本发明涉及蒽醌类作为甲烷产生菌产生甲烷的抑制剂的用途。 控制甲烷产生菌产生甲烷具有几个重要的农业和环境用途。人们早已认识到在家畜瘤胃中控制甲烷产生影响家畜产奶和产牛肉的效率。此外，人们已经增加了在环境方面控制作为主要温室气体的甲烷的兴趣。
微生物甲烷形成是一个严格的厌氧过程，该过程由通常称作甲烷产生菌的一组代谢独特的生物体完成。该组微生物包括：甲烷球菌属、甲烷细菌属、甲烷八迭球菌属、Methanobrevibacter、Methanothermus、Methanothrix、甲烷螺菌属（Methanospirillum）、Methanomicrobium、Methanococcoides、Methanogenium和Methanoplanus。这些细菌广泛地分布在严格的厌氧环境[包括反刍动物瘤胃、白蚁肠、垃圾填理物（Landfills）、污水池、厌氧消化器（anaerobic digestors）和稻田（rice paddies]中。其生长温度范围可以从嗜常温的温度直到非常嗜热的温度。
甲烷微生物极受生态学上的相互影响。并在很大程度上有赖于其它细菌的代谢以产生其生存所需的底物。发酵细菌通过将复合大分子例如纤维素或蛋白质转化成四种主要的甲烷产生底物（氢气、二氧化碳/乙酸和甲酸）来提供这些底物。然后，甲烷微生物消耗这些发酵终产物并将其转化成气态甲烷和二氧化碳。
有关这一类型的典型例子被称作“种间氢传递”，其中，产氢生物体为甲烷微生物产生氢气，然后，甲烷微生物消耗对氢产生体来说实际上为抑制性的氢气。这一点在自然食物链中被观察到，这里，前面的细菌将纤维素转化成包括乳酸（盐）（lactate）、乙酸（盐）（acetate）、脂肪酸、二氧化碳和氢气在内的各种产物，然后，甲烷微生物利产氢气和二氧化碳产生甲烷和水。
在硫酸盐丰富的海水或含盐水中，纤维素被硫酸盐还原菌（SRB）转化成二氧化碳和硫化氢。这些细菌具有与甲烷微生物平行的代谢作用并能利用氢气和硫酸盐产生硫化氢。在硫酸盐浓度低的污水处理设备和淡水泥塘中，SRB与甲烷微生物有共生关系，其中SRB从有机酸和醇产生氢气，甲烷微生物接着将氢气转化成甲烷和二氧化碳。
虽然在实验室里甲烷微生物一般生长在80%/20%（vol/vol）氢气/二氧化碳中，但在自然环境下甲烷微生物和SRB露置并生长在仅为痕量地氢气和二氧化碳中。氢气、二氧化碳和乙酸盐的居间水平可能很低，但甲烷微生物和还原硫酸盐的微生物能够生长在这些经糖、有机酸（例如，乳酸（盐）、脂肪酸）和醇发酵所释放出的底物上。
对甲烷生成抑制剂来说至少有两种重要用途，第一是瘤胃发酵的化学操作，因其在反刍动物例如奶牛和绵羊中导致微生物瘤胃代谢作用避开甲烷形成并朝着挥发性脂肪酸形成方向。甲烷代表着反刍动物损失总热量摄入损失5-10%，该能量转移给反刍动物用作营养物的挥发性脂肪酸会提高饲料转化成牛肉的效率。甲烷形成和挥发性脂肪酸、丙酸（盐）（Propionate）形成的反向关系已为许多研究者所证实，因而，人们预期甲烷抑制剂在瘤胃营养方面有积极的作用（C.J.Van Nevel，D.I.Demeyer，Manipulation of rumen fermentation In：The Rumen Microbial Ecosystem，P.N.Hobson.（ed） Elsevier Publishing Co.（1988）.）。
甲烷形成抑制作用的另一个重要应用是减少产生主要的温室（greenhouse）气体和环境污染物质。尽管甲烷成分仅占总的温室污染物的0.4%，但它对使地球大气层变暖的总的温室效应的贡献是18%，且其年增长率在1%数量级上。环境甲醇的一些主要来源是家畜、垃圾填埋物和稻米培植，它们构成总的甲烷散发物的40%以上并超过人类造成的甲烷散发物的60%。来源于稻米培植的甲烷散发物估计约占总的大气层中产生甲烷的20%，来源于垃圾填埋物的散发物约占该总散发物的7%。考虑动物产生甲烷时，家畜是主要导致最大量甲烷散发物的反刍动物。牛奶场奶牛每天可平均产生200升甲烷。仅美国牧群每年就产生超过5百万公吨的甲烷。因此，人类的农业和工业活动已成为向地球大气层散发的总的甲烷散发物的主要贡献者。
甲烷微生物以前已被开发过，主要是用作提高反刍动物效率的饲料添加剂。这些添加剂主要有两类，第一类是不直接影响甲烷形成的一类化合物。它们是通过在微生物食物链中甲烷微生物的上游位点干扰碳原子或电子流。第二类直接影响甲烷微生物。已知直接或间接抑制甲烷形成的化合物的例子是各种各样的，范围从普通阴离子如硝酸盐到ionopire抗生素。具体的例子包括：莫能菌素、拉沙里菌素、盐霉素、avoparcin、aridcin、actaplanin、青霉素、氯和溴甲烷类似物、长链脂肪酸、硫酸盐和硝酸盐。C.J.Van Nevel，D.I.Demeyer Manipulation of Rumen Fermentation，In：The Rumen Microbial Ecosystem，P.N.Hobson（ed）Elsevier Publishing Co.（1988）中引用的全表被并入本文作为参考资料。很明显这些化合物中的多数（如果不是全部的话）缺乏针对甲烷形成的专一性，并且其中某些表现出在动物瘤胃中的多种副作用。
许多基于声称在反刍动物中能直接或间接抑制甲烷形成的各种化合物的专利已被批准。然而，可以相信，这些专利中没有公开蒽醌类作为甲烷形成抑制剂的用途。
蒽醌类的生物学活性是多种多样的，这些化合物的用途包括：例如，用作抗微生物剂、蛋白水解酶抑制剂和用作轻泻剂。蒽醌植物提取物例如Cassia sp.的抗微生物活性早已被认识到。Cassia中的活性成分被确定为4，5-二羟基蒽醌-2-羧酸（Anchel.J.Biol.Chem.，177∶169-177（1949））。然而，已有的文献表明，蒽醌类的一般抗微生物作用对于细菌种类和被影响的过程似乎是偶然的和不可预测的。例如研究表明，某些革兰氏阳性菌例如杆菌或葡萄球菌对蒽醌敏感，但革兰氏阴性菌例如埃希杆菌属假单胞菌属却不敏感（Kavanaugh，J Bacteriol.，54∶761-767（1947））。然而其它研究表明，1，4，6，8-四羟基蒽醌不抑制所有杆菌菌株，并且在诺卡氏菌属（革兰氏阳性）中仅有四分之一的菌株受到影响。该化合物对大肠杆菌、假单胞菌属、沙门菌属或八迭球菌属没有明显作用（Anke et al.，Arch.Microbiol.，126：223-230（1980）;Anke et al.，Arch.Microbiol.，126∶231-236（1980））。1，8-二羟基蒽醌表现出抗枯草杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌活性，而1，2-二羟基蒽醌和1-氨基-4-羟基蒽醌通常无抗这些菌株的活性。蒽醌类芦荟泻素和大黄酸（Rhein）被发现对枯草杆菌和金黄色葡萄球菌是抑制性的。然后，相关的蒽醌大黄酚对这些菌株却不是抑制性的。被试蒽醌类中没有抑制假丝酵母属酵母菌的（Fuzellier et al.，Ann.Pharm.Fr.，39（4）313-318（1981））。二氨基蒽醌表现出对革兰氏阳性球菌而不是阴性细菌的毒性（Haranet al.，Isr.J.Med.Sci.，17（6）∶485-496（1981））。这些结果代表着偶然的和不可预测的蒽醌类的抗微生物活性。
瑞士专利No.614，466公开了已知带有取代基甲基、羟甲基、羧基、醛基或羧乙基基团的蒽醌在组织培养中和在期望真核细胞生长而不期望细菌生长的其它场合下抑制细菌生长。
1，3，6，8-四羟基蒽醌通过刺激碗状壁的肌神经接点产生轻泻作用已要求保护（US.5，039，707）。
蒽醌类也已表现出干扰细菌DNA代谢作用（Anke et al.，Arch.Microbiol.，126∶231-236（1980））;并抑制ADP转移到线粒体（Boos et al.，FEBS Lett.，127∶40-44（1981））。还原蒽醌与氧气产生毒性超氧化物的化学反应也可能是一重要的毒性机理（Shcherbanoviskii et al.，Rastit.Resur.，11（3）∶445-454（1975））。
虽然蒽醌类对特定酶系统的抑制作用被报导，但它们在植物中天然存在、它们在纺织上广泛用作瓮染料和它们直到现在还用作较泻药的事实证明它们完全没有毒性。蒽醌类，尤其是羟基化的蒽醌类的药用已减少，因为发现它们是弱的诱变剂。然而卤化的蒽醌不具诱变性（Brown et al.，Mutation Research，40∶203-224（1976））。
卷号为No.07/510，763的美国专利申请公开了大量蒽醌衍生物抑制来自厌氧性硫酸盐还原细菌的呼吸性硫酸盐还原作用。而且还说明，这些细菌内的其它生长方式不受影响，并且其它类型细菌如大肠杆菌和葡萄球菌属不受优选化合物的影响。优选的蒽醌类包括卤化的以及羟基化的衍生物。已证明这些化合物抑制所有实验室还原硫酸盐的细菌菌株以及来源于各种天然环境的天然还原硫酸盐富集物
（enrichments）产生硫化物。
总之，虽然已经表明蒽醌类具有多种相当特异的生物学性质，但这些化合物还不曾被暗示过用作甲烷产生过程的抑制剂。因此，将这些化合物用作甲烷产生菌产生甲烷的抑制剂满足了这种需要。最好是这些抑制作用一般是无毒的，并且能抑制甲烷产生而不明显被坏存在的微生物群落的天然平衡。
本发明提供了一种抑制甲烷产生菌产生甲烷的方法，该方法包括使含有甲烷产生菌的介质与蒽醌化合物接触。所说甲烷产生菌介质可以是一种包括，例如，其它产生氢气或产生乙酸（盐）的菌株的混合细菌培养物。较好的是，在细菌介质中氢气的存在量小于约5%体积，存在在介质中的蒽醌化合物的浓度直到约1mg/l。
通过加入蒽醌抑制甲烷产生菌产生甲烷的方法是有用的，例如，在地表下环境（如垃圾填埋物）中，稻田中和反刍动物瘤胃中减少甲烷产生，这一抑制作用提供了减少主要温室气体水平的方法。本发明还提供了在反刍动物中增加产生挥发性脂肪酸的方法，该方法包括给反刍动物饲喂蒽醌化合物。
下列术语被申请人用于本文全文中，并被用于权利要求的阐明。
“蒽醌化合物”一词被定义为包括含有以下所示的基本三环结构的蒽醌类化合物，并包括被直到四个简单的卤素、羧基、羟基或氨基取化基取代的蒽醌化合物。我们不包括以活性染料为例的四环或磺化的蒽醌类。
包括在本发明范围内的典型的化合物，例如，包括1，8-二羟基蒽醌、1-氨基蒽醌、1-氯基蒽醌、2-氯基蒽醌、2-氯-3-羧基蒽醌、1-羧基蒽醌和蒽醌。
“甲烷产生菌”指具有产生甲烷能力的细菌，包括但不限于甲烷球菌属、产甲烷细菌属、甲烷八迭球菌属、Methanobrevibacter、Methanothermus、Methanothrix、甲烷螺菌属、Methanomicrobium、Methanococcoides、Methanogenium
“厌氧消化器”指用于例如将城市垃圾厌氧转化为甲烷和二氧化碳的装置。参见，Renand，P.Dochain，D.，Bostin，G.，Naveau，H.，Nyns，B-J.，"Adaptive Control of Anaerobic Digestion Processes：A Pilot Scale Application"，Biotechnol.Bioeng.，31∶287∶294（1988），该文献一并作为本文的参考资料。
“厌氧消化物”指例如从城市垃圾处理设备（如本文所提到的，座落在Wilmington，DE，）获得的物质，并且包括可代谢的有机物以及微生物例如发酵梭菌（Clostridia）、甲烷产生菌和硫酸盐还原菌。参见，例如，"Anaerobic Treatment Technology for Muniupal.and Industrial Wastenater"，M.S.Switzenbaum（Ed.），In：Water Science and Technology，Vol.24，No.8 1991）。
本文使用的“甲烷产生菌介质”一词指允许甲烷产生菌生长的任何介质。具体例子包括限定性实验室培养物，还有其它允许甲烷产生菌生长的人造或天然存在的介质，例如，在城市垃圾处理消化器中见到的厌氧消化物、垃圾填埋物、稻田、反刍动物瘤胃、污浊的淡水和海水池塘或其它天然的或人造的厌氧环境。
“反刍动物”是那些从将纤维素转化成挥发性脂肪酸获得营养物的动物。这一过程发生在消化系统的被称作瘤胃的特异区域。参见，例如，C.J.Van Nevel，D.I.Demeyer，"Manipulation of Rumen Fermentation"，The Rumen Microbial Ecosystem，P.N.Hobson.（ed）Elsevier Publishing Co.（1988）。
本发明的一个实施方案涉及在氢气的存在量稳定在小于5%体积的条件下，以单一的或者是混合的培养物形式将甲烷产生菌介质与蒽醌化合物类接触。在此情况下可见与没有蒽醌类培养物相比，甲烷产生水平明显降低。含有实验室甲烷微生物菌株和产氢生物体和限定性二元细菌群体的构成也产生所期望的条件。从天然来源（例如厌氧消化器）获得的甲烷微生物混合培养物富集物也产生所期望的条件。从厌氧消化器或瘤胃源来源的甲烷微生物富集物在微生物构成上极其接近这些生态系统。
甲烷微生物的纯培养物可以很容易地从任何国际上认可的生物保藏单位（例如American Type Culture Collection，Rockville，Margland，USA（ATTC））获得。甲烷微生物纯菌株的一个例子是M.formicicum，相应的ATCC保藏号是33274。
厌氧消化物的典型的样品可以从使用厌氧消化器的废物处理厂获得，甲烷微生物通常在实验室以纯培养物形式借助生长在支持性培养基中培养，该培养是在有乙酸钠的氩气和氮气的条件下在含有比例为80%/20%vol/vol的氢气/二氧化碳的气相中进行的。这一生长条件不接近大多数自然条件，但产生最大的生长率和最大的细胞密度。保持在这一高水平的氢气下的快速生长培养物的样品后来可移置到新鲜培养基中并测试在各种氢浓度下的生长情况。已经发现，要使蒽醌为一有效的甲抑制剂，所说培养物必须在相当于自然条件下所见的氢气的低浓度（少于5%）下生长。
用本领域公知的标准方法测定从单一的或混合的培养物中产生的氢气和甲烷的浓度。其中优选的是使用Porapak Q柱、具有热导检测的氩气载气的气相色谱。其它测量氢气和甲烷的合适方法描述在Tadesse et al in J.Chromatogr.，171，416，（1979）和Heidt et al in J.Chromatogr.，69（1），103，（1972）中。
本发明的蒽醌类化合物不同于大量蒽醌衍生的抗生素（典型的是亚德里亚霉素），例如，其蒽醌是很大的全部结构的一部分。构成本发明的蒽醌类包括如下所示的基本三环结构，也还可以被直到约4个简单的卤素、羧基、羟基或氨基衍生物取代基所额外取代。有效化合物的典型例子见表12。
通常，蒽醌类不很活泼，但可进行可逆的氧化-还原反应。
本申请中优选的蒽醌类包括：9，10-二氢蒽醌、1-氨基蒽醌、1-氯蒽醌、2-氯蒽醌、2-氯-3-羧基蒽醌、1-羧基蒽醌和末取代的蒽醌。其中末取代的蒽醌是最优选的。被看作是有效抑制剂的蒽醌类均是容易获得的商业化学品，除了在合适的介质中溶解外不需要任何其它的特殊制备过程。
有几种制备加入到培养物中的蒽醌类的可接受的方法，最终分散的微粒可以用于将蒽醌移入到细菌生长介质中以抑制甲烷产生过程。某些蒽醌也可以溶解并以液体形式加入。水可用于制备含水悬浊液或溶液，这些悬浊液和溶液是本发明体内应用最优选的。然而，有机溶剂例如，乙醇、甲醇、二甲亚砜和丙酮也可使用。这些溶剂对体外和实验室应用的实验方便性来说是最优选的。所有这些有机溶剂中，丙酮是最优选的。一旦溶解在合适的溶剂中，蒽醌就可直接加入到甲烷产生菌介质中。
蒽醌类的有效终浓度范围为1-5ppm（wt/vol＝mg/l）。业已发现一些蒽醌类被存在于厌氧消化器中的细菌所降解，因而，为了保持蒽醌类的浓度在1-5ppm范围内，重复使用这些化合物是必要的。
家养动物，尤其是反刍动物例如牛和羊的饲料利用效率在农场业中有经济上的重要性。已经知道有时那些在反刍动物中抑制甲烷生成作用的化合物也在饲料利用上起重要作用。
作为一种寻找增加反刍动物饲料效率的方法的辅助手段，广泛研究了反刍动物消化和降解食物特别是碳水化合物的生物化学机制。已知碳水化合物在瘤胃中降解为单糖，单糖转化成丙酮酸盐（或酯），然后转化成乙酸盐（acetates）和丙酸盐（propionates）。研究表明，某些瘤胃微生物发酵复合碳水化合物的单糖成甲酸、乙酸、丁酸和琥珀酸，并伴随产生二氧化碳和氢气。在发酵过程中产生二氧化碳和氢气用于借助甲烷产生菌的活性形成甲烷这些统称为挥发性脂肪酸（或VTFA′s）的乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐均被反刍动物用作能源。然而，丙酮酸盐向乙酸盐的转化涉及链中减少一个碳原子这一碳原子在形成二氧化碳中损失掉，二氧化碳不可逆地转化成甲烷气体。因为丙酸的产生不产生碳原子的损失，也不形成二氧化碳，所以在反刍动物的瘤胃中从碳水化合物产生丙酸盐是一条比产生乙酸盐和丁酸盐更有能量效率的降解途径。
结果是，为使瘤胃中VTFA比率移向增加瘤胃中丙酸盐所进行的处理导致对给定量的食物消耗来说对反刍动物生长的有益效果。相应地，通过改进瘤胃发酵的效率，将会发生相应的生长率的增加和/或该动物饲料利用效率的增加（参见US 4876367）。
例如，通过在瘤胃中增加丙酸对乙酸的摩尔比率或增加总的挥发性脂肪酸浓度（即，乙酸、丙酸和丁酸的总量）能较好地改进饲料利用率和/或增长率。在类似情形下，也已知在瘤胃中抑制甲烷形成过程经逸出和移向产生更多生长所需的脂肪酸（特别是丙酸和丁酸）导致甲烷气损失的明显减少。参见美国专利US 3，745，221;3，615，649和3，862，333。
因此，本发明的另一个目的是提供在反刍动物中抑制甲烷产生并带来挥发性脂肪酸增加和饲料利用效率增加的有益效果的化合物和方法。当与天然的瘤胃细菌培养物接触时，可见本发明的蒽醌类降低甲烷的产生水平和使挥发性脂肪酸产生移向合意的丙酸盐。
在一个优选的实施方案中，从造瘘的小公牛中取出瘤胃（runimal）液体，从而获得微生物的代表性种群。一般，瘤胃液体经干酪布（cheesecloth）过滤，收集流出物。被干酪布滞留的颗粒状物质重新悬浮在生理缓冲液中，流出物再过滤。Cheng et al.，J.Dairg Sci.38，1225（1955）描述了适用于细胞分离的缓冲液。流出物置于池中，使其静置直到颗粒状物质离开顶端，然后澄清层用相同的缓冲液稀释，调节PH至7.0，用于接种。
测定挥发性脂肪酸的方法是本领域公知的。通常，色谱方法例如HPLC或用火焰电离子检测的气相色谱是优选的。适用于本发明的方法被Ien et al.，在J.Chromatogr.，629（2），394，（1993）和Nakamachi et al.，在Kogyo Yosui，（391），36，（1991）中描述。
如上所提到的，有几种已知的在反刍动物中提高所需挥发性脂肪酸产量的可购得的化合物，最著名的是莫能菌素和2，2-二氯乙酰胺（参见美国专利U.S.3，839，557）。为试验蒽醌类对所需挥发性脂肪酸产量的有效作用，在分析脂肪酸产量的实验中使用这些化合物作阳性对照。
瘤胃的化学和微生物学是复杂的，被多种因素所影响，这不仅仅是纤维饮食摄入的问题。所需挥发性脂肪酸产量很大程度上取决于合适的瘤胃微生物（ruminal microorganisms）的存在，后者又受饮食摄入成分的影响。已观察到，例如当绵羊饲喂含玉米和糖蜜的粗饲料时，与饲喂苜蓿干草相比，反刍动物微生物种群变化很大（Mackie，J.Agric、Sci.，103（1），37，（1984）。考虑到改变饮食可能会影响甲烷产生和VTFA产生，给造瘘的小公牛饲喂苜蓿干草或含有50%苜蓿和50%磨过的玉米粉的50∶50草料浓缩饲料。在两种饮食条件下可见甲烷产生受到相同的很好的抑制，然而，所需VTFA产量仅在用50∶50草料浓缩饲料饲喂的小公牛中有明显增加。
如本领域所公知的，氨型氮的释放是解朊作用的量度，当用于瘤胃内含物时，是消化率的间接量度。在分析VTFA产量期间，氨型氮的释放用如Searcy等人在Clinica chem.Acta.12，170（1965）中所描述的包含苯酚次氯酸盐并在630nm波长读数的改进的比色试验跟踪。
为了在本领域成为有效的饲料添加剂，活性化合物必须不仅能提高所需挥发性脂肪酸产量和抑制甲烷产生，还仍对纤维消化无抑制作用。为确定本申请的蒽醌类是否在干扰消化过程上有任何作用，通过测定酸净化纤维质（ADF）的消化率测定了在造瘘动物中的消化率。
ADF分析的常规方法一般是基于制备的ADF样品，以便用化学降解（“Crude fibre”，Official Methods of AOAC，1975，136），或用润湿剂处理（“necutral detergent fiber/acid deterget fiber”，Van Soest and Wlie，J.AOAC，1967，50，50）或用酶降解（Weinstock and Benham，J.Cereal Chem.，1951，28，490;Hellendoon et al.，J.Sci，Food Agric.，1975，26，1461）使其它成分溶解。
然后使用将样品通过玻璃滤器的过滤分离食用纤维质。使用酸净化纤维质测定消化率的方法是本领域公知的（参见，例如，Goering et al.，Forage Fiber Analysis.Agriculture Handbook ＃3，（1970），Agriculture Research Service，USDA，Washington，DC.）。
下列非限制性实施例用来说明本发明的几个重要方面。因为甲烷微生物在厌氧消化器淤泥中和奶牛瘤胃中以高水平存在，这两个明显的生态系统被选来说明蒽醌在这些系统中对甲烷产生的作用。此外，研究了包括有特征的甲烷微生物在内的细菌限定性混合培养物。也了解了蒽醌对其它非甲烷产生反应（包括葡萄糖发酵成氢气和乳酸发酵成氢气）的影响的特征。还研究了甲烷微生物转化葡萄糖成甲烷和转化氢和二氧化碳或乙酸盐成甲烷的情况。
实施例1
方法和生长条件
下列组成的限定性无机培养基用作基本培养基，依据所需的生长条件向其中入碳源和电子供体和电子受体。这一基本培养基被指定为培养基BTZ-3并在表2中定义。
表 2
BTZ-3生长培养基
组份 浓度
氯化铵 4.3g/l
磷酸二氢钾 0.5g/l
氯化镁六水合物 0.20g/l
氯化钙二水合物 0.10g/l
HEPES缓冲液(1.0M) 50.0ml
"溶液1" 10.0ml
0.2%刃天青 1.0ml
去离子水 900ml
“溶液1”的组成在表3中给出，（HEPES是N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-ethonesulfonic acid]，刃天青用作氧化还原指示剂且不是该培养基的必需的部分。）
表 3
“溶液1”
组份 浓度
次氮基三乙酸 12.8g/l
氯化铁四水合物 0.3g/l
氯化铜二水合物 0.025g/l
氯化镁四水合物 0.1g/l
氯化钴 0.32g/l
氯化锌 0.1g/l
硼酸 0.01g/l
钼酸钠 0.01g/l
氯化镍 0.148g/l
去离子水 1000ml
用 1M NaOH 调 PH 至 7.0
为制备BTZ-3培养基，表2的组分在一个园底烧瓶中混合并在氩气下煮沸。然后在氩气下向热的培养基中加入40ml还原培养基。所说还原剂由0.2N NaOH（1.6g在200ml水中）与硫化钠非水合物（2.5g/200ml）和半胱氨酸氢氯化物（2.5g/200ml）组成。加入20滴1M HCl将PH调至PH6.8-7.0。然后培养基分配到生长管或瓶中，在生长容器和培养基中继续通氩气，然后培养基在115℃下高压灭菌20分钟。
还原剂经在氩气下煮沸（0.2N）NaOH、接着冷却并加入硫化钠而制备。在硫化钠溶解后，加入半胱氨酸氢氧化物并使其溶解。然后，还原剂在氩气下分配成每管10ml，并在115℃下高压灭菌20分钟。
这里应注意，BTZ-3的修饰被用到，它常常含有下例一种或多种成分：乙酸钠、乳酸钠、酵母提取物（Difco Laboratories）、氢气/二氧化碳气相。除了2-氯蒽醌和3-羧基蒽醌以20mM水溶液加入外，所有蒽醌类均以1000ppm的丙酮溶液加入。
实施例2
厌氧消化器富集物研究
这一实施例说明蒽醌类（AQ）、1，8-二羟基蒽醌、9，10-二氢蒽醌和2-氯蒽醌在厌氧消化器淤泥中在厌氧分解乳酸盐（A栏）或葡萄糖（B栏）成甲烷的发酵和甲烷生成阶段的作用。这一实施例研究消化作用的下列阶段：
1.葡萄糖发酵成氢气、乙酸盐和二氧化碳。
2.乳酸盐发酵成氢气、乙酸盐和二氧化碳。
3.葡萄糖发酵成氢气、乙酸盐和二氧化碳和甲烷。
4.乳酸盐发酵成氢气、乙酸盐和二氧化碳和甲烷。
从Wilmington，DE废物处理厂获得厌氧消化淤泥，并在葡萄糖或乳酸盐改进培养基上富集，供后续实验使用。所有的培养基用0.05%酵母提取物改进。在24小时预培养期后，10%预培养的接种物转移到经修饰的培养基中开始实验。这一实施例中，“乳酸盐，A栏”代表30mM乳酸钠在BTZ-3生长培养基。“葡萄糖，B栏”代表10mM葡萄糖在BTZ-3生长培养基中。
然后，1，8-二羟基蒽醌、9、10-二氢蒽醌或2-氯蒽醌以表4所示的四种不同的浓度加入到培养物中，培养物中每小时生成的氢气和甲烷用使用Porapak Q栏和氩气为载气的气相色谱测定，使用热导检测，结果在表4-6中给出。
表 4
AO是2-氯蒽醌
umol H2/h/培养物 nmol甲烷/h/培养物
A B A B
AO uM 乳酸盐 葡萄糖 乳酸盐 葡萄糖
0 2.1 5.7 360 50
3.5 2.3 5.4 160 12
7 2.3 6.1 79 0
17.5 1.7 5.8 0.3 0
表 5
AO是1，8-二羟基蒽醌
umol H2/h/培养物 nmol/甲烷/h/培养物
A B A B
AO uM 乳酸盐 葡萄糖 乳酸盐 葡萄糖
0 1.8 4.7 285 43
3.5 1.8 5.6 326 12
7 1.9 5.4 260 0
17.5 1.6 3.6 0.6 0
表6
AO是9,10-二羟基蒽醌
umol H2/h/培养物 nmol甲烷/h/培养物
A B A B
AO uM 乳酸盐 葡萄糖 乳酸盐 葡萄糖
0 1.45 6.2 320 -
3.5 2.1 6.2 295 39
7 2.1 5.9 97 43
17.5 2.2 4.2 26 0
这些数据表明，2-氯蒽醌、1、8-二羟基蒽醌或未取代的9，10-二氢蒽醌在发酵乳酸盐或葡萄糖成氢气上完全缺乏作用，然而，从乳酸盐或葡萄糖形成甲烷的过程几乎被所有3种蒽醌在17.5um时完全抑制。这提示抑制作用发生在从氢气和二氧化碳或乙酸盐形成甲烷（甲烷产生菌作用）的阶段，而不是发生在氢气和乙酸盐形成（发酵微生物作用）阶段。
实施例3
甲烷抑制作用的条件
实施例3的目的是测试2-氯蒽醌在改变培养物上氢气浓度时对从氢气和二氧化碳或乙酸盐形成甲烷的作用。
甲烷形成研究是在厌氧消化器富集物中通过首先在H2/CO2（80/20Vol/Vol）下补充以10mM乙酸钠的BTZ-3培养基中预培养厌氧消化器淤泥进行的。这一预培养物的一部分然后转移到新鲜培养基（没有用乙酸盐H2/CO2补充）中达到10%Vol/Vol的接种量。2-氯蒽醌（“AQ”）以表7所示的浓度加入到这些试验培养物中。培养物置入氢气浓度为0.5%到80%的系列下。测定从培养物中形成甲烷的开始速率（气相色谱，PorapaR Q柱，氩气载气，热导检测），结果由下面的表7给出：
表 7
nmol甲烷/h/培养物
nmol甲烷/h/培养物
AO um 0.5% H22% H25% H240% H280% H2
0 518 518 518 442 700
3.5 64 33 20 596 885
7 24 22 40 565 910
17.5 0 0 2 565 965
也研究了2-氯蒽醌在厌氧消化器富集物中对从乙酸形成甲烷的作用。除了试验培养物均含有30mM乙酸钠外，其它按上述方法进行。2-氯蒽醌以表8所示的不同浓度加入到培养物中，用如上方法测定甲烷的产量，结果在下面的表8中给出。
表 8
AO um nmol甲烷/h/培养物
0 60
3.5 79
7 26
14.5 0
上述数据表明，2-氯蒽醌抑制从氢气（表7）或乙酸盐（表8）两种底物生成甲烷。然而，用氢气作为生成甲烷的底物时，仅在低的氢浓度（即0.5%，2%，5%）下而不是在40%或80%氢浓度下抑制甲烷生成。即使在低浓度的AQ，3.5uM 2-氯蒽醌下，这种抑制作用也是明显的。在厌氧消化器和牛的瘤胃中典型地可见低的氢周围浓度（C.J.Van Nevel，D.I.Demeger，Manipulation of rumer fermentaion.In：The Rumen Microbial Ecosgstem，P.N.Hobson.（ed）Elsever Publishong Co.（1988）和Renand，P.，Dochain，D.，Bostin，G.，Naveau，H，Nyns，B-J.，Adaptive Control of anaerobic digestion Processes：a pilot scale application，Biotechnol.Bioeng.，31∶287∶294（1988））。
自然界中的其它重要甲烷生成底物是乙酸盐。使用乙酸作底物，2-氯蒽醌也如表8所见的一样抑制甲烷形成。
实施例4
瘤胃甲烷形成研究
实施例4使用苜蓿作为一种碳源测试2-氯蒽醌对甲烷产生菌产生甲烷的影响，它是用瘤胃富集物进行的。
从造瘘的小公牛（具有抽样点外科移植到瘤胃区的小公牛，从Universkity of Delaware，Dept.of Animal Science and Agricultural Biochemistry获得）获得瘤胃液体，将其保存在约40℃直到以培养基：瘤胃液体2∶3（Vol∶Vol）比率接种到新的培养基中，所说培养基由基本无机培养基BTZ-3（实施例1的）加0.38g/l氯化钠和2.63g/l碳酸氢钠组成。20ml这一混合物分配到130ml Wheaton瓶中，每个瓶含有作为甲烷产生底物的200mg精分的苜蓿。供给的气相是氮气/二氧化碳80/20（Vol/Vol）。培养物在40℃下振荡培养。2-氯蒽醌以表9所示的四种不同的浓度加入。在整个期间测定甲烷、氢气、乙酸盐和丙酸盐的浓度。氢气和甲烷通过气相的间歇取样经气相色谱（Porapak Q柱，氩气为载气，热导检测）监测。乙酸盐和丙酸盐通过液体取样经高压液相色谱（Hamilton Polypore H柱，以0.013M硫酸为流动相）监测。21小时的结果列在下表9中。
表 9
21小时后形成的总产物的μMols
产物 对照 4 uM AO 8 uM AO 20 uM AO
氢气 0.37 0.77 1.5 2.7
甲烷 237 275 228 225
乙酸盐 549 511 526 460
丙酸盐 120 119 120 96
这些数据仅说明在0-20uM范围内2-氯蒽醌的临界作用。可见氢气约增加8倍，乙酸盐和丙酸盐水平略微减小。H2的增加是出现甲烷抑制的非常敏感的指示。电子转移到H2产物，而不用来还原CO2产生甲烷。在如上所述的生长条件下以40uM 2-氯蒽醌亚培养对照以重复实验。每一培养物再加入200mg苜蓿，该培养物在40℃下培养24小时，这一实验的数据示于下表的表10中
表 10
24小时后形成的总产物的umols
产物 对照 40 uM(AO)
氢气 50 225
甲烷 174 2.5
乙酸盐 166 215
丙酸盐 200 151
在40uM（10ppm）2-氯蒽醌的数据明显说明，如所预料的，甲烷形成受到了抑制，而积累了未被利用的氢气。乙酸盐形成稍有增加。丙酸盐的形成有些减少。
实施例5
限制性混合培养物研究
实施例5测试等摩尔的1-和2-氯蒽醌混合物对含有硫酸盐还原细菌去磺弧菌（Desulfovibrio desulpuricans）WADS（来源是Wilming Delaware厌氧消化，“WADS”）和甲烷微生物Methanobacterium formicicum的限定性混合培养物产生甲烷的作用。在这一实施例中，两种细菌都存在于以乳酸盐为碳源的培养物中。尽管已知蒽醌抑制硫酸盐还原细菌（该细菌靠硫酸盐还原作用生长），但是，这里去磺弧菌WADS不是靠硫酸盐还原作用生长，而是靠发酵乳酸盐或氢气生长，因此，蒽醌对该生物体无影响。在这一培养物中，Methano-bacterium formicicum靠去磺弧菌产生的氢气和二氧化碳生长以形成甲烷。
作为去磺弧菌代谢的结果，乳酸盐经受了下列转化：
2乳酸盐→2乙酸盐+4氢气+1＝二氧化碳
所形成的氢气按照下列形式被Methanobacterium formicicum吸收进甲烷和水中：
4氢气+1二氧化碳→1甲烷+2水
蒽醌混合物以表11所示的3种不同浓度的丙酮溶液形式加入到这些培养物中，每隔一天测定由培养物产生的氢气和甲烷的水平。结果示于表11，
表 11
CH4或H的总uMol
对照 AO在0.05ppm时 AO在0.1ppm时 AO在0.2ppm时
天数 H2CH4H2CH4H2CH4H2CH4
0 45 26 51 21 46 23 53 27
1 25 65 67 20 71 22 23 25
4 5 318 50 33 59 31 60 30
6 0.4 410 36 137 48 69 47 45
7 0.26 440 24 293 55 124 39 45
8 0.34 328 15 516 45 253 40 46
在对照培养物（无蒽醌类）中，由硫酸盐还原产生的氢气在开始时很快出现，接着消失，因它被甲烷微生物转化成甲烷。这种快速氢产生出现在包括蒽醌处理过的培养物的所有培养物中。在0.05ppm AQ下，甲烷微生物将氢气转化成甲烷有些缓慢，在所有培养物中氢气水平保持较高，直到并包括0.2ppm。蒽醌增加，甲烷产生的抑制也增加，这一点也很明显。在0.2ppm AQ水并时，甲烷的产生几乎完全消失。
实施例6
不同蒽醌的作用
实施例6研究不同蒽醌对从以乳酸盐为电子源和碳源的厌氧消化器淤泥的甲烷生成的影响。
厌氧消化器富集物用实质上与实施例2描述的相同的含有30mM乳酸钠的BT-3培养基制备。蒽醌类以浓度约20mM的丙酮溶液的形式加入，在整个指定的期间，用与以上描述的相同的方法测定甲烷水平。结果在表12中给出。
表 12
蒽醌 甲烷总 uMol
0 hr 16hr 36hr 56hr 64hr
无 AO 14 13 27 46 39
1,8-二羟基- 11 10 12 12 11
1-氨基- 11 15 13 14 14
1-氯- 12 - 16 20 20
2-氯- 11 14 14 11 17
2-氯-3-羧基- 17 16 28 29 29
1-羟基- 9 11 10 12 11
未取代- 9 9 10 9 11
从上述数据明显看出，加入包括未取代蒽醌在内的任何蒽醌衍生物都导致甲烷生成的抑制。2-氯-3-羧基蒽醌是最弱的抑制剂。数据可能提示基本的三环结构是抑制作用的必要成分，简单取代基的添加，例如简单氯-，羟基-或氨基取代基的添加既不提高也不消除这一活性。
实施例7
蒽醌化合物对来源于从用100%草料饲料苜蓿干草饲喂的小公牛分离到的瘤胃微生物的甲烷生成和挥发性脂肪酸水平的形响
微生物的分离
分离瘤胃微生物实质上与实施例4中描述的相同。简单地说，从饲喂100%苜蓿干草（100%草料）饲料的造瘘的小公牛制得一批混合的瘤胃微生物培养物。体外饲料被磨碎，过1mm筛网，以30ml培养液（15ml瘤胃液和15ml标准瘤胃缓冲液）0.375g的比率使用。标准瘤胃缓冲液是本领域公知的，合适的例子可以在Goering et al.，Forage Fiber Analysis.Agriculture Handbook ＃3，（1970），Agrieulture Research Senice，USDA，Washington，DC.中找到。饲喂后3小时收集瘤胃液体，经四层干酪布过滤，继续这一过程在厌氧条件下发现园粒状微生物。
蒽醌类和对照化合物的制备
待试化合物包括9，10蒽醌、2-氯蒽醌和2-氯-3-羧基蒽醌。莫能菌素（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）和2，2-二氯乙酰胺（2.2DCA）（Aldrich Cehmical Co.，Milwaubel，WI）是两种以甲烷抑制为目的的现行的可购得的饲料添加剂，它们被用作阳性对照。所有化合物溶解在乙醇中，制备合适的稀释度以便0.25ml溶液达到目标温度（在培养液体中的ppm）。对照培养物仅接受0.25ml乙醇。以前研究的数据（未示出）已经表明，这一水平的乙醇对瘤胃发酵有很小影响。
培养条件
在保持40℃的50ml血清瓶中进行厌氧培养每一化合物。在每一剂量下制备3个同样的培养物试样，一般培养24小时。
气体和挥发性脂肪酸水平的测定
培养24小时后通过置换测定总的气体产量，收集气体样品供进一步分析。立即测定pH值，接着加入1ml 25%的m-磷酸到5ml发酵液中。用实质上与Searcy et al.，Clinica Chem.Acta.，12，170，（1965）中描述的相同的改进的苯酸次磷酸盐方法在630nm读数比色分析酸化液体中氨型氮。
挥发性脂肪酸用使用10米，530um，macrobore Carbowax M柱（Supelco Inc.Bellefonte，PA）的气相色谱（Model 589 Hewlett-packard Avondale，PA）测定。流速为10ml/min的氮气为载气。1微升样品以8∶1的分流比注入。入口温度为200℃，检测温度为250℃，炉温设置为0℃保持1min，以5℃/min升温到100℃，以45℃/min升温到170℃，最终保留时间为5分钟。被测定的挥发性脂肪酸包括乙酸（C2）、丙酸（C3）、异丁酸（Ci4）、异戊酸（Ci5）和戊酸（C5）。
甲烷和氢气经气相的间歇取样用气相色谱（Porapak Q柱，氩气为载气，热导检测）分析。开始炉温为90℃，保持1分钟，接着以30℃/min升温，直到最终温度达到190℃，保持6分钟，载气氩气的流速为11mv/min
蒽醌对气体和VTFA产量的影响
表13所示的数据是从瘤胃微生物收集到的，这些微生物是从饲喂草料饲料的造瘘的小公牛分离到的，经各种蒽醌化合物、莫纯菌素，2，2-二氯乙酰胺处理过。
表13表明，9，10蒽醌、2-氯蒽醌和2-氯-3-羟基蒽醌都抑制甲烷形成，只是羧基化衍生物有效性最差。除了9，10蒽醌在5ppm水平外，对氢气的形成几乎无影响。乙酸盐形成被9，10蒽醌和2-氯蒽醌抑制。仅可见丙酸盐和丁酸盐水平的稍微提高。莫能菌素这种商品甲烷抑制剂（和丙酸盐提高剂）在0.5ppm时抑制甲烷形成，但在这一浓度时对脂肪酸仅有微弱的作用。瘤胃添加剂2，2-二氯乙酰胺也观察到了相同的情况。大多数处理过的培养物相对于未处理的对照来说，总脂肪酸产量表现出极微弱的抑制。
所示数据说明，被试3种蒽醌在0.5-5ppm水平对使用草料饲料（苜蓿干草）的甲烷形成有一定的抑制作用，其中最好的是未取代的和2-氯衍生物。蒽醌类的甲烷抑制作用表现出至少（如果不是更好的话）与莫能菌素或2，2-二氯乙酰胺的效果一样好。被试化合物无一明显影响挥发性脂肪酸。如由在培养物中检测的游离氨型氮所指示的，被试的蒽醌类和其它化合物似乎对解朊作用无明显的不利影响。
实施例8
蒽醌化合物对来源于从用50∶50草料浓缩饲料喂的小公牛
分离到的瘤胃微生物的甲烷生成和挥发性脂肪酸水平的影响
用正如实施例1所描述的方法分离微生物，不过，在这一例子中，微生物从以由50%苜蓿和50%磨碎的玉米粉组成的50∶50的草料浓缩饲料饲喂的造瘘的小公牛分离到。用实质上与实施例7描述的相同的方法制备化合物、培养和测定气体和VTFA。表14中给出了说明蒽醌化合物对气体和VTFA产生的影响的数据。
表14表明了蒽醌类、莫能菌素和2，2-二氯乙酰胺对干草50∶50混合物（牧场浓饲料）发酵的影响。这种饲料很接近实际用作瘤胃添加剂的饲料。除了羧基化蒽醌表现出对甲烷形成的较小的影响外，待试化合物即使是在0.5ppm水平也明显抑制甲烷。与实施例7中列举的100%苜蓿培养物相反，在9、10蒽醌或2-氯蒽醌处理过的培养物中可见氢气的大量积累。挥发性脂肪酸，特别是乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐明显受到影响。乙酸盐形成受到抑制而丙酸盐和丁酸盐形成得到提高。对反刍动物的代谢来说，这些提高是有益的，它可能导致生产率的提高。在这些特定的实验中没有测定氨型氮。从理论上来说，培养物对氢过度产生的长期适应性应导致丙酸盐和丁酸盐形成的提高，因为形成这些化合物需要通常以氢气形式的还原剂。
实施例9
蒽醌类对纤维素消化的影响
实验化合物不干扰纤维质消化是重要的，因此，试验了9，10蒽醌、2-氯蒽醌、2-氯-3-羧基蒽醌‘、莫纯菌素加2，2-二氯乙酰胺对由100%苜蓿组成的饲料的纤维素消化的影响。
培养24小时后，通过分析饲料残渣中酸净化纤维质（AOF）含量测定纤维质消化作用。用饲料中ADF的开始量减去残余的ADF计算ADF的消化作用。计算ADF消化作用的方法是本领域公知的，可从Goering et al.，Forage Fiber Analysis.Agriculture Hadbook ＃3，（1970），Agriculture Research Service，USDA，Washington，DC.中找到例子。
如表15所示，在大多数培养中，百分消化作用稍低。但是不存在与任何蒽醌的明显剂量-应答关系。因此，我们的结论是蒽醌对纤维素消化作用没有明显的影响。对照物质是单独的溶剂，用来溶解待试的化合物。
表 15
化合物 浓度 %消化作用
对照 0 34%
莫纯菌素 0.5ppm 28%
2,2 DCA 0.5ppm 35%
2-氨 AO 0.5ppm 24%
2-氨 AO 1.0ppm 26%
2-氨 AO 5.0ppm 26%
9,10 AO 0.5ppm 32%
9,10 AO 1.0ppm 20%
9,10 AO 5.0ppm 26%
3-氯-2-羧基 AO 0.5ppm 20%
3-氯-2-羧基 AO 1.0ppm 22%
3-氯-2-羧基 AO 5.0ppm 26%