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1、10申请公布号CN104099415A43申请公布日20141015CN104099415A21申请号201410289345322申请日20140624C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人中国科学院南海海洋研究所地址510301广东省广州市新港西路164号72发明人何毛贤李琴74专利代理机构广州科粤专利商标代理有限公司44001代理人刘明星54发明名称一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用57摘要本发明公开了一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用。检测引物包括ASSN815FITCCATCGTGGACAAACGTGT。
2、AA；ASSN815RIGTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；ASSN815FOTAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；ASSN815ROAATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。利用本发明的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，能够扩增出肌肉生长抑制素基因的SNP位点，该位点显著与肌肉重量相关联，再根据PCR扩增电泳图可直观地比较个体间闭壳肌重的大小，可直接用于后续的分子标记辅助育种，如可在生长早期筛选目标性状，进而筛选特定的个体进行品种培育。51INTCL权利要求书1页说明书3页序列表2页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申。
3、请权利要求书1页说明书3页序列表2页附图1页10申请公布号CN104099415ACN104099415A1/1页21一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，其特征在于，包括ASSN815FITCCATCGTGGACAAACGTGTAA；ASSN815RIGTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；ASSN815FOTAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；ASSN815ROAATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。2一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记，其特征在于，其特异性检测引物为ASSN815FITCCATCGTGGACAAACGTGTAA。
4、；ASSN815RIGTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；ASSN815FOTAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；ASSN815ROAATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。3与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在鉴定马氏珠母贝闭壳肌重大小中的应用，其特征在于，包括以下步骤A、提取马氏珠母贝样品基因组DNA；B、采用权利要求1所述的检测引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO对马氏珠母贝样品基因组DNA进行PCR扩增；C、根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行鉴定，当出现具有207BP和180BP大小2条带的为A。
5、G型，个体为闭壳肌重小的样品；当只出现180BP大小1条带的为GG型，个体为闭壳肌重大的个体。4根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为125LPCR反应体系如下包含马氏珠母贝样品基因组DNA40NG，1PCRMIXTURE，检测引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO各05M，0125UTAQDNA酶，余量为水；反应条件为94，5MIN；9435S，6240S；7240S，5个循环；9435S，6040S，7240S，15个循环；9435S，5840S，7240S，15个循环72延伸10MIN。5权利要求2所述的与马。
6、氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在马氏珠母贝分子标记辅助育种中的应用。权利要求书CN104099415A1/3页3一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用技术领域0001本发明属于水产动物遗传及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用。背景技术0002马氏珠母贝是我国及世界上海水珍珠养殖的主要物种。我国自1965年成功地开展了马氏珠母贝人工育苗以来，海水珍珠产业发展迅速，已成为广东、广西及海南部分沿海地区海水养殖支柱产业之一。近10多年，我国海水珍珠的质量和产量明显下降，国际竞争力减弱，养殖经济效益下滑。就其原因，除了。
7、养殖环境恶化、养殖技术落后外，还有一个重要原因是多年来不注重种贝的选育和保留，缺乏优良品种；种苗质量参差不齐，育珠母贝性状退化，如生长慢、个体小型、育珠能力减弱等。为了我国海水珍珠养殖业的健康稳定发展，培育适合我国海区养殖的马氏珠母贝优良品种已迫在眉睫。0003育种技术有杂交、选择育种，生物技术育种及分子育种等多种方法。分子育种是目前国内外研究的热点，是育种技术发展的主要方向，它具有高效、快捷的特点。分子育种离不开分子标记的开发，用在海洋贝类遗传育种研究的分子标记主要有限制片段长度多态性RFLP、随机扩增多态性DNARAPD、扩增片段长度多态性AFLP、锚定简单重复序列ISSR、简单重复序列S。
8、SR、单核苷酸多态性SNP、表达序列标签EST、线粒体DNAMTDNA、核糖体DNA内转录间隔区标记ITS分子标记等。QIU等对合浦珠母贝不同群体进行ESTSSR标记与生长及珍珠层性状的关联分析，结果表明在野生群体中基因PMARTE05、PMARTE35与壳高、总重显著相关，基因PMARTE64与珍珠层厚度显著相关，在养殖群体中发现基因PMARTE05与壳高显著的相关。CONG等利用SNP标记研究太平洋牡蛎的胰岛素相关多肽基因OIRP的多态性与生长性状的关联分析，发现在OIRP基因15KB处发现31个SNPS，其中6个与生长性状显著相关，特别是标记T1358G和标记G1437A与壳高、壳长、壳。
9、宽、总重、软体部重5个生长性状显著相关。发明内容0004本发明的第一个目的是提供一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物。0005本发明的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，其特征在于，包括0006ASSN815FITCCATCGTGGACAAACGTGTAA；0007ASSN815RIGTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；0008ASSN815FOTAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；0009ASSN815ROAATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。0010本发明的第二个目的是提供一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记，其。
10、特说明书CN104099415A2/3页4征在于，其特异性检测引物为0011ASSN815FITCCATCGTGGACAAACGTGTAA；0012ASSN815RIGTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；0013ASSN815FOTAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；0014ASSN815ROAATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。0015本发明的第三个目的是提供与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在鉴定马氏珠母贝闭壳肌重大小中的应用，其特征在于，包括以下步骤0016A、提取马氏珠母贝样品基因组DNA；0017B、采用上述引物ASSN815FI、ASS。
11、N815RI、ASSN815FO、ASSN815RO对马氏珠母贝样品基因组DNA进行PCR扩增；0018C、根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行鉴定，当出现具有207BP和180BP大小2条带的为AG型，个体为闭壳肌重小的样品；当只出现180BP大小1条带的为GG型，个体为闭壳肌重大的个体。0019优选，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为125LPCR反应体系如下包含马氏珠母贝样品基因组DNA40NG，1PCRMIXTURE，引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO各05M，0125UTAQDNA酶，余量为水；反应条件为94，5MIN；9435S，。
12、6240S；7240S，5个循环；9435S，6040S，7240S，15个循环；9435S，5840S，7240S，15个循环72延伸10MIN。0020本发明的第四个目的是提供与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在马氏珠母贝分子标记辅助育种中的应用。0021利用本发明的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，能够扩增出肌肉生长抑制素基因的SNP位点，该位点显著与肌肉重量相关联，再根据PCR扩增电泳图可直观地比较个体间闭壳肌重的大小，可直接用于后续的分子标记辅助育种，如可在生长早期筛选目标性状，进而筛选特定的个体进行品种培育。附图说明0022图1是与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SN。
13、P标记的扩增电泳图，其中泳道112为马氏珠母贝样品，M为MARKER。具体实施方式0023以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。0024实施例10025随机取来至于同一群体的50个马氏珠母贝个体，清洗干净后，取其闭壳肌组织用电子天平称重并一一对应记录，然后取一小块闭壳肌组织置于95乙醇中，于20保存。使用HIPUREUNIVERSALDNAKIT广州美基生物公司对闭壳肌的基因组DNA进行提取，相关操作参见试剂盒说明书进行。DNA提取后，于10的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计测量DNA的浓度和纯度，于20保存。0026与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物。
14、为0027ASSN815FITCCATCGTGGACAAACGTGTAA；说明书CN104099415A3/3页50028ASSN815RIGTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；0029ASSN815FOTAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；0030ASSN815ROAATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC0031用上述引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO对马氏珠母贝样品基因组DNA在PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应体系如下扩增体系125UL，包含马氏珠母贝样品基因组DNA04L，625L2PCRMIXTU。
15、RE,10M引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO各05L,0125UTAQDNA酶广州东盛生物科技有限公司，双蒸水补足至125L。反应条件为94，5MIN；9435S，6240S；7240S，5个循环；9435S，6040S，7240S，15个循环；9435S，5840S，7240S，15个循环72延伸10MIN。PCR产物用3琼脂糖广州康龙科技生物公司凝胶电泳，用凝胶成像系统观察电泳图谱。分型电泳图如图1所示，出现具有207和180BP大小2条带的AG型泳道6和8，只出现180BP大小1条带的为GG型泳道24、7、912。在这50个个体中，AG型个体29个，肌肉重068034G，GG型个体有21个，闭壳肌重107037G。采用SPSS170软件中的单因素方差分析ONEWAYANOVA对SNP位点与肌肉重进行关联分析，GG型个体的闭壳肌重显著大于AG型个体P001，即认为它们之间具有极其显著的统计学差异。说明书CN104099415A1/2页600010002序列表CN104099415A2/2页7序列表CN104099415A1/1页8图1说明书附图CN104099415A。