式I)。
所述微生物和真菌分离物的活培养物被保藏在美国典型培养物保藏中心，该中心位于10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，其中所述微生物的保藏号是ATCC 202210，而真菌分离物的保藏号是ATCC74487。在自培养物保藏之日起30年或对该保藏培养物最后请求后5年时间或该申请授权专利的有效期内，如果保藏的培养物丢失了、毁坏了或失活了，根据该申请的申请人或该申请受让人的请求，可以替换该培养物。在该申请悬而未决期间，按照37C.F.R.1.14和35U.S.C.122的规定，专利和商标委员会有权决定某人可以获得藤黄红球菌ATCC 202210和白地霉ATCC No.74487的继代培养物，并且一旦该申请被授予专利权，公众可以不受限制地得到所述的继代培养物。该微生物和真菌分离物的使用依据美国专利法。
详细说明
本发明涉及一种利用微生物进行下列立体特异性还原反应的方法。
通过向含微生物的培养基、培养基和缓冲液、培养基和溶剂、或培养基和缓冲液与溶剂的混合物中加入式II的酮底物来进行所述的微生物还原反应。进行培养的温度范围是大约20℃至大约40℃，优选30℃，并调节反应的初始pH值在大约5.0至9.0之间，优选地，pH是7.0。
反应中的化合物II的初始浓度可以在大约0.5g/l和大约10.0g/l之间变化，优选地是2-4.0g/l。
适合的发酵培养基、缓冲液和溶剂对于本技术领域的技术人员来说是已知的。发酵培养基通常含有碳源和氮源或其混合物，使用成分如酵母抽提物、营养肉汤、右旋糖(工业葡萄糖(Cerelose))、马铃薯糊精、大豆粉、蛋白胨和本技术领域中已知的其它组分。典型的缓冲液是磷酸盐缓冲液(例如，0.1M，PH7)，MES(2-[N-吗啉基]乙磺酸)、Bis-Tris(二[2-羟乙基]亚氨基三[羟甲基]-甲烷)、PIPES(1，4-哌嗪基-二乙磺酸)、HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪基-N’-[2-乙磺酸)、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)和MOPS(3-[N-吗啉基]丙-磺酸)缓冲液(例如，0.1M，PH7)。典型的溶剂是乙腈、丙酮、乙醚、异丙醇、叔-丁醇、异戊醇、对-二噁烷、异丙醚、二甲亚砜、叔-丁基甲醚(TBME)、甲苯、四氢呋喃和CH2Cl2。优选地，微生物还原反应在发酵培养基中进行。
手性还原反应时间的变化范围是大约18至大约96小时，优选地是大约48至72小时。
还原反应结束后，利用有机溶剂如乙酸乙酯(EtOAc)、叔-丁基甲醚(TBME)和二氯甲烷(CH2Cl2)等并通过已知方法提取式I的羟基化合物。本技术领域中已知的树脂吸附法、色谱法和其它物理方法也可被用来提取式I的羟基化合物。
为了确定微生物是否还原式II的酮化合物而对大量的微生物进行了调查研究。许多这种微生物不能提供理想的特异性或产率。
下面的实施例对本发明还原反应中微生物的评价和毫克量的式I羟基化合物的制备进行了说明。
实施例1
下文记载了鉴定式II化合物的立体选择性微生物还原反应的常规方法，所述式II化合物被用作生产式I化合物的合成前体。
酵母菌、丝状真菌和细菌的种子培养物分别在装有25ml或50ml的YPD(1％的酵母抽提物、2％的蛋白胨、2％的葡萄糖；PH5.5)、SIM6(3.5％的大豆粉、5％的土豆糊精、0.5％的工业葡萄糖、2ml/l的氯化钴、0.5％的碳酸钙；PH6.0)和NYC(0.8％的营养肉汤、2％的酵母抽提物、1.1％的工业葡萄糖；PH7.0)培养基的125ml或300ml的摇瓶中于30℃下搅拌(175-250rpm)培养72小时，然后接种(4％v/v)到摇瓶中进行发酵培养(25mlYPD/125ml摇瓶用于酵母和丝状真菌或25mlNYC/125ml摇瓶用于细菌)，所述发酵培养在30℃下搅拌(250rpm)进行。对于所有的发酵培养，接种前调节培养基PH，而在培养物繁殖和酮还原的过程中不需要控制PH。通过向生长了24小时的培养物中直接加入0.5-1.0g/l的溶于乙醇的式II酮化合物(25mg/ml)来启动还原反应。采用反相HPLC分析以EtOAc(1∶1)提取的与底物共同培养了48小时的发酵液样品。采用手性HPLC进一步分析培养物以便确定产物醇的构型，其中该培养物随着按照这一程序进行的重复发酵过程在没有发生明显底物降解的情况下而显示一致的还原活性。表1列出了能够在1.0g/l下还原式II的酮并以对映体高度过量的方式产生式I羟基化合物(S对映体)的培养物。
表1.能够在1.0g/l下选择性地还原化合物II的微生物培养物菌株#％EE，S/R％产率雪白曲霉12276 100S 7新月弯孢34477 100S 18总状毛霉7924 100S 4卷枝毛霉1207a 100S 9啤酒糖酵母Y-2034 100S 8葡萄汁糖酵母1061332634 100S 100S 11 7Pichia methanolitica58403 84S 24发酵有孢圆酵母20100 100S 5Torulaspora species66815 100S 14粗糙链孢霉14692 76S 4红串红球菌25544 100S 6藤黄红球菌202210 100S 46紫红红球菌999212432967029675 100S 100S 100S 100S 12 12 13 8Rhodococcus species1907119148 100S 100S 10 8白地霉74487 100S 25发网菌状孢霉SPR423 100S 11Scytalidium lignacolaSPR531 89S 30深黄被孢霉SPR875 57S 35
实施例2
下面记载了在高于实施例1中所用的浓度下通过能够还原化合物II的藤黄红球菌菌株ATCC No.202210或真菌分离物白地霉菌株ATCC No.74487来研究式II酮化合物的还原的发酵参数的普通方法。
利用藤黄红球菌菌株ATCC No.202210和白地霉菌株ATCC No.74487的种子培养物的繁殖和生物转化在装有25ml的NYC、YPD、SIM6或TGP(1％的Tastone 154、2％的甘油、1％的磷酸氢二钾；PH7.0)培养基的125ml的摇瓶中于30℃下搅拌(250rpm)进行24-72小时，然后接种(4％v/v)到装有25ml表2和表3所示的生物转化培养基的125ml摇瓶中。对于所有的发酵培养，接种前调节培养基PH，而在培养物繁殖和酮还原的过程中不需要控制PH。通过向生长了24-48小时的培养物中直接加入1-10g/l的溶于乙醇或二甲亚砜(DMSO)的式H酮化合物(25-50mg/ml)来启动还原反应。在利用细胞浓缩物的生物转化中，离心分离(8000rpm×10分钟)生长了24-48小时的培养物，并在加入酮之前重新悬浮在所示的新鲜培养基中。采用反相HPLC分析以EtOAc(1∶1)或TBME(1∶1)提取的与底物共同培养了48-96小时的发酵液样品的产率。采用手性HPLC进行分析以便确定以对映体高度过量的方式选择性地合成了S对映体产物(式I的化合物)。
表2藤黄红球菌菌株ATCC No.202210生产能力的生物转化率参数 种子繁殖条件： 30℃，250rpm 生物转化条件 (25ml培养基/125ml摇瓶， 250rpm) ％ 产率 25mlNYC/125ml摇瓶 24小时(4％v/v转种) 1g/l：YPD，30℃ 2g/l：YPD，30℃ 41 32 25mlYPD/125ml摇瓶 24小时(4％v/v转种) 1g/l：YPD，30℃ 2g/l：YPD，30℃ 50 42 25mlNYC/125ml摇瓶 72小时(4％v/v转种) 1g/l：NYC，25℃ 1g/l：NYC，30℃ 1g/l：YPD，30℃ 1g/l：NYC，35℃ 2g/l：NYC，25℃ 2g/l：NYC，30℃ 2g/l：YPD，30℃ 2g/l：NYC，35℃ 45 42 47 48 44 43 44 39 25mlTGP/125ml摇瓶 24小时(4％v/v转种) 1g/l：TGP，30℃ 2g/l：TGP，30℃ 4g/l：TGP，30℃ 10g/l：TGP，30℃ 69 64 28 11 25mlTGP/125ml摇瓶 24小时(4％v/v转种)4g/l：5X细胞浓缩物，TGP，30 ℃10g/l：5X细胞浓缩物，TGP，30 ℃ 68 31
生长24小时后所示的以1-10g/l的浓度加入的溶于乙醇的式II酮化合物(25-50mg/ml)。
表3 白地霉菌株ATCC No.74487生产能力的生物转化率参数 种子繁殖条件： 生物转化条件 (25ml培养基/125ml摇瓶) ％ 产率 25ml SIM-6/125ml摇瓶 30℃，250rpm 72小时(4％v/v转种) 2g/l：TGP，30℃ 4g/l：TGP，30℃ 10g/l：TGP，30℃ 2g/l：YPD，30℃ 2g/l：YPD，35℃ 2g/l：TNC，30℃ 2g/l：TNC，35℃ 2g/l：TN2C，30℃ 2g/l：TN2C，35℃ 18 9 6 33 39 38 45 54 46
生长24-48小时后，以2-10g/l的浓度加入的溶于DMSO的式II酮化合物(25-50mg/ml)。TNC培养基：1％的Tastonel54、2％的NZ-胺、3％的工业葡萄糖，PH5.5。TN2C培养基：具有6％工业葡萄糖的TNC培养基。
实施例3
采用表2和表3列出的条件以多级摇瓶发酵方式利用藤黄红球菌菌株ATCCNo.202210和真菌分离物白地霉菌株ATCC No.74487对式II酮化合物进行立体选择性还原反应来制备毫克量的式I羟基化合物。通过72-96小时的培养，在离心分离含有大部分的产物和残留底物的细胞之前收集每一种培养物的发酵液。利用TBME(10-20体积/湿重)提取细胞沉淀。将无水MgSO4加到TBME提取物中来除去残余的水，对该提取物进行过滤并通过蒸发浓缩滤液。
通过利用10-20 GF二氧化硅板(20cm×20cm×1000um)的制备型薄层层析技术对提取浓缩物进行纯化并利用EtOAc∶己烷(50∶50)的溶液进行展开。与所需产物共迁移的物质被从每一块二氧化硅板上刮下，收集并利用TBME从二氧化硅中洗脱出来，然后将TBME蒸发干燥。从每一培养物的生物转化过程中分离到大约170mg的由450-600mg的式II酮化合物衍生的产物。通过反相和手性HPLC、NMR和质谱分析证实了分离到的物质就是所需的式I羟基化合物。