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1、10申请公布号CN104163861A43申请公布日20141126CN104163861A21申请号201410314113922申请日20140703C07K14/46200601A61K38/17200601A61K8/64200601A61P31/04200601A61P31/10200601A61Q19/00200601A23K1/17200601A23L3/352620060171申请人苏州大学地址215123江苏省苏州市工业园区仁爱路199号72发明人王义鹏于海宁陈燕卫林74专利代理机构北京市科名专利代理事务所特殊普通合伙11468代理人程美琼54发明名称一种爬行动物抗菌肽ALL。
2、IGATORIN5及其应用57摘要本发明公开了一种爬行动物来源的抗菌肽ALLIGATORIN5及其氨基酸序列和在抗菌方面的应用。本发明的抗菌肽ALLIGATORIN5来源于扬子鳄，通过检索扬子鳄基因数据库，筛选分析获得抗菌肽成熟肽序列，抗菌肽ALLIGATORIN5氨基酸序列如序列表中SEQIDNO1所示。通过对比分析，爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5与目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明显差异，属于一种新型抗菌肽。通过抗菌实验表明，本发明的扬子鳄抗菌肽ALLIGATORIN5对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌具有极强的抗菌活性，抗菌作用广谱高效，此外具有溶血活性低、盐耐受性、热耐受。
3、性和热稳定性好的等特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表2页10申请公布号CN104163861ACN104163861A1/1页21一种爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5，其特征在于，所述抗菌肽来源于扬子鳄，由22个氨基酸组成，分子量为25571DA，等电点为1203，氨基酸序列如序列表SEQIDNO1所示THRARGARGLYSPHETRPLYSLYSVALLEUASNGLYALALEULYSILEALAPROPHELEULEUGLY，所有氨基酸均为。
4、L型。2一种如权利要求1所述的爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5在制备抗菌药物或组合物、抑制细菌生长药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中的应用。权利要求书CN104163861A1/7页3一种爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5及其应用技术领域0001本发明涉及一种爬行动物来源的抗菌肽及其应用，更具体的说，涉及一种来源于爬行动物扬子鳄的抗菌肽及其应用，属于生物医学技术领域。背景技术0002传统抗生素在治疗细菌性感染疾病方面取得了显著效果，但是近年来，随着传统抗生素在医学和养殖业等领域的滥用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，微生物耐药问题已成为严重威胁人类健康的难。
5、题。一直以来微生物耐药性的应对手段是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗微生物制剂，而这种新的抗生素使用一段时间后，微生物会进一步对这种新的抗生素产生耐药性，因此这就需要持续开发新的抗微生物制剂。开发出一种新型抗菌机制药物是解决微生物耐受性问题的一个新方向。0003抗菌肽是一种小分子多肽，对细菌、真菌、病毒和原虫等均具有杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、杀菌活性强等特点。大多数抗菌肽的杀菌机制是通过作用于细菌细胞膜上的磷脂双分子层，破坏细胞膜完整性并在细胞膜上形成跨膜通道，造成细胞内容物溶出而导致细胞死亡。这种独特的杀菌机制一般不易引起微生物耐药性。而且抗菌肽对哺乳动物正常细胞。
6、和组织一般没有毒害性，不存在残留问题，因此抗菌肽有望成为一种新型的高效的抗菌药物，具有广阔的开发应用前景。发明内容0004本发明目的是为解决传统抗生素的不足之处，提供了一种来源于爬行动物扬子鳄的抗菌肽ALLIGATORIN5，另外提供了该抗菌肽的氨基酸序列以及其在抗菌方面的应用。爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5具有广谱高效的抗菌作用，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌具有极强的抗菌活性，且具有分子量小、合成简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。0005为实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案0006本发明中抗菌肽ALL。
7、IGATORIN5是源自于爬行动物扬子鳄体内的一种抗菌肽，爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5由22个氨基酸组成，分子量为25571DA，等电点为1203，氨基酸序列如序列表SEQIDNO1所示THRARGARGLYSPHETRPLYSLYSVALLEUASNGLYALALEULYSILEALAPROPHELEULEUGLY，所有氨基酸均为L型；0007本发明也提供了抗菌肽ALLIGATORIN5的化学制备方法0008根据获得的爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5成熟肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪433A,APPLIEDBIOSYSTEMS合其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；用高。
8、效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDITOF，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构；0009另外，本发明提供了抗菌肽ALLIGATORIN5的应用，在制备抗菌药物或组合物、抑制细菌生长药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中的应用。说明书CN104163861A2/7页40010本发明的优点是提供了一种来源于扬子鳄的爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5以及其在抗菌方面的应用。抗菌肽ALLIGATORIN5具有广谱高效的抗菌作用，且具有分子量小、合成简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的特点，可。
9、应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。具体实施方式0011实施例10012爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5的发现0013通过检索，从美国国家生物技术信息中心NATIONALCENTERFORBIOTECHNOLOGYINFORMATION，HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV网站的扬子鳄基因组数据中发现一条基因序列XP_0060264731，长度为477BP，编码的多肽前体由158个氨基酸残基组成。该基因及其编码的多肽前体分别如SEQIDNO2和SEQIDNO3所示001400150016将该基因序列用NCBI网站的BLASTX软件HTTP/BLASTSTVANCBINLMNI。
10、HGOV/BLASTCGIPROGRAMBLASTXPAGE_TYPEBLASTSEARCHLINK_LOCBLASTHOME进行序列比对分析结果表明，该基因的编码产物可能为扬子鳄CATHELICIDINS家族抗菌肽前体。进一步将该基因编码的多肽前体序列用NCBI网站的PROTEINBLAST软件HTTP/BLASTSTVANCBINLMNIHGOV/BLASTCGIPROGRAMBLASTPPAGE_TYPEBLASTSEARCHLINK_LOCBLASTHOME进行序列比对，并与之前发现的其它动物来源CATHELICIDINS家族抗菌肽序列进行比较分析，确定该抗菌肽成熟过程中的酶切位点为L。
11、135V136，从而获得该抗菌肽成熟肽序列为TRRKFWKKVLNGALKIAPFLLG氨基酸单字母简写序列，命名为ALLIGATORIN5。ALLIGATORIN5与目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明显差异。0017实施例2说明书CN104163861A3/7页50018抗菌肽ALLIGATORIN5的化学合成方法00191用自动多肽合成仪433A,APPLIEDBIOSYSTEMS合成ALLIGATORIN5的全序列，通过HPLCC18反相柱层析脱盐纯化。2分子量测定采用常规基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDITOF法。3纯化的ALLIGATORIN5用高效液相色谱HPLC方法鉴定。
12、其纯度95，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDITOF，25571DA，等电聚焦电泳测定等电点为1203，用自动氨基酸测序仪确定其氨基酸序列结构与天然ALLIGATORIN5一致。0020实施例30021抗菌肽ALLIGATORIN5抗菌活性检测00221分别挑取保存于斜面上的试验菌株大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和金黄色葡萄球菌ATCC27853购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其它菌株从当地医院收集均匀涂布于MH固体培养基购自青岛海博生物技术有限公司平板上，将经过灭菌的05CM直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2MG/ML。
13、的ALLIGATORIN5样品溶液10L，于37倒置培养1820小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。结果表明，抗菌肽ALLIGATORIN5对表2中列出的菌株种类均具有抗菌活性。2采用2倍稀释法测定最小抑菌浓度MINIMUMINHIBITORYCONCENTRATION选择上述实验步骤1中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。将试验菌株接种到MH液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司中，然后在培养箱中37振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的菌株培养液稀释到2105CFU/ML待用。002。
14、3在无菌96孔板各孔中预先加入100LMH液体培养基，然后在第一孔中加入100L用MH液体培养基稀释到一定浓度的经022M孔滤膜过滤的的ALLIGATORIN5样品溶液，混匀后取100L加入第2孔，依次倍比稀释参见表1，自第9孔吸出100L弃去，第10孔为对照管。0024表1稀释方法00250026向各孔中加入已稀释好的菌株培养液100L，然后将96孔板放置于培养箱中37缓慢振荡培养18小时，于600NM波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。0027由表2可见，ALLIGATORIN5对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出极强的抗菌活性，其中包括。
15、大量临床分离致病菌。其MIC值处于46975G/ML的范围。0028表2扬子鳄抗菌肽ALLIGATORIN5的抗菌活性0029说明书CN104163861A4/7页60030实施例40031抗菌肽ALLIGATORIN5杀菌速度的测定0032大肠杆菌ATCC25922用MH液体培养基青岛海博生物技术有限公司在37培养12小时，然后用新鲜的MH液体培养基稀释成106CFU/ML的菌悬液。将溶解于灭菌的去离子水中的ALLIGATORIN5样品加入到菌悬液中，使终浓度为5MIC469G/ML。将加说明书CN104163861A5/7页7入ALLIGATORIN5样品的菌液放置于培养箱中37培养箱中震。
16、荡培养，分别在0、10、20、30、45、60、90、120和180分钟取50L菌液稀释1000倍，然后取50L稀释的菌液涂布到MH固体培养基上，于培养箱中37培养过夜后菌落计数。本实施例中用美罗培南作为阳性对照，灭菌的去离子水作为阴性对照。实验结果如表3所示。0033从表3中可以看出，ALLIGATORIN5的杀菌作用极其迅速，在20分钟内即可杀死所有大肠杆菌。而阳性对照美罗培南需要180分钟才可杀死所有细菌细胞。0034表3抗菌肽ALLIGATORIN5杀菌速度00350036实施例50037抗菌肽ALLIGATORIN5溶血活性的测定0038将采集的新鲜人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤。
17、2次并重悬成107108CELL/ML的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的一定浓度的ALLIGATORIN5样品溶液混合，37保温30MIN，再于1000RPM离心5MIN，上清液于540NM波长处测定光吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用TRITONX100，溶血百分比按以下公式计算溶血百分比HA样品A阴性对照/A阳性对照100。根据实验结果计算ALLIGATORIN5的半数溶血浓度HC50。结果表明ALLIGATORIN5具有较低的溶血活性，其半数溶血浓度HC50值为21005G/ML，该值远大于ALLIGATORIN5对微生物的MICS值，表明ALLIGATORIN5。
18、具有巨大的应用潜力。0039实施例60040抗菌肽ALLIGATORIN5盐耐受性、热耐受性和热稳定性测定00411测定抗菌肽ALLIGATORIN5盐耐受性将大肠杆菌ATCC25922用MH液体培养基青岛海博生物技术有限公司于培养箱中37培养12小时，然后分别用含0、50、100、150、200和400MM氯化钠的新鲜MH液体培养基稀释到106CFU/ML。用含有不同氯化钠浓度的MH液体培养基制备不同浓度梯度的ALLIGATORIN5样品溶液。如表4所示。利用上述实施例2所述的2倍稀释法测定ALLIGATORIN5的MIC值。其结果如表4所示。00422测定抗菌肽ALLIGATORIN5热耐。
19、受性将ALLIGATORIN5溶解于灭菌的去离子水中，配置成浓度为2MG/ML的样品溶液，于培养箱中在4、20、37、50、70和90各孵育1小时，然后取孵育后的ALLIGATORIN5样品溶液，利用实施例2所述的2倍稀释法测定ALLIGATORIN5对大肠杆菌ATCC25922的MIC值。其结果如表5所示。00433测定抗菌肽ALLIGATORIN5的热稳定性将ALLIGATORIN5溶解于灭菌的去离子水中，配置成浓度为2MG/ML的样品溶液，于培养箱中37孵育096小时。于0、6、12、24、48、72和96小时分别取ALLIGATORIN5样品溶液，利用实施例2所述的2倍稀释法测定说明书。
20、CN104163861A6/7页8ALLIGATORIN5对大肠杆菌ATCC25922的MIC值。其结果如表6所示。0044从表4中可以看出，ALLIGATORIN5具有极强的盐耐受性，盐离子的浓度对其活性无影响。低于或高于人体生理盐浓度时150MMNACL，ALLIGATORIN5的MICS值介于9381875G/ML之间，波动较小，其抗菌活性基本保持不变。0045从表5中可以看出，ALLIGATORIN5具有极强的热耐受性。ALLIGATORIN5溶液在90放置1小时之后，其MICS值维持不变，表明其抗菌活性不会改变。0046从表6所示可以看出，ALLIGATORIN5溶液具有很好的热稳定。
21、性。ALLIGATORIN5溶液在37放置96小时后，其MICS介于9381875之间，波动范围较小，其抗菌活性几乎不会改变。许多传统的抗生素，如头孢类抗生素的溶液极不稳定，几个小时内就会失去活性。ALLIGATORIN5相对于一些传统的抗生素可应用范围更广。0047表4含有不同氯化钠浓度的ALLIGATORIN5溶液对大肠杆菌ATCC25922的MIC0048NACL浓度MMMICG/ML004909385015610015615015620018754009380050表5不同温度孵育后的ALLIGATORIN5溶液对大肠杆菌ATCC25922的MIC0051温度ALLIGATORIN5M。
22、ICG/ML493820938379385093870938909380052表6于37孵育不同时间后ALLIGATORIN5溶液对大肠杆菌ATCC25922的MIC说明书CN104163861A7/7页90053时间HALLIGATORIN5MICG/ML09386938121875241254893872938961250054通过上述实施例可以看出，本发明中的来自于扬子鳄的爬行动物抗菌肽ALLIGATORIN5可通过化学合成的方式获得，该抗菌肽对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌，其中包括部分临床分离致病菌均有极强的抗菌活性。其次该抗菌肽具有分子量小、合成简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。说明书CN104163861A1/2页1000010002序列表CN104163861A102/2页11序列表CN104163861A11。