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1、10申请公布号CN104163869A43申请公布日20141126CN104163869A21申请号201410203062222申请日2014051461/823,53120130515USC07K19/00200601G01N33/56920060171申请人善笙生物科技股份有限公司地址中国台湾桃园县72发明人张大慈许嘉钦74专利代理机构永新专利商标代理有限公司72002代理人左路54发明名称重组细菌辨识蛋白及其用途57摘要本发明关于一种包含SEQIDNO1及细菌辨识凝集素的重组蛋白以及其用途，包含在样本中检测病原体、移除内毒素、测定内毒素或类内毒素物质的存在以及测定包含鼠李糖鼠李糖、鼠。
2、李糖N乙酰甘露糖胺、N乙酰甘露糖胺鼠李糖、鼠李糖半乳糖或半乳糖鼠李糖的病原体相关分子模式的存在，以及作为医药、抑菌剂、去污染剂、表面活性剂或诊断工具之用途。30优先权数据51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表4页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表4页附图5页10申请公布号CN104163869ACN104163869A1/1页21一种重组蛋白，包含SEQIDNO1及细菌辨识凝集素。2如权利要求1所述之重组蛋白，其中所述细菌辨识凝集素由SEQIDNO2所组成。3如权利要求1所述的重组蛋白，其由SEQIDNO3或SEQIDNO4所组成。4如。
3、权利要求1所述的重组蛋白，其用于在样本中检测病原体，方法包含将所述样本与经标记物质标记的所述重组蛋白接触以形成被标记的重组蛋白病原体复合物，并测量所述复合物中的标记物质，以检测病原体。5如权利要求6所述的重组蛋白，其中样本中的病原体表面上含有脂磷壁酸、脂多糖或由鼠李糖鼠李糖、鼠李糖N乙酰甘露糖胺、N乙酰甘露糖胺鼠李糖、鼠李糖半乳糖或半乳糖鼠李糖或它们的任何组合所组成的病原体相关分子模式。6如权利要求4所述的重组蛋白，其中所述病原体选自以下组中C群沙门氏菌SALMONELLASEROGROUPC、产酸克雷伯氏菌KLEBSIELLAOXYTOCA、鲍氏不动杆菌ACINETOBACTERBAUMAN。
4、NII、绿脓杆菌PSEUDOMONASAERUGINOSA、19F型肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIASEROTYPE19F、19A型肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIASEROTYPE19A、19B型肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIASEROTYPE19B、23F型肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIASEROTYPE23F、绿脓杆菌PSEUDOMONASAERUGINOSAPAO1株、李斯特单胞菌LISTERIAMONOCYTOGENES、大肠杆菌ESCHERICHIACOLI、伤寒杆菌SALMONELLAENTER。
5、ICASEROVARTYPHIMURIUM、粘质沙雷氏菌SERRATIAMARCESENS、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS、粪炼球菌STREPTOCOCCUSFAECALIS及粪肠球菌ENTEROCOCCUSFAECALIS。7如权利要求1所述的重组蛋白，其用于在样本中移除内毒素，方法包含以下步骤A将所述重组蛋白与被直接或非特异性地固定于固态载体的样本培育或接触，其中所述重组蛋白能结合内毒素以形成重组蛋白与内毒素的复合物，及B将所述复合物与所述样本分离。8如权利要求1所述的重组蛋白，其用于在样本中检测内毒素或类内毒素物质的存在，方法包含将所述样本与经标记物质标记的所述重。
6、组蛋白接触以形成被标记的重组蛋白内毒素复合物，并测量所述复合物中标记物质以检测内毒素。9如权利要求1所述的重组蛋白，其用于在样本中测定包含鼠李糖鼠李糖、鼠李糖N乙酰甘露糖胺、N乙酰甘露糖胺鼠李糖、鼠李糖半乳糖或半乳糖鼠李糖的病原体相关分子模式的存在，方法包含将所述样本与经标记物质标记的重组蛋白接触以形成被标记的重组蛋白病原体相关分子模式复合物，并测量所述复合物中标记物质以检测病原体相关分子模式。10如权利要求1所述的重组蛋白，其可用作医药、抑菌剂、去污染剂、表面活性剂或诊断工具。权利要求书CN104163869A1/8页3重组细菌辨识蛋白及其用途技术领域0001本发明系关于一种新颖重组蛋白及其。
7、用途，该重组蛋白包含人工肽及细菌辨识凝集素。背景技术0002凝集素为一可辨识特定糖类结构且广泛遍布于生物中之糖类结合蛋白质族群。依其糖类辨识区域CRD之序列相似度及糖类结合特异性，动物凝集素被分类成多种家族。它们在不同的生理过程中扮演不同的角色，例如作为细胞表面受体，参与细胞与细胞之间的交互作用以影响生长及分化过程；或在免疫反应过程中辨识外来分子。近年，来自海洋资源之体液凝集素的生化与生理特性已被深入研究。海洋生物凝集素如鲎之血浆凝集素多能辨识脂多糖LPS。脂多糖或内毒素通常包含一被称为脂质A之疏水性区段，一不重复之“核心”寡糖以及一远程多糖或O抗原。细菌辨识凝集素BRL，一种可辨识细菌及结合。
8、脂多糖的蛋白质，为分离自台湾三棘鲎TACHYPLEUSTRIDENTATUS的血淋巴蛋白质。细菌辨识凝集素与鲎凝集素3TACHYLECTIN3一自日本三棘鲎变形细胞分离出之凝集素展现68之序列相似性。自血淋巴分离出之原生细菌辨识凝集素可与肺炎链球菌R36A革兰氏阳性，肠炎弧菌革兰氏阴性及大肠杆菌BOS12革兰氏阴性三种细菌以剂量依赖且可饱和的方式结合。自台湾三棘鲎血浆纯化之原生细菌辨识凝集素呈现不同的糖基化程度，以及经蛋白酶部分水解状态，以致很难测定确切具有细菌结合活性的部份。由于鲎为一古海洋节肢动物且直接从血淋巴分离出原生细菌辨识凝集素不符合人道主义，重组之细菌辨识凝集素RBRL已以基因工程。
9、制造且表达于嗜甲醇酵母菌PICHIAPASTORISKM71之酵母菌菌株。然而，嗜甲醇酵母菌KM71中之糖基化细菌辨识凝集素表达量低，每500毫升培养液中只有约06毫克之纯细菌辨识凝集素可经由脂多糖琼脂糖凝胶LPSSEPHAROSECL4B层析管柱纯化分离。0003内毒素的检测及移除对生技产业具有广大的市场。每年全球医药诊断市场持续成长，目前的病原诊断极依赖耗费人力及时间之传统细菌培养及菌落计算方法。为了抑制病原菌，抗生素为具有高特异性之有力抑菌剂。但具抗生素抗药性之病原株的出现及研发新型抑菌剂的迟缓，找到替代的治疗方式非常迫切。开发检测及治疗病原菌的新策略是必要的。发明内容0004重组融合蛋。
10、白可藉由使用亲和性标签增加蛋白质之表达及帮助其纯化，以克服低表达量的困难。0005本发明设计一人工肽以增加一目标融合蛋白之可溶性。该人工肽之氨基酸序列实例包括但不限于SEQIDNO1。0006由台湾三棘鲎血淋巴获得之鲎细菌辨识凝集素BRL为一分离自血浆之脂多糖结合蛋白质。一细菌辨识凝集素之氨基酸序列实例包括但不限于SEQIDNO2。说明书CN104163869A2/8页40007本发明已在大肠杆菌表达系统中创造出一新颖重组蛋白RBRL，其包含氨基端39个氨基酸之人工肽及羟基端128个氨基酸之细菌辨识凝集素，例如SEQIDNO3。在SEQIDNO3中的第1个氨基酸M及第41到42个氨基酸EF是从。
11、PET23A载体获得之残基且可于使用不同载体时被替换，甚至于本发明之一实施方案中可不存在。此外，在SEQIDNO3末端的6个残基HHHHHH可作用为纯化标签且可以任何具相似功能的其它序列将其替换，甚至于本发明之一实施方案中可不存在。根据以上所述，应注意到本发明也提供一种由氨基酸序列SEQIDNO4所组成之重组细菌辨识凝集素。0008熟谙此技艺者将了解到任何以上氨基酸序列具相似功能的突变体都包含在本发明之范畴中。0009添加人工肽SEQIDNO1可成功增加细菌辨识凝集素的表达并简化纯化步骤。重组细菌辨识凝集素RBRL保留对脂多糖及脂磷壁酸LIPOTEICHOICACID,LTA的结合活性，且意外。
12、地在经由比较可被重组细菌辨识凝集素结合的脂多糖及脂磷壁酸后，发现在一样本中包含鼠李糖鼠李糖RHARHA、鼠李糖N乙酰甘露糖胺RHAMNOSENACETYLMANNOSAMINE,RHAMANNAC、N乙酰甘露糖胺鼠李糖MANNACRHA、鼠李糖半乳糖RHAGAL或半乳糖鼠李糖GALRHA的病原体相关分子模式PAMP对于细菌辨识凝集素的辨识扮演一重要的角色。在抑菌活性方面，藉由重组细菌辨识凝集素对特定细菌表面成分的辨识，重组细菌辨识凝集素可明显地以剂量依赖的方式抑制绿脓杆菌PSEUDOMONASAERUGINOSAPAO1的生长，其半数抑制浓度IC50为43M。该基因工程制造的重组细菌辨识凝集素。
13、可被开发为一检测剂及一抑菌剂，针对样本中在细胞表面上具有包含鼠李糖鼠李糖、鼠李糖N乙酰甘露糖胺、N乙酰甘露糖胺鼠李糖、鼠李糖半乳糖或半乳糖鼠李糖之病原体相关分子模式的病原菌，如结核分枝杆菌MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS及炭疽杆菌BACILLUSANTHRACIS。0010除非另外特别加以定义，于此叙述中所用的名词将具有熟知此技艺者可了解之普通且常见之含意。0011因此，本发明提供一种由氨基酸序列SEQIDNO1所组成之肽片段。本发明亦提供一种使用SEQIDNO1以增加目标蛋白质表达量的方法，包含A融合SEQIDNO1与目标蛋白质以形成一重组蛋白；及B藉由一表达宿主来表达该重。
14、组蛋白。较佳地，该目标蛋白质为自鲎属TACHYPLEUS获得之细菌辨识凝集素，且其表达宿主为细菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳类动物细胞。更佳地，该细菌系大肠杆菌。该方法不仅简化目标蛋白质的纯化步骤，更在融合SEQIDNO1至目标蛋白质后保留该目标蛋白质的活性。0012本发明亦提供一种重组蛋白，包含SEQIDNO1及一细菌辨识凝集素。在一较佳实施例中，该SEQIDNO1位于氨基端且该细菌辨识凝集素位于羟基端。较佳地，该人工肽系SEQIDNO1。较佳地，该细菌辨识凝集素系自三棘鲎血细胞中所获得之鲎细菌辨识凝集素；更佳地，该细菌辨识凝集素系由SEQIDNO2所示之氨基酸序列组成。在一较佳实施例中，该重组。
15、蛋白系由SEQIDNO3所示之氨基酸序列组成。在另一实施例中，该重组蛋白系由SEQIDNO4所示之氨基酸序列组成。0013本发明进一步提供一种在一样本中检测病原体的方法，包含将该样本与经标记物质标记之上述重组蛋白接触以形成一被标记的重组蛋白病原体复合物，并测量该复合物之标记物质以检测病原体。较佳地，该样本中的病原体表面含有脂磷壁酸、脂多糖或由说明书CN104163869A3/8页5鼠李糖鼠李糖、鼠李糖N乙酰甘露糖胺、N乙酰甘露糖胺鼠李糖、鼠李糖半乳糖或半乳糖鼠李糖或彼等之任何组合所组成之病原体相关分子模式PAMP。在一较佳实施例中，该病原体为细菌。较佳地，该细菌系选自由沙门氏菌种SALMONE。
16、LLASPECIES、产酸克雷伯氏菌KLEBSIELLAOXYTOCA、克雷伯氏肺炎菌KLEBSIELLAPNEUMONIAE、克雷伯氏菌KLEBSIELLAI714、鲍氏不动杆菌ACINETOBACTERBAUMANNII、绿脓杆菌PSEUDOMONASAERUGINOSA、肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIAE、李斯特单胞菌LISTERIAMONOCYTOGENES、大肠杆菌ESCHERICHIACOLI、伤寒杆菌SALMONELLAENTERICASEROVARTYPHIMURIUM、粘质沙雷氏菌SERRATIAMARCESENS、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCC。
17、USAUREUS、粪炼球菌STREPTOCOCCUSFAECALIS、粪肠球菌ENTEROCOCCUSFAECALIS、志贺氏菌种SHIGELLASPECIES、霍乱弧菌VIBRIOCHOLERAE、转糖链球菌STREPTOCOCCUSMUTANS、蜡样芽孢杆菌BACILLUSCEREUS及其孢子、苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS及其孢子、炭疽芽孢杆菌BACILLUSANTHRACIS及其孢子、彼尔姆短杆菌BREVIBACTERIUMPERMENSEVKMAC2280、结核杆菌MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS及炭疽杆菌BACILLUSANTHRACIS。
18、所组成之群组。更佳地，该细菌系选自由C群沙门菌SALMONELLASEROGROUPC、产酸克雷伯氏菌KLEBSIELLAOXYTOCA、鲍氏不动杆菌ACINETOBACTERBAUMANNII、绿脓杆菌PSEUDOMONASAERUGINOSA、19F型肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIAESEROTYPE19F、19A型肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIAESEROTYPE19A、19B型肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIAESEROTYPE19B、23F型肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIAESEROTYPE23F、。
19、绿脓杆菌PSEUDOMONASAERUGINOSAPAO1株、李斯特单胞菌LISTERIAMONOCYTOGENES、大肠杆菌ESCHERICHIACOLI、伤寒杆菌SALMONELLAENTERICASEROVARTYPHIMURIUM、粘质沙雷氏菌SERRATIAMARCESENS、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS、粪炼球菌STREPTOCOCCUSFAECALIS及粪肠球菌ENTEROCOCCUSFAECALIS所组成之群组。在一较佳实施例中，该重组蛋白系由氨基酸序列SEQIDNO3组成。在另一实施例中，该重组蛋白系由氨基酸序列SEQIDNO4组成。0014本发明还。
20、提供一种将样本中内毒素移除方法，其包含以下步骤A将上述之重组蛋白与一被直接或非特异性地固定于一固态载体样本培育或接触，其中该重组蛋白能结合内毒素形成一重组蛋白与内毒素的复合物，及B将该复合物与该样本分离。0015本发明更提供一检测样本中内毒素或类内毒素物质存在的方法，其包含将该样本与经标记物质标记之上述重组蛋白接触以形成一被标记的重组蛋白内毒素复合物，并测量该复合物中标记物质以检测内毒素。较佳地，该内毒素或类内毒素物质系选自内毒素或微生物如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌、真菌、酵母菌及藻类的表面抗原。0016本发明更提供一种在样本中测定包含鼠李糖鼠李糖、鼠李糖N乙酰甘露糖胺、N乙酰甘露糖胺鼠李糖、鼠。
21、李糖半乳糖或半乳糖鼠李糖的病原体相关分子模式存在的方法，其包含将该样本与经标记物质标记之上述重组蛋白接触形成一被标记的重组蛋白病原体相关分子模式复合物，并测量该复合物中之标记物质以检测病原体相关分子模式。0017本发明更提供一种在有需要的病患中预防及/或治疗与病原体感染有关的病况的方法，其包含向该病患施用一药学有效量之包含上述重组蛋白之组合物，其中该重组蛋说明书CN104163869A4/8页6白作用为包含鼠李糖鼠李糖、鼠李糖N乙酰甘露糖胺、N乙酰甘露糖胺鼠李糖、鼠李糖半乳糖或半乳糖鼠李糖的病原体相关分子模式的拮抗物。0018本发明更提供本发明之重组蛋白做为医药，于医疗、公共或私人环境做为抑菌。
22、剂，于食品工业、动物饲料或化妆品工业作为针对细菌污染之去污染剂，作为针对被细菌污染过表面的表面活性剂，或于医疗、食品或饲料诊断或环境诊断做为诊断工具之用途。附图说明0019图1显示重组细菌辨识凝集素RBRL的纯化分析。0020以01MM之异丙基D硫代半乳糖苷IPTG诱导并于16下培养16小时后，经由离心收集含有重组细菌辨识凝集素的细胞溶解物上清液并置于镍离子结合亲和性层析管柱加以纯化。将每一分层之等分试样以15W/V之十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE分析。0021M道分子量标记物；N道未经异丙基D硫代半乳糖苷IPTG诱导之大肠杆菌细胞溶解物；I道经异丙基D硫代半乳糖苷诱导之大肠杆。
23、菌细胞溶解物；P道细菌均质后之不可溶之沉淀物；S道细菌均质后之上清液；F道纯化后流出之上清液；W1道含20MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐TRISHCL、200MM氯化钠、5MM咪唑清洗管柱之流出液；W2道含20MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200MM氯化钠、50MM咪唑的清洗管柱之流出液；E道含20MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200MM氯化钠、300MM咪唑洗提的纯化蛋白质；C道浓缩后的纯化蛋白质。0022图2A及2B显示重组细菌辨识凝集素RBRL对病原体相关分子模式PAMP的结合活性。0023将总量为05G之脂多糖或脂磷壁酸涂于固定于微孔盘并以1M重组细菌辨识凝集素检测。使用抗HIS单克隆抗体1比。
24、5000检测与脂多糖或脂磷壁酸结合之重组细菌辨识凝集素。空白组BLANK表示加入缓冲液而非重组细菌辨识凝集素的孔洞。所有数据皆为三次实验平均。误差条显示三次实验之标准差P0001。0024图3显示重组细菌辨识凝集素RBRL对革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌的结合活性。0025将细菌细胞以每孔5107个细胞接种然后将1M重组细菌辨识凝集素置入固定有细菌细胞的微孔盘。接着使用抗HIS单克隆抗体1比5000检测与细菌细胞结合之重组细菌辨识凝集素。空白组BLANK表示加入缓冲液而非重组细菌辨识凝集素的孔洞。所有数据皆为三次实验平均。误差条显示三次实验之标准差P0001。0026图4A及4B显示重组细菌辨识凝。
25、集素RBRL对临床分离病原体之辨识。0027将细菌细胞以每孔5107个细胞接种，然后将1M重组细菌辨识凝集素置入固定有细菌细胞的微孔盘。接着使用抗HIS单克隆抗体1比5000检测与细菌细胞结合之重组细菌辨识凝集素。空白组BLANK表示加入缓冲液而非重组细菌辨识凝集素的孔洞。以1M重组细菌辨识凝集素结合于绿脓杆菌PSEUDOMONASAERUGINOSAPAO1之脂多糖的量作为正对照组及代表100的结合力。所有数据皆为三次实验平均。0028图5显示重组细菌辨识凝集素RBRL对绿脓杆菌PSEUDOMONASAERUGINOSA生长的抑制作用。说明书CN104163869A5/8页70029将细菌细。
26、胞于LB培养基中于37培养一整夜。将细胞稀释100倍后继代培养并使其于37生长4小时。将25L浓度为每毫升1106个细胞的细菌与25L之0M、1875M、375M、75M及15M回溶于磷酸钠缓冲液PH值为74之重组细菌辨识凝集素混合并使其于37培养4小时。取四分之一稀释浓度的该培养混合物涂在培养盘以并于隔天计算其菌落形成单位CFU。与对照组0M重组细菌辨识凝集素比较，以菌落数的减少来计算细胞死亡率。数据代表三次实验的平均且误差条显示三次实验之标准差P0001。具体实施方式0030本发明可能以不同的形式实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。0031实。
27、施例10032材料与方法0033试剂0034使用大肠杆菌TOP10FINVITROGEN来建立载体并操作DNA，使用大肠杆菌表达型ROSETTADE3STRATAGENE、购于NOVAGEN之PET23A载体来表达蛋白质。产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENESATCC13048、李斯特单胞菌LISTERIAMONOCYTOGENESATCC7644、B群副痢疾杆菌SHIGELLAFLEXNERIGROUPBATCC12022、奇异变型杆菌PROTEUSMICRABILISATCC7002、粘质沙雷氏菌SERRATIAMARCESENSATCC8100及金黄色葡萄球菌STAPHYL。
28、OCOCCUSAUREUSATCC33591系购自台湾的启新生物科技公司。绿脓杆菌PSEUDOMONASAERUGINOSAPAO1及克雷伯氏肺炎菌KLEBSIELLAPNEUMONIAECG43为张晃猷博士国立清华大学，生命科学院，新竹，台湾热心提供。大肠杆菌O26B6、大肠杆菌O55B5、绿脓杆菌PAO1、伤寒杆菌SALMONELLAENTERICASEROVARTYPHIMURIUM脂多糖、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS及粪炼球菌STREPTOCOCCUSFAECALIS脂磷壁酸系购自于SIGMA。所有其余缓冲液及试剂均为最高之商业纯度。0035蛋白质表达及纯化0。
29、036用引物5NDEIANPSEQIDNO5及3ECORIANPSEQIDNO6以聚合酶链锁反应PCR扩增编码SEQIDNO1之DNA片段。编码重组细菌辨识凝集素SEQIDNO2之DNA片段系用来自三棘鲎RNA所反转录之CDNA以聚合酶链锁反应扩增，并使用引物5ECORIBRLSEQIDNO7及3NOTIBRL6HISSEQIDNO8。将两种纯化的聚合酶链锁反应产物分别用NDE/ECORI及ECORI/NOT限制酶切，并连接至用相同限制酶处理过的PET23A载体。确定该重组质粒序列后，将其转化至大肠杆菌TOP10F并以含100G/ML氨苄青霉素AMPICILLIN的琼脂平板筛选。将筛选盘上所挑。
30、起的单一菌落置于含有相同浓度抗生素的5毫升LBLURIABERTANI培养液1胰化蛋白、05酵母菌提取物及05氯化钠在37使其生长一夜以备提取质粒。再将提取出的质粒转化至大肠杆菌表达型ROSETTADE3并以含100G/ML氨苄青霉素的琼脂平板筛选。将单一菌落挑起并置于1公升之LB培养液中在37使其生长至600NM波长处的吸光值OD600达到04至06。加入异丙基D硫代半乳糖苷至最终浓度为01MM并于16培养16小时诱导蛋白质表达。在4以4000XG离心10分钟以收集细胞，并以磷酸盐缓冲液PBS清洗一次。接着，说明书CN104163869A6/8页8使细胞沉淀物悬浮于50ML添加有蛋白酶抑制剂。
31、1MM苯甲基磺酰氟PMSF的50ML平衡缓冲液20MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200MM氯化钠、5MM咪唑、PH值为74并于每平方英寸15000磅之压力下通过一细胞均质机CELLHOMOGENIZER3次以将其破碎。在4以16000XG离心30分钟使细胞溶解物分成上清液及沉淀物。用NISEPHAROSETM6FASTFLOWGEHEALTHCARE层析管柱纯化上清液。先用平衡缓冲液将管柱预先平衡并于加载样本结束时以50ML平衡缓冲液W1及50ML清洗缓冲液20MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200MM氯化钠、50MM咪唑、PH值为74W2清洗。用洗堤缓冲液20MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200MM。
32、氯化钠、300MM咪唑、PH值为74将管柱上之目标蛋白洗脱及回收。最后将洗脱之重组细菌辨识凝集素浓缩并将缓冲液换成TRIS缓冲液20MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200MM氯化钠、PH值为74。0037与细菌及病原体相关分子模式结合的酶联免疫吸附试验ELISA0038将回溶于缓冲液用于细菌之氯仿与乙醇混合物19V/V及用于脂多糖/脂磷壁酸之01M碳酸钠碳酸氢钠缓冲液PH值为96并连续稀释成所示浓度之50L细菌每孔5107个细胞、脂多糖或脂磷壁酸的悬浮液加入96孔微孔盘内并于4培养一夜。在波长600NM的光密度下以一光谱仪HITACHIU3310测量该培养液的散射光以测定培养液中的细菌浓度。将01。
33、光密度单位定为约等同于每毫升含有108个细菌。将固定有细菌或病原体相关分子模式的微孔盘用冲洗缓冲液含005TWEEN20之磷酸盐缓冲液PBST清洗3次，并将未结合之区域以封闭缓冲液含3脱脂乳之PBST于37封闭2小时。之后，于每一孔中加入50微升1M纯化重组细菌辨识凝集素并于37培养15小时。以纯化蛋白质之平衡缓冲液加入另一微孔作为负对照组。以冲洗缓冲液清洗3次后，于每一孔中加入抗HIS单克隆抗体CLONTECH15000并于37培养1小时。接着，以冲洗缓冲液清洗3次，于每一孔中加入与辣根过氧化物酶HORSERADISHPEROXIDASE结合之抗小鼠免疫球蛋白GIGG单克隆抗体JACKSON。
34、15000并于37培养30分钟。之后以冲洗缓冲液清洗3次再于每一孔中加入100L之3,35,5四甲基联苯胺TMB底物KPL并于37培养15分钟。最后，加入100L之2NH2SO4以终止该反应。以光谱仪THERMO读取于450NM的吸光值。0039抗细菌活性分析0040将绿脓杆菌PAO1、李斯特单胞菌LISTERIAMONOCYTOGENES及金黄色葡萄球菌于LB培养液37培养一夜。将该细菌继代培养1100并于37培养4小时。将细菌离心收集并以10MM磷酸钠缓冲液PH值为74清洗3次。以分光光度法在波长600NM测定细胞数。将25L浓度为每毫升106个细胞的细菌与25L之0M、046875M、0。
35、9374M、1875M、375M、75M及15M溶解于磷酸钠缓冲液PH值为74之重组细菌辨识凝集素混合并使其于37培养4小时。将1/4的菌液涂置于LB琼脂平板上并于37培养16小时。与对照组比较，观察减少的菌落数可计算出细胞死亡率。0041结果0042重组细菌辨识凝集素的表达与纯化0043重组细菌辨识凝集素系由一氨基端的人工肽及一羟基端的自三棘鲎获得之鲎细菌辨识凝集素所组成。编码人工肽及细菌辨识凝集素之DNA片段个别连接至PET23A载体且将该重组质粒转化至大肠杆菌ROSETTADE3以表达蛋白质。自1公升培养液中，可经由说明书CN104163869A7/8页9NICKEL亲和性层析管柱纯化获。
36、得约6MG之重组细菌辨识凝集素，其回收率为806图1。产量比嗜甲醇酵母菌所生产之BRL6HIS高5倍，表示融合于细菌辨识凝集素氨基端之人工肽成功促进重组细菌辨识凝集素的表达与纯化。0044重组细菌辨识凝集素对脂多糖的结合0045先前由嗜甲醇酵母菌KM71表达之BRL6HIS是经由大肠杆菌O26B6脂多糖琼脂糖凝胶CL4B纯化，表示细菌辨识凝集素可结合至大肠杆菌O26B6脂多糖。为了确认重组细菌辨识凝集素对脂多糖及脂磷壁酸的结合活性，藉由ELISA测试4种来自大肠杆菌O26B6、大肠杆菌O55B5、绿脓杆菌PAO1及伤寒杆菌的脂多糖及2种来自金黄色葡萄球菌及粪炼球菌的脂磷壁酸。如图2A及2B所示。
37、，重组细菌辨识凝集素明显结合于所有4种脂多糖及2种脂磷壁酸，表示将人工肽融合在细菌辨识凝集素的氨基端并不会影响细菌辨识凝集素对脂多糖或脂磷壁酸的结合能力。0046重组细菌辨识凝集素对革兰氏阴性及革兰氏阳性菌的结合0047为了更进一步确认重组细菌辨识凝集素对革兰氏阴性菌的结合，在此使用细菌结合ELISA来测试7种包括绿脓杆菌、副痢疾杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、粘质沙雷氏菌及大肠杆菌TOP10F的不同革兰氏阴性菌及2种包括金黄色葡萄球菌及李斯特单胞菌的革兰氏阳性菌。图3显示重组细菌辨识凝集素明显且选择性地结合至革兰氏阴性绿脓杆菌及革兰氏阳性李斯特单胞菌。0048重组细菌辨识凝集。
38、素对临床分离之病原体的辨识0049了解重组细菌辨识凝集素与特定细菌及病原体之间的互动可引领新式诊断策略的开发，以检测微生物病原体如临床上的感染菌例如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎菌、肠道沙门氏菌SALMONELLAENTERICA等。在此数种临床分离的微生物病原体被用以测试重组细菌辨识凝集素对病原体的结合活性。如图4A所示，重组细菌辨识凝集素可辨识产酸克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌及绿脓杆菌之革兰氏阴性菌，尤其是产酸克雷伯氏菌KO4、KO5及鲍氏不动杆菌AB199，以及绿脓杆菌C1、C2、C4、C6及C8。至于革兰氏阳性菌，重组细菌辨识凝集素可特异性辨识19B与19F血清型肺炎链球菌图4B。。
39、0050重组细菌辨识凝集素对病原体的生长抑制效用0051为了探讨重组细菌辨识凝集素的抑菌活性，以绿脓杆菌PAO1、李斯特单胞菌ATCC7644及金黄色葡萄球菌ATCC33591进行测试。将25L浓度为每毫升1106个细胞的细菌与25L之0M只有缓冲液、046875M、09365M、1875M、375M、75M或15M回溶于磷酸钠缓冲液PH值为74之重组细菌辨识凝集素混合并使其于37培养4小时。将1/4体积的该培养混合物涂抹于培养盘中以分析重组细菌辨识凝集素对细菌的生长抑制活性。图5显示重组细菌辨识凝集素以剂量依赖的方式抑制绿脓杆菌的生长，且其半数致死浓度LC50为4305M。0052脂多糖为革。
40、兰氏阴性菌外膜的主要组成物，其系一种两性大分子，经由共价键结合的一疏水性脂质及一亲水性多糖组成。先前文献指出某些脂多糖上的O抗原可作为重组细菌辨识凝集素的特异性配体。有趣的是，比较可被重组细菌辨识凝集素所结合之细菌病原体相关分子模式之化学结构表1，显示鼠李糖鼠李糖、鼠李糖N乙酰甘露糖胺、N乙酰甘露糖胺鼠李糖、鼠李糖半乳糖或半乳糖鼠李糖之组成为病原体相关分子模式部份的常见组成，因此它们被视为是重组细菌辨识凝集素结合至这些脂多糖所需的配说明书CN104163869A8/8页10体。0053表100540055一个熟知此领域技艺者能很快体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到之结果及优点，以及那些。
41、存在于其中的东西。本发明中之肽、重组蛋白、其制造程序与方法及其用途乃较佳实施例的代表，其为示范性且不仅局限于本发明领域。熟知此技艺者将会想到其中可修改之处及其它用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在申请专利范围中界定。0056本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，得使任何熟习此技艺者能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明之精神及范围。0057说明书中提及之所有专利及出版品，都以和发明有关领域之一般技艺为准。所有专利和出版品都在此被纳入相同的参考程度，就如同每一个个别出版品都被具体且个别地指出纳入参考。0058在此所适当地举例说明之发明，可能得以。
42、在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书之描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明之特点或其部份之名词及表达，但需认清的是，在本发明的专利申请范围内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据较佳实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是熟知此技艺者仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明之申请专利范围内。说明书CN104163869A101/4页1100010002序列表CN104163869A112/4页120003序列表CN104163869A123/4页130004序列表CN104163869A134/4页14序列表CN104163869A141/5页15图1说明书附图CN104163869A152/5页16图2说明书附图CN104163869A163/5页17图3说明书附图CN104163869A174/5页18图4说明书附图CN104163869A185/5页19图5说明书附图CN104163869A19。