一种Α珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用.pdf

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1、10申请公布号CN104120080A43申请公布日20141029CN104120080A21申请号201410376846522申请日20140801C12M1/34200601C12Q1/6820060171申请人厦门大学地址361005福建省厦门市思明南路422号申请人厦门致善生物科技有限公司72发明人黄秋英李庆阁王旭东74专利代理机构厦门南强之路专利事务所普通合伙35200代理人马应森54发明名称一种珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用57摘要一种珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用，涉及蛋白基因突变检测。所述珠蛋白基因突变检测试剂盒设有盒体、扩增试剂瓶和对照试剂瓶，所述。

2、扩增试剂瓶和对照试剂瓶设在盒体内。制备方法1制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HBAPCR混合液和HBA酶混合液；2制备对照试剂，所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照；3将步骤1制备的扩增试剂和步骤2制备的对照试剂设在盒体内，即得珠蛋白基因突变检测试剂盒。所述珠蛋白基因突变检测试剂盒可在检测珠蛋白基因突变中应用。简便快速、单反应可检测多个位点、耗时短，检测通量高，检测特异性高、结果容易判读。51INTCL权利要求书3页说明书7页序列表2页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书7页序列表2页附图3页10申请公布号CN104120080ACN104120。

3、080A1/3页21珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、盒盖、HBAPCR混合液瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶，隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上，HBAPCR混合液瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶分别插入隔板上的瓶孔内；HBAPCR混合液瓶内装有HBAPCR混合液，HBA酶混合液瓶内装有HBA酶混合液，HBA标准对照瓶内装有HBA标准对照，HBA阴性对照瓶内装有HBA阴性对照。2如权利要求1所述珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述HBAPCR混合液包括1PCR缓冲液，30MMMGCL2，DATP、DCTP、DGTP、DTTP、。

4、DUTP各02MM，004MM2珠蛋白基因扩增引物F1、004M内参基因扩增引物F2，04M2珠蛋白基因扩增引物R1、04M内参基因扩增引物R2，02M荧光探针P1、02M荧光探针P2、02M荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/LTAQDNA聚合酶，01U/LUNG酶。3如权利要求2所述珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述扩增引物的长度为1540BP的寡核苷酸链，TM为5070；所述内参基因为保守基因G6PD基因。4如权利要求2所述珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述2珠蛋白基因扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为5GGGCCTGGGCCGCACT3；所述2珠蛋白基因扩增引物R1。

5、为下游引物，其碱基序列为5CAGGAAGGGCCGGTGCAA3；所述内参基因扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为5CCTTTCTTCCACCAGACAGC3；所述内参基因扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为5GCTCAACTTAGCAGAGCCT3。5如权利要求2所述珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标；荧光探针可为5末端和3末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针；荧光基团可为ALEX350、FAM、VIC、TET、CALFLUORGOLD540、JOE、HEX、CALFL。

6、OURORANGE560、TAMRA、CALFLUORRED590、ROX、CALFLUORRED610、TEXASRED、CALFLOURRED635、QUASAR670、CY3、CY5、CY55或QUASAR705；淬灭基团可为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE或TAMRA；荧光探针的长度可为1540BP的寡核苷酸链，TM为5080，GC含量4070。6如权利要求2所述珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针P1的碱基序列为5FAMCGGTGCACGCCTCCCCGGACAAGTTBHQ13；所述荧光探针P2的碱基序列为5HEXCGTGCCTGCTCCATGCCTCAGCAC。

7、GBHQ13；所述荧光探针P3的碱基序列为5ROXTGCTGACCTCCAAATACCGTCAAGCBHQ23。7如权利要求2所述珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于HBA标准对照为正权利要求书CN104120080A2/3页3常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA；所述HBA阴性对照不含目的基因片段，采用无菌水或TRISHCL缓冲液；所述PCR缓冲液可为1PCR缓冲液。8如权利要求1所述珠蛋白基因突变检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤1制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HBAPCR混合液和HBA酶混合液；所述HBAPCR混合液包括1PCR缓冲液，30MMMGCL2，DATP、DCT。

8、P、DGTP、DTTP、DUTP各02MM，004MM2珠蛋白基因扩增引物F1、004M内参基因扩增引物F2，04M2珠蛋白基因扩增引物R1、04M内参基因扩增引物R2，02M荧光探针P1、02M荧光探针P2、02M荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/LTAQDNA聚合酶，01U/LUNG酶；所述扩增引物的长度为1540BP的寡核苷酸链，TM为5070；2制备对照试剂，所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照；3将步骤1制备的扩增试剂和步骤2制备的对照试剂设在盒体内，即得珠蛋白基因突变检测试剂盒。9如权利要求1所述珠蛋白基因突变检测试剂盒在检测珠蛋白基因突变中的应用。10如权利要求。

9、9所述应用，其特征在于其具体操作步骤如下1PCR扩增和熔解曲线分析，具体方法如下1试剂准备配液区首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温，PCR反应液配液标准为取N198LHBAPCRMIX和N02LHBA酶混合液加入到15ML离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心，PCR反应液应即配即用，隔夜使用需18以下贮存，其中，N根据反应管数确定，所述离心可采用3000RPM瞬时离心5S；PCR反应液的分装PCR反应液分别以每管20L分装于PCR薄壁反应管；将配制好的PCR反应管转移至提取间，贮存于18以下冰箱储存直至样本提取完；2样品的加样模板间用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入5L相应的待检DNA。

10、样本、HBA标准对照和HBA阴性对照，并立即盖严管盖；将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区；3PCR扩增和熔解曲线分析扩增区PCR扩增程序为第一步502MIN，9510MIN；第二步9515S655615S7620S，10个循环，其中655615S每个循环下降1；第三步9515S5515S7620S，50个循环；熔解曲线分析程序为951MIN353MIN4085，其中4085以04/5S的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX的荧光信号；程序运行完毕，将PCR薄壁反应管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理；权利要求书CN104120080A。

11、3/3页42结果判读，具体方法如下根据荧光PCR熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的TM值的变化进行判断待检样本是否含有2珠蛋白基因突变，以及基因突变的类型，其中涉及待测样本和标准对照熔点值的读取，标准对照作为校正，用来减少仪器和操作而引起的熔点误差，数据分析按以下步骤进行1读取标准对照在各检测通道的熔解峰的TM值；2读取待检测样本在各检测通道的TM值；3将待检测在各检测通道的TM值减去野生型对照在各检测通道对应的TM值，得到各通道的TM值，如表1所示；表1由表1判断待检是否含有突变，以及突变的类型。权利要求书CN104120080A1/7页5一种珠蛋白基因突变检测试剂盒及。

12、其制备方法与应用技术领域0001本发明涉及蛋白基因突变检测，尤其是涉及一种珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用。背景技术0002珠蛋白基因突变在人类基因组中较为常见，其基因突变包括单碱基或少数碱基的转换、颠换、插入、缺失等多种类型。在珠蛋白基因簇中，1珠蛋白基因和2珠蛋白基因是两个高GC含量且高度同源性的基因，且两个基因编码的多肽链序列完全相同，而珠蛋白基因突变可以导致所编码的珠蛋白表达降低，从而导致地贫等一系列生物学性状改变。因此，对珠蛋白基因突变的检测有重要的生物学意义。潘干华等潘干华,等广东南海地区非缺失型地中海贫血分子流行病学调查国际检验医学杂志,2014,3515657报道了广。

13、东南海地区非缺失型地中海贫血分子流行病学调查，指出中国人群的珠蛋白基因突变主要有三种形式C369CG、C377TC和C427TC，且均发生在2珠蛋白基因上。0003目前，常用于珠蛋白基因突变检测主要是基于PCR的一系列方法，如反向点杂交法REVERSEDOTBLOT,RDB、等位基因特异性PCR、PCRSSCP、变性高效液相色谱DHPLC、焦磷酸测序PYROSEQUENCING、SANGER测序法等。其中反向斑点杂交是目前使用较为广泛的珠蛋白基因突变检测方法，该方法属于一种异相的突变检测方法，需要对PCR产物进行后续处理，操作步骤较多，容易引起污染，并且结果判读易受主观因素影响。ARMSPCR。

14、检测的通量十分有限，而且需要PCR后处理，容易出现污染造成假阳性结果的发生。DHPLC对仪器要求设备高，应用性不强。PCRSSCP对实验条件要求严格，只能检测突变是否存在，对于突变的具体位置和类型还需要进一步的测序，且由于某些点突变类型对单链DNA的空间构象改变小，容易漏检。焦磷酸测序、SANGER测序虽然原理不同，但均是通过PCR扩增后再进行PCR产物测序，操作步骤繁琐，花费时间长，仪器设备昂贵，不能满足基因突变检测所需快速、简便的要求。0004熔解曲线DISSOCIATIONCURVE是指随温度升高反映DNA的双螺旋结构解链的曲线。总的DNA双螺旋结构解链一半的温度称为熔解温度，即熔点TM。

15、，熔点是双链DNA固有的属性，不同序列的双链DNA，TM值不同，这与双链DNA的长度、碱基组成相关。在实时PCRREALTIMEPCR技术推出来之后，熔解曲线技术常用来分析基于荧光染料的实时PCR扩增的特异性，根据PCR产物的TM值的大小判定产物是目标产物还是非特异扩增产物。随着生物技术的发展，仪器设备分辨率的改进，目前基于荧光染料的熔解曲线技术已经发展成的高分辨熔解曲线HIGHRESOLUTIONMELTINGCURVE技术，该技术可以识别单个碱基的突变，SHIH等人HUNGCHANGSHIH,ETCDEVELOPMENTOFAHIGHRESOLUTIONMELTINGMETHODFORTH。

16、EDETECTIONOFHEMOGLOBINALPHAVARIANTSCLINICALBIOCHEMISTRY,2010,4378671676将该技术用于珠蛋白基因突变的快速检测，但由于该技术本身的局限性，只能对基因突变进行扫描，需要对突变样本进行测序验证，以确定突变的类型，说明书CN104120080A2/7页6且对DNA样本质量要求非常高，不太适合在各实验室的广泛推广应用。发明内容0005本发明的目的在于针对现有技术中存在的操作繁琐、耗时长、检测成本高、易污染及通量较低等缺点，提供一种简便快捷、灵敏度高、可靠性强、成本较低的基于荧光PCR熔解曲线技术的一种珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方。

17、法与应用。0006所述珠蛋白基因突变检测试剂盒设有盒体、隔板、盒盖、HBAPCR混合液瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶，隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上，HBAPCR混合液瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶分别插入隔板上的瓶孔内。0007HBAPCR混合液瓶内装有HBAPCR混合液，HBA酶混合液瓶内装有HBA酶混合液，HBA标准对照瓶内装有HBA标准对照，HBA阴性对照瓶内装有HBA阴性对照。0008所述扩增试剂包括HBAPCR混合液和HBA酶混合液；所述HBAPCR混合液包括1PCR缓冲液，30MMMGCL2，DATP、DCTP、DGTP、DTT。

18、P、DUTP各02MM，004MM2珠蛋白基因扩增引物F1、004M内参基因扩增引物F2，04M2珠蛋白基因扩增引物R1、04M内参基因扩增引物R2，02M荧光探针P1、02M荧光探针P2、02M荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/LTAQDNA聚合酶，01U/LUNG酶。0009所述扩增引物的长度为1540BP的寡核苷酸链，TM为5070。0010优选的，所述内参基因为保守基因G6PD基因。0011优选的，所述2珠蛋白基因扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为5GGGCCTGGGCCGCACT3SEQIDNO1。0012优选的，所述2珠蛋白基因扩增引物R1为下游引物，其碱基序列为5CAG。

19、GAAGGGCCGGTGCAA3SEQIDNO2。0013优选的，所述内参基因扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为5CCTTTCTTCCACCAGACAGC3SEQIDNO3。0014优选的，所述内参基因扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为5GCTCAACTTAGCAGAGCCT3SEQIDNO4。0015所述荧光探针可为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标等。0016优选的，荧光探针可为5末端和3末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。0017优选的，荧光基团可为ALEX350、FAM、VIC、TET、CALFLUORGO。

20、LD540、JOE、HEX、CALFLOURORANGE560、TAMRA、CALFLUORRED590、ROX、CALFLUORRED610、TEXASRED、CALFLOURRED635、QUASAR670、CY3、CY5、CY55或QUASAR705等。0018优选的，淬灭基团可为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE或TAMRA等。0019优选的，荧光探针的长度可为1540BP的寡核苷酸链，TM为5080，GC含量4070。0020优选的，所述荧光探针P1的碱基序列为5FAMCGGTGCACGCCTCCCCGGACAAGTTBHQ13SEQIDNO5。说明书CN104120080A3。

21、/7页70021优选的，所述荧光探针P2的碱基序列为5HEXCGTGCCTGCTCCATGCCTCAGCACGBHQ13SEQIDNO6。0022优选的，所述荧光探针P3的碱基序列为5ROXTGCTGACCTCCAAATACCGTCAAGCBHQ23SEQIDNO7。0023所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照。0024优选的，HBA标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA。0025所述HBA阴性对照不含目的基因片段，优选为无菌水或TRISHCL缓冲液。0026所述PCR缓冲液可以是1PCR缓冲液，也可以是其它类型的PCR缓冲液。0027所述珠蛋白基因突变检测试剂盒的制。

22、备方法，包括以下步骤00281制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HBAPCR混合液和HBA酶混合液；所述HBAPCR混合液包括1PCR缓冲液，30MMMGCL2，DATP、DCTP、DGTP、DTTP、DUTP各02MM，004MM2珠蛋白基因扩增引物F1、004M内参基因扩增引物F2，04M2珠蛋白基因扩增引物R1、04M内参基因扩增引物R2，02M荧光探针P1、02M荧光探针P2、02M荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/LTAQDNA聚合酶，01U/LUNG酶；所述扩增引物的长度为1540BP的寡核苷酸链，TM为5070；00292制备对照试剂，所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴。

23、性对照；00303将步骤1制备的扩增试剂和步骤2制备的对照试剂设在盒体内，即得珠蛋白基因突变检测试剂盒。0031所述珠蛋白基因突变检测试剂盒可在检测珠蛋白基因突变中应用，所述应用的具体操作步骤如下00321PCR扩增和熔解曲线分析，具体方法如下00331试剂准备配液区0034首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为取N198LHBAPCRMIXN根据反应管数确定和N02LHBA酶混合液加入到15ML离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心如3000RPM离心5S。PCR反应液应即配即用，隔夜使用需18以下贮存。0035PCR反应液的分装PCR反应液分别以每管20L分装于PCR薄。

24、壁反应管。0036将配制好的PCR反应管转移至提取间，贮存于18以下冰箱储存直至样本提取完。00372样品的加样模板间0038用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入5L相应的待检DNA样本、HBA标准0039对照和HBA阴性对照，并立即盖严管盖。0040将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。00413PCR扩增和熔解曲线分析扩增区0042PCR扩增程序可为0043第一步502MIN，9510MIN；0044第二步9515S655615S7620S，10个循环，其中655615S每个循环下降1；说明书CN104120080A4/7页80045第三步9515S5515S7620S，5。

25、0个循环；0046熔解曲线分析程序可为0047951MIN353MIN4085，其中4085以04/5S的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX的荧光信号。0048程序运行完毕，将PCR薄壁反应管闭管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。00492结果判读，具体方法如下0050根据荧光PCR熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的TM值的变化进行判断待检样本是否含有2珠蛋白基因突变，以及基因突变的类型。这其中涉及待测样本和标准对照熔点值的读取，标准对照作为校正，用来减少仪器和操作而引起的熔点误差。数据分析按以下步骤进行00511读取标准。

26、对照在各检测通道的熔解峰的TM值；00522读取待检测样本在各检测通道的TM值；00533将待检测在各检测通道的TM值减去野生型对照在各检测通道对应的TM值，得到各通道的TM值，参照表1，判断待检是否含有突变，以及突变的类型。0054表100550056本发明的基本原理是针对2珠蛋白基因和内参基因序列设计特异性扩增引物和2珠蛋白基因突变检测荧光探针和内参基因的检测荧光探针，将所有引物和探针均加入PCR反应管后，进行不对称PCR扩增，PCR扩增后产生大量可与相应荧光探针互补的单链产物，随后进行低温到高温的熔解曲线分析，在熔解曲线分析阶段，低温时各荧光探针与对应的PCR单链产物结合，形成异源双链，。

27、随着温度的升高，异源双链慢慢解链，其中荧光变化最快时的温度，即是异源双链的熔解温度，即熔点TM值。由于荧光探针与匹配程度不同靶形成的异源双链的稳定性不同，故其TM值亦有所不同，荧光探针与完全互补的靶形成的异源双链的熔点最高，与有一个或两个碱基错配的靶形成的异源双链的熔点较低，其熔点与错配碱基的类型、位置均有关系。0057本发明的有益效果是00581简便快速、单反应可检测多个位点、耗时短本发明在单个PCR体系中即可完成多种2珠蛋白基因突变的检测，PCR扩增结束后只需一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道的基因型，整个操作在23H即可完成，操作步骤少、耗时短；00592均相检测、闭管操作本发明为均相检。

28、测体系，PCR及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染的可能性；说明书CN104120080A5/7页900603检测通量高本发明基于荧光PCR熔解曲线技术，PCR之后只需运行一个简单的熔解曲线分析步骤在荧光PCR仪上40MIN以内完成即可完成，而PCR可以在普通仪器上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通PCR仪完成熔解曲线分析，故可以大大提高检测通量，提高荧光PCR仪的利用率；00614检测特异性高、结果容易判读本发明是通过熔解峰的熔点变化来判定突变与否，其中熔点由仪器自动判读，结果客观，不易出错，故检测特异性高。附图说明0062图1为本发明检测样本的。

29、流程图；0063图2为本发明检测实施例1样本的FAM荧光通道的熔解曲线结果图；0064图3为本发明检测实施例1样本的HEX荧光通道的熔解曲线结果图；0065图4为本发明检测实施例1样本的ROX荧光通道的熔解曲线结果图；0066图5为本发明所述珠蛋白基因突变检测试剂盒实施例结构组成示意图。具体实施方式0067以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。0068参见图5，本发明所述珠蛋白基因突变检测试剂盒实施例设有盒体1、隔板2、盒盖3、HBAPCR混合液瓶4、HBA酶混合液瓶5、HBA标准对照瓶6和HBA阴性对照瓶7，隔板2设在盒体1内，盒盖3设在盒体1上，HBAPCR混合液瓶4、HBA酶混合液。

30、瓶5、HBA标准对照瓶6和HBA阴性对照瓶7分别插入隔板2上的瓶孔内。0069HBAPCR混合液瓶4内装有HBAPCR混合液，HBA酶混合液瓶5内装有HBA酶混合液，HBA标准对照瓶6内装有HBA标准对照，HBA阴性对照瓶7内装有HBA阴性对照。0070所述扩增试剂包括HBAPCR混合液和HBA酶混合液；所述HBAPCR混合液包括1PCR缓冲液，30MMMGCL2，DATP、DCTP、DGTP、DTTP、DUTP各02MM，004MM2珠蛋白基因扩增引物F1、004M内参基因扩增引物F2，04M2珠蛋白基因扩增引物R1、04M内参基因扩增引物R2，02M荧光探针P1、02M荧光探针P2、02M。

31、荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/LTAQDNA聚合酶，01U/LUNG酶。0071所述扩增引物的长度为1540BP的寡核苷酸链，TM为5070。0072所述内参基因为保守基因G6PD基因。0073所述2珠蛋白基因扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为5GGGCCTGGGCCGCACT3SEQIDNO1。0074所述扩增引物2珠蛋白基因R1为下游引物，其碱基序列为5CAGGAAGGGCCGGTGCAA3SEQIDNO2。0075所述内参基因扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为5CCTTTCTTCCACCAGACAGC3SEQIDNO3。0076所述内参基因扩增引物R2为下游引物，其碱基序。

32、列为5GCTCAACTTAGCAGAGCCT3SEQIDNO4。0077所述荧光探针是那些与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但是不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标等。说明书CN104120080A6/7页100078荧光探针为5末端和3末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。0079荧光基团为ALEX350、FAM、VIC、TET、CALFLUORGOLD540、JOE、HEX、CALFLOURORANGE560、TAMRA、CALFLUORRED590、ROX、CALFLUORRED610、TEXASRED、CALFLOURRED635、QUASAR670。

33、、CY3、CY5、CY55或QUASAR705。0080淬灭基团为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE或TAMRA。0081荧光探针的长度为1540BP的寡核苷酸链，TM为5080，GC含量4070。0082所述荧光探针P1碱基序列为5FAMCGGTGCACGCCTCCCCGGACAAGTTBHQ13SEQIDNO5。0083所述荧光探针P2碱基序列为5HEXCGTGCCTGCTCCATGCCTCAGCACGBHQ13SEQIDNO6。0084所述荧光探针P3碱基序列为5ROXTGCTGACCTCCAAATACCGTCAAGCBHQ23SEQIDNO7。0085所述对照试剂包括HBA标准对。

34、照和HBA阴性对照。0086HBA标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA。0087所述HBA阴性对照不含目的基因片段，优选的为无菌水或TRISHCL缓冲液。0088所述PCR缓冲液可以是1PCR缓冲液，也可以是其它类型的PCR缓冲液。0089以下给出具体实施例0090实施例1利用本试剂盒检测已经基因型样本，考察试剂盒检测样本的特异性和准确性。0091按图1所描述的样本检测流程，利用本发明对6个已知基因型C377TC杂合、C377TC纯合、C369CG杂合、C369CG纯合、C427TC杂合和C427TC纯合DNA样本进行检测，其中包括一份标准对照和阴性对照，包括以下步骤0092。

35、1配制PCR反应液25LPCR反应液中包括5LDNA模板阴性对照为水，10MMTRISHCLPH85，50MMKCL，5V/V甘油，1UTAQDNA聚合酶、002UTAQDNA聚合酶、DATP、DCTP、DGTP、DTTP、DUTP各02MM，004MM2珠蛋白基因扩增引物F1、004M内参基因扩增引物F2，04M2珠蛋白基因扩增引物R1、04M内参基因扩增引物R2，02M荧光探针P1、02M荧光探针P2、02M荧光探针P3。00932将上述装有PCR反应液的PCR反应管置于荧光PCR仪器BIORADCFX96上进行PCR扩增和熔解曲线分析，具体反应程序为00941502MIN，9510MIN。

36、；009529515S655615S7620S，10个循环，其中655615S每个循环下降1；009639515S5515S7620S，50个循环；00974951MIN353MIN4085，其中4085以04/5S的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX的荧光信号。00983结果分析阴性对照在各通道均无熔解峰，标准对照及各基因型的样本在各通道的熔解曲线分析结果见图2FAM通道，图3HEX通道和图4ROX通道，由荧光PCR仪自带的熔解曲线分析软件读取标准对照及各基因型样本在各通道的TM值见表2，再将说明书CN104120080A107/7页11样本的各检测通道的TM值减去标准对照在各检测通道对应的TM值，得到各通道的TM值，根据结果判读表表1，获得各样本的基因型。0099表2各样本在各荧光通道的TM值结果01000101本实施例得到的6份样本的基因型均与样本的实际样本的基因型一致，准确性及特异性均为100。说明书CN104120080A111/2页1200010002序列表CN104120080A122/2页13序列表CN104120080A131/3页14图1说明书附图CN104120080A142/3页15图2图3说明书附图CN104120080A153/3页16图4图5说明书附图CN104120080A16。

摘要
申请专利号：	CN201410376846.5	申请日：	2014.08.01
公开号：	CN104120080A	公开日：	2014.10.29
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12M 1/34申请日:20140801\|\|\|公开
IPC分类号：	C12M1/34; C12Q1/68	主分类号：	C12M1/34
申请人：	厦门大学; 厦门致善生物科技有限公司
发明人：	黄秋英; 李庆阁; 王旭东
地址：	361005 福建省厦门市思明南路422号
优先权：
专利代理机构：	厦门南强之路专利事务所(普通合伙) 35200	代理人：	马应森
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内容摘要

一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用，涉及蛋白基因突变检测。所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒设有盒体、扩增试剂瓶和对照试剂瓶，所述扩增试剂瓶和对照试剂瓶设在盒体内。制备方法：1)制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HBA PCR混合液和HBA酶混合液；2)制备对照试剂，所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照；3)将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得α-珠蛋白基因突变检测试剂盒。所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒可在检测α-珠蛋白基因突变中应用。简便快速、单反应可检测多个位点、耗时短，检测通量高，检测特异性高、结果容易判读。

权利要求书

1.  α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、盒盖、HBA PCR混合液瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶，隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上，HBA PCR混合液瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶分别插入隔板上的瓶孔内；HBA PCR混合液瓶内装有HBA PCR混合液，HBA酶混合液瓶内装有HBA酶混合液，HBA标准对照瓶内装有HBA标准对照，HBA阴性对照瓶内装有HBA阴性对照。

2.  如权利要求1所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述HBA PCR混合液包括1×PCR缓冲液，3.0mM MgCl₂，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMα2-珠蛋白基因扩增引物F1、0.04μM内参基因扩增引物F2，0.4μMα2-珠蛋白基因扩增引物R1、0.4μM内参基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1、0.2μM荧光探针P2、0.2μM荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/μL Taq DNA聚合酶，0.1U/μL UNG酶。

3.  如权利要求2所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，T_m为50～70℃；
所述内参基因为保守基因G6PD基因。

4.  如权利要求2所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述α2-珠蛋白基因扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为：
5’-GGGCCTGGGCCGCACT-3’；
所述α2-珠蛋白基因扩增引物R1为下游引物，其碱基序列为：
5’-CAGGAAGGGCCGGTGCA A-3’；
所述内参基因扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为：
5′-CCTTTCTTCCACCAGACAG C-3′；
所述内参基因扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为：
5’-GCTCAACTTAGCAGAGCC T-3’。

5.  如权利要求2所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标；
荧光探针可为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针；
荧光基团可为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar 705；
淬灭基团可为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE或TAMRA；
荧光探针的长度可为15～40bp的寡核苷酸链，T_m为50～80℃，GC含量40％～70％。

6.  如权利要求2所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针P1的碱基序列为：
5′-FAM-CGGTGCACGCCTCCCCGGACAAGT T-BHQ1-3′；
所述荧光探针P2的碱基序列为：
5′-HEX-CGTGCCTGCTCCATGCCTCAGCACG-BHQ1-3′；
所述荧光探针P3的碱基序列为：
5′-ROX-TGCTGACCTCCAAATACCGTCAAG C-BHQ2-3′。

7.  如权利要求2所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于HBA标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA；
所述HBA阴性对照不含目的基因片段，采用无菌水或Tris-HCl缓冲液；
所述PCR缓冲液可为1×PCR缓冲液。

8.  如权利要求1所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HBA PCR混合液和HBA酶混合液；所述HBA PCR混合液包括1×PCR缓冲液，3.0mM MgCl₂，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMα2-珠蛋白基因扩增引物F1、0.04μM内参基因扩增引物F2，0.4μMα2-珠蛋白基因扩增引物R1、0.4μM内参基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1、0.2μM荧光探针P2、0.2μM荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/μL Taq DNA聚合酶，0.1U/μL UNG酶；所述扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，T_m为50～70℃；
2)制备对照试剂，所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照；
3)将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得α-珠蛋白基因突变检测试剂盒。

9.  如权利要求1所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒在检测α-珠蛋白基因突变中的应用。

10.  如权利要求9所述应用，其特征在于其具体操作步骤如下：
1)PCR扩增和熔解曲线分析，具体方法如下：
(1)试剂准备——配液区
①首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温，PCR反应液配液标准为：取n×19.8μL HBA PCR Mix和n×0.2μL HBA酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心，PCR反应液应即配即用，隔夜使用需-18℃以下贮存，其中，n根据反应管数确定，所述离心可采用3000rpm瞬时离心5s；
②PCR反应液的分装：PCR反应液分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管；
③将配制好的PCR反应管转移至提取间，贮存于-18℃以下冰箱储存直至样本提取完；
(2)样品的加样——模板间
①用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入5μL相应的待检DNA样本、HBA标准对照和HBA阴性对照，并立即盖严管盖；
②将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区；
(3)PCR扩增和熔解曲线分析——扩增区
①PCR扩增程序为：
第一步：50℃2min，95℃10min；
第二步：95℃15s→65～56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65～56℃15s每个循环下降1℃；
第三步：95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环；
②熔解曲线分析程序为：
95℃1min→35℃3min→40～85℃，其中40～85℃以0.4℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX的荧光信号；
③程序运行完毕，将PCR薄壁反应管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理；
2)结果判读，具体方法如下：
根据荧光PCR熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的T_m值的变化进行判断待检样本是否含有α2-珠蛋白基因突变，以及基因突变的类型，其中涉及待测样本和标准对照熔点值的读取，标准对照作为校正，用来减少仪器和操作而引起的熔点误差，数据分析按以下步骤进行：
1)读取标准对照在各检测通道的熔解峰的T_m值；
2)读取待检测样本在各检测通道的T_m值；
3)将待检测在各检测通道的T_m值减去野生型对照在各检测通道对应的T_m值，得到各通道的ΔT_m值，如表1所示；
表1

由表1判断待检是否含有突变，以及突变的类型。

说明书

一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及蛋白基因突变检测，尤其是涉及一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
α-珠蛋白基因突变在人类基因组中较为常见，其基因突变包括单碱基或少数碱基的转换、颠换、插入、缺失等多种类型。在α-珠蛋白基因簇中，α1-珠蛋白基因和α2-珠蛋白基因是两个高GC含量且高度同源性的基因，且两个基因编码的多肽链序列完全相同，而α-珠蛋白基因突变可以导致所编码的α-珠蛋白表达降低，从而导致α-地贫等一系列生物学性状改变。因此，对α-珠蛋白基因突变的检测有重要的生物学意义。潘干华等(潘干华,等.广东南海地区非缺失型α-地中海贫血分子流行病学调查.国际检验医学杂志,2014,35(1):56-57.)报道了广东南海地区非缺失型α-地中海贫血分子流行病学调查，指出中国人群的α-珠蛋白基因突变主要有三种形式：c.369C>G、c.377T>C和c.427T>C，且均发生在α2-珠蛋白基因上。
目前，常用于α-珠蛋白基因突变检测主要是基于PCR的一系列方法，如反向点杂交法(Reverse Dot Blot,RDB)、等位基因特异性PCR、PCR-SSCP、变性高效液相色谱(DHPLC)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、Sanger测序法等。其中反向斑点杂交是目前使用较为广泛的α-珠蛋白基因突变检测方法，该方法属于一种异相的突变检测方法，需要对PCR产物进行后续处理，操作步骤较多，容易引起污染，并且结果判读易受主观因素影响。ARMS-PCR检测的通量十分有限，而且需要PCR后处理，容易出现污染造成假阳性结果的发生。DHPLC对仪器要求设备高，应用性不强。PCR-SSCP对实验条件要求严格，只能检测突变是否存在，对于突变的具体位置和类型还需要进一步的测序，且由于某些点突变类型对单链DNA的空间构象改变小，容易漏检。焦磷酸测序、Sanger测序虽然原理不同，但均是通过PCR扩增后再进行PCR产物测序，操作步骤繁琐，花费时间长，仪器设备昂贵，不能满足基因突变检测所需快速、简便的要求。
熔解曲线(Dissociation Curve)是指随温度升高反映DNA的双螺旋结构解链的曲线。总的DNA双螺旋结构解链一半的温度称为熔解温度，即熔点(T_m)，熔点是双链DNA固有的属性，不同序列的双链DNA，T_m值不同，这与双链DNA的长度、碱基组成相关。在实时PCR(Real-time PCR)技术推出来之后，熔解曲线技术常用来分析基于荧光染料的实时PCR扩增的特异性，根据PCR产物的T_m值的大小判定产物是目标产物还是非特异扩增产物。随着生物技术的发展，仪器设备分辨率的改进，目前基于荧光染料的熔解曲线技术已经发展成的高分辨熔解曲线(High Resolution Melting Curve)技术，该技术可以识别单个碱基的突变，Shih等人(Hung-Chang Shih,etc.Development of a high-resolution melting method for the detection of hemoglobin alpha variants.Clinical Biochemistry,2010,43(7-8):671-676.)将该技术用于α-珠蛋白基因突变的快速检测，但由于该技术本身的局限性，只能对基因突变进行扫描，需要对突变样本进行测序验证，以确定突变的类型，且对DNA样本质量要求非常高，不太适合在各实验室的广泛推广应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的操作繁琐、耗时长、检测成本高、易污染及通量较低等缺点，提供一种简便快捷、灵敏度高、可靠性强、成本较低的基于荧光PCR熔解曲线技术的一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用。
所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒设有盒体、隔板、盒盖、HBA PCR混合液瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶，隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上，HBAPCR混合液瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶分别插入隔板上的瓶孔内。
HBA PCR混合液瓶内装有HBA PCR混合液，HBA酶混合液瓶内装有HBA酶混合液，HBA标准对照瓶内装有HBA标准对照，HBA阴性对照瓶内装有HBA阴性对照。
所述扩增试剂包括HBA PCR混合液和HBA酶混合液；所述HBA PCR混合液包括1×PCR缓冲液，3.0mM MgCl₂，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMα2-珠蛋白基因扩增引物F1、0.04μM内参基因扩增引物F2，0.4μMα2-珠蛋白基因扩增引物R1、0.4μM内参基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1、0.2μM荧光探针P2、0.2μM荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/μL Taq DNA聚合酶，0.1U/μL UNG酶。
所述扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，T_m为50～70℃。
优选的，所述内参基因为保守基因G6PD基因。
优选的，所述α2-珠蛋白基因扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为：5’-GGGCCTGGGCCGCACT-3’(SEQ ID NO.1)。
优选的，所述α2-珠蛋白基因扩增引物R1为下游引物，其碱基序列为：5’-CAGGAAGGGCCGGTGCA A-3’(SEQ ID NO.2)。
优选的，所述内参基因扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为：5′-CCTTTCTTCCACCAGACAG C-3′(SEQ ID NO.3)。
优选的，所述内参基因扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为：5’-GCTCAACTTAGCAGAGCC T-3’(SEQ ID NO.4)。
所述荧光探针可为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标等。
优选的，荧光探针可为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。
优选的，荧光基团可为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar 705等。
优选的，淬灭基团可为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE或TAMRA等。
优选的，荧光探针的长度可为15～40bp的寡核苷酸链，T_m为50～80℃，GC含量40％～70％。
优选的，所述荧光探针P1的碱基序列为：5′-FAM-CGGTGCACGCCTCCCCGGACAAGTT-BHQ1-3′(SEQ ID NO.5)。
优选的，所述荧光探针P2的碱基序列为：5′-HEX-CGTGCCTGCTCCATGCCTCAGCACG-BHQ1-3′(SEQ ID NO.6)。
优选的，所述荧光探针P3的碱基序列为：5′-ROX-TGCTGACCTCCAAATACCGTCAAGC-BHQ2-3′(SEQ ID NO.7)。
所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照。
优选的，HBA标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA。
所述HBA阴性对照不含目的基因片段，优选为无菌水或Tris-HCl缓冲液。
所述PCR缓冲液可以是1×PCR缓冲液，也可以是其它类型的PCR缓冲液。
所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HBA PCR混合液和HBA酶混合液；所述HBA PCR混合液包括1×PCR缓冲液，3.0mM MgCl₂，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMα2-珠蛋白基因扩增引物F1、0.04μM内参基因扩增引物F2，0.4μMα2-珠蛋白基因扩增引物R1、0.4μM内参基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1、0.2μM荧光探针P2、0.2μM荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/μL Taq DNA聚合酶，0.1U/μL UNG酶；所述扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，T_m为50～70℃；
2)制备对照试剂，所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照；
3)将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得α-珠蛋白基因突变检测试剂盒。
所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒可在检测α-珠蛋白基因突变中应用，所述应用的具体操作步骤如下：
1)PCR扩增和熔解曲线分析，具体方法如下：
(1)试剂准备——配液区
①首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为：取n×19.8μL HBA PCR Mix(n根据反应管数确定)和n×0.2μL HBA酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心(如3000rpm离心5s)。PCR反应液应即配即用，隔夜使用需-18℃以下贮存。
②PCR反应液的分装：PCR反应液分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。
③将配制好的PCR反应管转移至提取间，贮存于-18℃以下冰箱储存直至样本提取完。
(2)样品的加样——模板间
①用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入5μL相应的待检DNA样本、HBA标准
对照和HBA阴性对照，并立即盖严管盖。
②将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。
(3)PCR扩增和熔解曲线分析——扩增区
①PCR扩增程序可为：
第一步：50℃2min，95℃10min；
第二步：95℃15s→65～56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65～56℃15s每个循环下降1℃；
第三步：95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环；
②熔解曲线分析程序可为：
95℃1min→35℃3min→40～85℃，其中40～85℃以0.4℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX的荧光信号。
③程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。
2)结果判读，具体方法如下：
根据荧光PCR熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的T_m值的变化进行判断待检样本是否含有α2-珠蛋白基因突变，以及基因突变的类型。这其中涉及待测样本和标准对照熔点值的读取，标准对照作为校正，用来减少仪器和操作而引起的熔点误差。数据分析按以下步骤进行：
1)读取标准对照在各检测通道的熔解峰的T_m值；
2)读取待检测样本在各检测通道的T_m值；
3)将待检测在各检测通道的T_m值减去野生型对照在各检测通道对应的T_m值，得到各通道的ΔT_m值，参照表1，判断待检是否含有突变，以及突变的类型。
表1

本发明的基本原理是针对α2-珠蛋白基因和内参基因序列设计特异性扩增引物和α2-珠蛋白基因突变检测荧光探针和内参基因的检测荧光探针，将所有引物和探针均加入PCR反应管后，进行不对称PCR扩增，PCR扩增后产生大量可与相应荧光探针互补的单链产物，随后进行低温到高温的熔解曲线分析，在熔解曲线分析阶段，低温时各荧光探针与对应的PCR单链产物结合，形成异源双链，随着温度的升高，异源双链慢慢解链，其中荧光变化最快时的温度，即是异源双链的熔解温度，即熔点(T_m值)。由于荧光探针与匹配程度不同靶形成的异源双链的稳定性不同，故其T_m值亦有所不同，荧光探针与完全互补的靶形成的异源双链的熔点最高，与有一个或两个碱基错配的靶形成的异源双链的熔点较低，其熔点与错配碱基的类型、位置均有关系。
本发明的有益效果是：
1.简便快速、单反应可检测多个位点、耗时短：本发明在单个PCR体系中即可完成多种α2-珠蛋白基因突变的检测，PCR扩增结束后只需一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道的基因型，整个操作在2～3h即可完成，操作步骤少、耗时短；
2.均相检测、闭管操作：本发明为均相检测体系，PCR及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染的可能性；
3.检测通量高：本发明基于荧光PCR熔解曲线技术，PCR之后只需运行一个简单的熔解曲线分析步骤(在荧光PCR仪上40min以内完成)即可完成，而PCR可以在普通仪器上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通PCR仪完成熔解曲线分析，故可以大大提高检测通量，提高荧光PCR仪的利用率；
4.检测特异性高、结果容易判读：本发明是通过熔解峰的熔点变化来判定突变与否，其中熔点由仪器自动判读，结果客观，不易出错，故检测特异性高。
附图说明
图1为本发明检测样本的流程图；
图2为本发明检测实施例1样本的FAM荧光通道的熔解曲线结果图；
图3为本发明检测实施例1样本的HEX荧光通道的熔解曲线结果图；
图4为本发明检测实施例1样本的ROX荧光通道的熔解曲线结果图；
图5为本发明所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒实施例结构组成示意图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
参见图5，本发明所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒实施例设有盒体1、隔板2、盒盖3、HBA PCR混合液瓶4、HBA酶混合液瓶5、HBA标准对照瓶6和HBA阴性对照瓶7，隔板2设在盒体1内，盒盖3设在盒体1上，HBA PCR混合液瓶4、HBA酶混合液瓶5、HBA标准对照瓶6和HBA阴性对照瓶7分别插入隔板2上的瓶孔内。
HBA PCR混合液瓶4内装有HBA PCR混合液，HBA酶混合液瓶5内装有HBA酶混合液，HBA标准对照瓶6内装有HBA标准对照，HBA阴性对照瓶7内装有HBA阴性对照。
所述扩增试剂包括HBA PCR混合液和HBA酶混合液；所述HBA PCR混合液包括1×PCR缓冲液，3.0mM MgCl₂，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMα2-珠蛋白基因扩增引物F1、0.04μM内参基因扩增引物F2，0.4μMα2-珠蛋白基因扩增引物R1、0.4μM内参基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1、0.2μM荧光探针P2、0.2μM荧光探针P3；所述HBA酶混合液包括5U/μL Taq DNA聚合酶，0.1U/μL UNG酶。
所述扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，T_m为50～70℃。
所述内参基因为保守基因G6PD基因。
所述α2-珠蛋白基因扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为：5’-GGGCCTGGGCCGCACT-3’(SEQ ID NO.1)。
所述扩增引物α2-珠蛋白基因R1为下游引物，其碱基序列为：5’-CAGGAAGGGCCGGTGCA A-3’(SEQ ID NO.2)。
所述内参基因扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为：5′-CCTTTCTTCCACCAGACAGC-3′(SEQ ID NO.3)。
所述内参基因扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为：5’-GCTCAACTTAGCAGAGCCT-3’(SEQ ID NO.4)。
所述荧光探针是那些与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但是不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标等。
荧光探针为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。
荧光基团为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar 705。
淬灭基团为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE或TAMRA。
荧光探针的长度为15～40bp的寡核苷酸链，T_m为50～80℃，GC含量40％～70％。
所述荧光探针P1碱基序列为：5′-FAM-CGGTGCACGCCTCCCCGGACAAGT T-BHQ1-3′(SEQ ID NO.5)。
所述荧光探针P2碱基序列为：5′-HEX-CGTGCCTGCTCCATGCCTCAGCACG-BHQ1-3′(SEQ ID NO.6)。
所述荧光探针P3碱基序列为：5′-ROX-TGCTGACCTCCAAATACCGTCAAG C-BHQ2-3′(SEQ ID NO.7)。
所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照。
HBA标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA。
所述HBA阴性对照不含目的基因片段，优选的为无菌水或Tris-Hcl缓冲液。
所述PCR缓冲液可以是1×PCR缓冲液，也可以是其它类型的PCR缓冲液。
以下给出具体实施例：
实施例1：利用本试剂盒检测已经基因型样本，考察试剂盒检测样本的特异性和准确性。
按图1所描述的样本检测流程，利用本发明对6个已知基因型(c.377T>C杂合、c.377T>C纯合、c.369C>G杂合、c.369C>G纯合、c.427T>C杂合和c.427T>C纯合)DNA样本进行检测，其中包括一份标准对照和阴性对照，包括以下步骤：
1)配制PCR反应液：25μL PCR反应液中包括：5μL DNA模板(阴性对照为水)，10 mM Tris-HCl pH 8.5，50 mM KCl，5％(v/v)甘油，1 U Taq DNA聚合酶、0.02 U Taq DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2 mM，0.04 mMα2-珠蛋白基因扩增引物F1、0.04μM内参基因扩增引物F2，0.4μMα2-珠蛋白基因扩增引物R1、0.4μM内参基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1、0.2μM荧光探针P2、0.2μM荧光探针P3。
2)将上述装有PCR反应液的PCR反应管置于荧光PCR仪器(Bio-Rad CFX 96)上(进行PCR扩增和熔解曲线分析，具体反应程序为：
(1)50℃2min，95℃10min；
(2)95℃15s→65～56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65～56℃15s每个循环下降1℃；
(3)95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环；
(4)95℃1min→35℃3min→40～85℃，其中40～85℃以0.4℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道(FAM、HEX、ROX)的荧光信号。
3)结果分析：阴性对照在各通道均无熔解峰，标准对照及各基因型的样本在各通道的熔解曲线分析结果见图2(FAM通道)，图3(HEX通道)和图4(ROX通道)，由荧光PCR仪自带的熔解曲线分析软件读取标准对照及各基因型样本在各通道的T_m值(见表2)，再将样本的各检测通道的T_m值减去标准对照在各检测通道对应的T_m值，得到各通道的ΔT_m值，根据结果判读表(表1)，获得各样本的基因型。
表2各样本在各荧光通道的T_m值结果

本实施例得到的6份样本的基因型均与样本的实际样本的基因型一致，准确性及特异性均为100％。