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1、10申请公布号CN104093841A43申请公布日20141008CN104093841A21申请号201280037114222申请日2012062211358005420110624EPC12N15/62200601C07K14/54200601C07K14/715200601C07K16/28200601A61K38/20200601A61K38/17200601A61K39/39520060171申请人西图恩医药SAS地址法国南特申请人法国国家健康与医学研究院72发明人赛巴斯蒂安丹尼尔莫里索杰拉尔丁泰帕斯扬妮克洛朗约瑟夫雅克布鲁诺吉尔伯特马克罗伯特盖伊卢克米歇尔德马丁诺夫大卫贝沙尔7。
2、4专利代理机构北京德琦知识产权代理有限公司11018代理人王峰王珍仙54发明名称基于IL15和IL15RSUSHI结构域的免疫细胞因子57摘要本发明涉及免疫细胞因子及所述免疫细胞因子的用途，所述免疫细胞因子包括（A）缀合物，和（B）直接地或间接地共价连接至所述缀合物的抗体或所述抗体的片段，其中所述缀合物包括（I）包括白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和包括IL15R或其衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列的多肽。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014012686PCT国际申请的申请数据PCT/EP2012/0026502012062287PCT国际申请的公布数据WO2。
3、012/175222EN2012122751INTCL权利要求书1页说明书23页序列表89页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书23页序列表89页附图8页10申请公布号CN104093841ACN104093841A1/1页21一种免疫细胞因子，包括A）缀合物，和B）直接地或间接地共价连接至所述缀合物的抗体或所述抗体的片段，其中，所述缀合物包括（I）包括白细胞介素15或所述白细胞介素15的衍生物的氨基酸序列的多肽，和（II）包括IL15R或所述IL15R的衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列的多肽。2如权利要求1所述的免疫细胞因子，其中A）在融合蛋白中共。
4、价连接所述缀合物的多肽I）和多肽II）；并且B）在融合蛋白中共价连接所述缀合物与所述抗体或所述抗体的片段。3如权利要求2的任一项所述的免疫细胞因子，其中，所述缀合物的氨基酸序列和所述抗体或所述抗体的片段的氨基酸序列没有被任何接头氨基酸序列隔开。4如权利要求2的任一项所述的免疫细胞因子，其中，所述缀合物的氨基酸序列和所述抗体或所述抗体的片段的氨基酸序列被第二接头氨基酸序列隔开。5如权利要求1至4中任一项所述的免疫细胞因子，其中，所述白细胞介素15具有氨基酸序列SEQIDNO1。6如权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞因子，其中，IL15R的SUSHI结构域具有氨基酸序列SEQIDNO4。7如权利。
5、要求1至6中任一项所述的免疫细胞因子，其中，所述包括IL15R或所述IL15R的衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列的多肽（II）具有氨基酸序列SEQIDNO12。8如权利要求2至7的任一项所述的免疫细胞因子，其中，在相对于所述IL15R或所述IL15R的衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列的C末端位置，所述缀合物包括白细胞介素15或所述白细胞介素15的衍生物的氨基酸序列。9权利要求2至8的任一项的免疫细胞因子，其中，所述白细胞介素15或所述白细胞介素15的衍生物的氨基酸序列与所述IL15R或所述IL15R衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列被第一接头氨基酸序列隔开。10如权利要求2至9的任一。
6、项所述的免疫细胞因子，其中，所述抗体或所述抗体的片段针对选自包括与肿瘤新血管形成有关的抗原或与肿瘤细胞外基质有关的抗原和肿瘤抗原的组中的抗原。11如权利要求2至9的任一项所述的免疫细胞因子，其中，相对于所述抗体或所述抗体的片段的氨基酸序列，所述缀合物的氨基酸序列在C末端位置。12一种核酸，所述核酸编码如权利要求1至11的任一项中限定的免疫细胞因子。13一种载体，包括如在权利要求12中限定的核酸。14一种宿主细胞，用权利要求12的核酸或权利要求13的载体遗传工程化所述宿主细胞，所述宿主细胞优选为动物细胞，最优选地为CHO细胞。15一种药物组合物，包括最终与药学上可接受的媒介物结合的如权利要求1至。
7、11的任一项中所限定的免疫细胞因子、权利要求12的核酸、或权利要求13的载体。16如权利要求15所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于治疗受试者中的癌症，优选地通过以25MG/KG受试者的剂量或更小的剂量注射给药。权利要求书CN104093841A1/23页3基于IL15和IL15RSUSHI结构域的免疫细胞因子0001本国际专利申请要求2011年6月24日提交的欧洲专利申请113580054的优先权，其通过引用合并于此。发明领域0002本发明涉及新的免疫细胞因子（IMMUNOCYTOKINE）及其作为药物，特别是用于治疗癌症的药物的用途。背景技术0003免疫疗法在医学中指一系列基于调节免。
8、疫系统以实现预防和/或治疗目标的原理的治疗策略。0004在过去几年中，免疫疗法已被用于治疗或预防一些病变，特别是癌症。由于用于产生单克隆抗体的细胞融合技术的发展，研究人员已经生产了大量单克隆抗体。此后，开发了产生单克隆抗体的其它技术，包括产生人单克隆抗体的B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术。0005单克隆抗体（MAB）可以开发为靶向几乎任何抗原决定簇。特异性识别和结合特定细胞/分子的性质促进MAB开发为用于各种疾病状态的诊断剂和治疗剂。DNA重组技术已用于产生嵌合抗体或人源化抗体，以适应其给药于人类。目前，对于癌症、传染病、免疫性疾病等的治疗，一些单克隆抗体是市销且可获得的，比如0006单克隆。
9、抗体是定向的分子，能够定位于特定区域（细胞、组织），例如肿瘤组织之内。在靶向称为肿瘤抗原的肿瘤部位中的特定分子的尝试中，该性质也导致产生结合到各种物质（有效载荷，PAYLOAD）的MAB的开发。此类物质（有效载荷）可以为毒素、药物、放射性核素、前药化合物等。这些连接中许多涉及反应性部分（有效载荷）与给定抗体制品的化学结合，其可能是缓慢复杂的并经历变化的过程（US4,671,958）。0007在这些新分子中，免疫细胞因子是特别令人感兴趣的。所述免疫细胞因子相当于包括抗体和细胞因子的融合蛋白。这些蛋白质同时保持抗原结合力和细胞因子活性。0008细胞因子是一类在细胞通信中广泛使用的信号传导蛋白和糖蛋。
10、白，如激素和神经递质。虽然激素是由特定器官分泌到血液中，并且神经递质与神经活性有关，但是细胞因子为在其来源和用途方面更多样化类型的化合物。它们由多种造血细胞和非造血细胞类型产生，并可对邻近细胞或整个生物体都有作用，有时强烈地依赖于其它化学品的存在。细胞因子家族主要由质量为8至30KDA之间的较小的水溶性蛋白和糖蛋白组成。细胞因子对于天然免疫应答和适应性免疫应答的功能都重要。通常由已经遇到病原体的免疫细胞分泌，以作为活化和募集更多免疫细胞并增加系统对病原体反应的方式。然而，除了它们在免疫系统的发育和功能化中的作用，细胞因子还参与胚胎发生期间的一些发育过程。0009在细胞因子中，白细胞介素15（I。
11、L15）是一种具有与IL2类似的结构的细胞因子，白细胞介素15是被病毒感染或被识别为非自身或虚弱的（DEBILITATED）细胞间接刺激说明书CN104093841A2/23页4之后由单核吞噬细胞（和一些其它细胞）分泌的。该细胞因子诱导自然杀伤细胞的细胞增殖；自然杀伤细胞是主要作用为杀死病毒感染的细胞的固有先天免疫系统的细胞。由该基因编码的蛋白是调节T细胞和天然杀伤细胞活化和增殖的细胞因子。0010因此，基于IL15的免疫细胞因子的构建对于肿瘤特异性抗体的肿瘤靶向益处与白细胞介素15的免疫调节作用的组合有特别的意义。已经获得特别地使用白细胞介素2（IL2）的一些免疫细胞因子，并且在2期肿瘤学临。
12、床试验中证实了非常令人感兴趣和令人鼓舞的结果。这些融合蛋白的一些实施例描述在一些专利申请（US5,645,835、EP0,305,967、WO86/01533、EP0,439,095和WO85/00974）中说明。0011因此，已经在HEK293中产生了基于白细胞介素15的免疫细胞因子，并在国际专利申请PCTWO2007/128563和KASPAR等的（CANCERRESEARCH,VOL6710,P49404948,2007）中公开。0012然而，本发明人证实此类基于白细胞介素15的免疫细胞因子具有非常有限的白细胞介素15活性，并且在CHO细胞中特别地非常难于制备，产率低且具有许多蛋白污染物。
13、。0013因此，仍然需要可以在免疫疗法中使用的基于白细胞介素15的免疫细胞因子。0014发明简述0015本发明涉及免疫细胞因子，所述免疫细胞因子包括0016A）缀合物，和0017B）直接地或间接地共价连接至所述缀合物的抗体或所述抗体的片段，0018其中，所述缀合物包括0019（I）包括白细胞介素15或所述白细胞介素15的衍生物的氨基酸序列的多肽，和0020（II）包括IL15R或所述IL15R的衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列的多肽。0021在第二个方面，本发明涉及编码如上所述免疫细胞因子的核酸。0022在第三个方面，本发明提供包括如上所述核酸的载体。0023在第四个方面，本发明涉及一种用。
14、之前描述的多核苷酸或载体遗传工程化的宿主细胞。本发明还涉及一种制备宿主细胞的方法，所述遗传工程化的宿主细胞表达根据本发明的免疫细胞因子，所述方法包括下述步骤（I）体外或间接体内引入如上所述核酸或载体到宿主细胞中，（II）在体外或间接体内培养遗传工程化获得的重组宿主细胞，和（III）可选地，选择表达和/或分泌所述免疫细胞因子的细胞。0024在优选的实施方式中，所述遗传工程化的宿主细胞是动物细胞，优选CHO细胞。0025在第五个方面，本发明提供一种药物组合物，其包括最终与药学上可接受的媒介物结合的如上所述的免疫细胞因子、编码所述免疫细胞因子的核酸、或包括所述核酸的核酸载体。0026在优选的实施方式。
15、中，所述组合物包括另外的治疗剂，优选抗癌剂。0027在第六个方面，本发明涉及如之前描述的药物组合物，用于治疗受试者中的癌症。0028在第七个方面，本发明涉及产品，包含0029（I）如上所述的免疫细胞因子，编码所述的免疫细胞因子的核酸序列，或包括这样的核酸序列的载体，和0030（II）治疗剂，优选抗癌剂，说明书CN104093841A3/23页50031作为用于治疗受试者中的癌症的同时、单独或连续使用的组合制剂。0032在第八个方面，本发明涉及一种用于治疗受试者中的癌症的方法，包括给药如之前描述的药物组合物给所述受试者的步骤。0033在最后的方面，本发明涉及用于治疗癌症的方法，包括向需要它的受试。
16、者同时、单独或顺序地给药治疗有效量的如下物质的步骤0034（I）如上所述的免疫细胞因子、编码所述的免疫细胞因子的核酸序列，或包括这样的核酸序列的载体，和0035（II）治疗剂，优选抗癌剂。附图说明0036图1显示与IL15相比较，IL15抗CD20免疫细胞因子的活性。0037图2显示与IL15相比较，IL15抗CD20O乙酰化免疫细胞因子的活性。0038图3分别显示IL15抗CD20免疫细胞因子、抗GD2O乙酰化的免疫细胞因子与抗HER2IL15免疫细胞因子的CD20、GD2O乙酰化物和HER2结合活性。0039图4显示与抗CD20抗体（利妥昔单抗）相比较，IL15抗CD20免疫细胞因子的IL。
17、15R结合活性。0040图5分别显示IL15抗CD20免疫细胞因子、抗GD2O乙酰化的免疫细胞因子和抗HER2RLI免疫细胞因子的CD20、GD2O乙酰化的和HER2结合活性。0041图6显示RLI抗CD20免疫细胞因子和IL15抗GD2O乙酰化的免疫细胞因子的IL15R结合活性。0042图7显示与IL15相比较，RLI抗CD20免疫细胞因子的活性。0043图8显示与IL15相比较，RLI抗GD2O乙酰化免疫细胞因子的活性。0044图9显示与抗GD2O乙酰化的抗体相比较，抗GD2O乙酰化免疫细胞因子的抗转移活性。0045图10显示抗CD20免疫细胞因子在RAJI模型中的抗肿瘤活性。0046图1。
18、1显示与IL15相比较，IL15抗HER2免疫细胞因子的活性。0047图12显示与IL15相比较，RLI抗HER2免疫细胞因子的活性。0048详细说明0049本发明是基于本发明人发现，虽然包括白细胞介素15的免疫细胞因子的产生导致超过90的白细胞介素15活性的丧失，但是基于RLI的免疫细胞因子的产生导致新的IL15免疫细胞因子，其对和免疫细胞呈现出强的生物活性，很大程度上优于基于IL15的免疫细胞因子。0050出人意料地，与单独的RLI或SCFV片段抗体相比较，具有全IGG单克隆抗体的基于RLI免疫细胞因子呈现出对免疫细胞改善的生物学效力。在免疫抑制环境中，这个出人意料地获得的对免疫细胞的活性。
19、在关于NK细胞和T淋巴细胞的活化/再活化方面可能很重要。0051更出人意料地，虽然白细胞介素15免疫细胞因子使在免疫球蛋白和白细胞介素15部分之间必须存在接头，以被活化；但是本发明的免疫细胞因子在其各自的免疫球蛋白和细胞因子部分之间有或者没有任何接头的情况下，呈现类似的白细胞介素15活性。在融说明书CN104093841A4/23页6合蛋白免疫原性、限制绞链区产生新的抗原表位和免疫原性方面及在具有有限裂解形式的产物收率方面，该接头区域的不必存在可提供有力的证明。0052更出人意料地，本发明的免疫细胞因子是IL15超激动剂（SUPERAGONIST），与单独的RLI相比较，呈现出增强的活性（即1。
20、0至100倍）。0053而且，本发明人在CHO细胞中获得了本发明的免疫细胞因子的产物的良好收率，收率超过90。这是出人意料的，因为在CHO细胞的相同细胞中白细胞介素15免疫细胞因子的产生非常难。0054由于免疫细胞因子传统上具有有限的血清半衰期，并且由于免疫细胞因子相关的肿瘤定位率是产生强抗肿瘤效力的关键问题，基于RLI的免疫细胞因子的特定生物活性允许以非常低的浓度活化免疫细胞，代表该领域的一个重要创新步骤，可以改善这类生物学化合物在癌症患者中的功效。0055最后，本发明的免疫细胞因子的强的活性能够预示该免疫细胞因子的实际治疗用途，其应当以251MG/KG受试者或更小的剂量，并且甚至以01MG。
21、/KG或更小的剂量注射给药。实际上，白细胞介素15免疫细胞因子的低活性，比如在国际专利申请WO2007/128563中公开的那种，不具有任何治疗用途（即，在小鼠肿瘤模型中，获得治疗效果需要超过20G免疫细胞因子的剂量，每日注射四次，表明获得一些治疗效果需要超过5MG/KG免疫细胞因子的剂量。0056因此，本发明的一个方面涉及免疫细胞因子，包括0057A）缀合物，和0058B）直接地或间接地共价连接至所述缀合物的抗体或所述抗体的片段，0059其中，所述缀合物包括0060（I）包括白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和0061（II）包括IL15R或其衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列的。
22、多肽。0062术语“免疫细胞因子”指包括直接地或间接地共价连接至细胞因子或其衍生物的抗体或它的片段的分子。所述抗体和所述细胞因子可以通过接头肽连接。0063本发明的免疫细胞因子的缀合物0064术语“白细胞介素15”为本领域它的一般含义，并指具有类似于IL2结构的细胞因子（GRABSTEIN等,SCIENCE,VOL2645161,P965968,1994）。该细胞因子也称为IL15、IL15或MGC9721。该细胞因子和IL2共享许多生物学活性，发现它们结合常见血细胞生成素受体亚基。因此，它们可竞争相同的受体，负调节彼此的活性。已确定IL15调节T和自然杀伤细胞活化和增殖，并且CD8记忆细胞的。
23、数量显示受该细胞因子和IL2之间的平衡的控制。可以通过测定其对KIT225细胞系的增殖诱导来测量IL15活性（HORI等，BLOOD，VOL704，P106972,1987），如实施例中公开。0065所述IL15或它的衍生物对于KIT225细胞系的增殖诱导具有人白细胞介素15活性的至少10，优选至少25，更优选至少50。0066所述白细胞介素15为哺乳动物白细胞介素15，优选灵长类白细胞介素15，更优选人白细胞介素15。0067本领域技术人员可简单地鉴定哺乳动物白细胞介素15。作为实例，可以引用来自野猪（登录号ABF82250）、来自褐家鼠（登录号NP_037261）、来自小家鼠（登录说明书C。
24、N104093841A5/23页7号NP_032383）、来自黄牛（登录号NP_776515）、来自家兔（登录号NP_001075685）、来自绵羊（登录号NP_001009734）、来自家猫（登录号NP_001009207）、来自食蟹猴（登录号BAA19149）、来自智人（登录号NP_000576）、来自恒河猴（登录号NP_001038196）、来自豚鼠（登录号NP_001166300）或来自绿猴（CHLOROCEBUSSABAEUS）（登录号ACI289）的白细胞介素15。0068如本文使用的术语“哺乳动物白细胞介素15”指共有序列SEQIDNO1。0069本领域技术人员可简单地鉴定灵长类。
25、白细胞介素15。作为实例，可以引用来自野猪（登录号ABF82250）、来自家兔（登录号NP_001075685）、来自食蟹猴（登录号BAA19149）、来自智人（登录号NP_000576）、来自恒河猴（登录号NP_001038196）或来自绿猴（登录号ACI289）的白细胞介素15。0070如本文使用的术语“灵长类白细胞介素15”指共有序列SEQIDNO2。0071本领域技术人员可简单地鉴定人白细胞介素15，人白细胞介素15指氨基酸序列SEQIDNO3。0072如本文使用的术语“白细胞介素15衍生物”指具有与选自由SEQIDNO1、SEQIDNO2和SEQIDNO3组成的组中的氨基酸序列至少9。
26、25（即，相当于约10个氨基酸取代）的同一性百分数的氨基酸序列，优选地至少96（即相当于约5个氨基酸取代，更优选地至少985（即相当于约2个氨基酸取代）或至少99（即相当于约1个氨基酸取代）。本领域技术人员可基于其个人的知识和本专利申请的教导简单地鉴定这样的衍生物。作为这样的衍生物的实例，可以引用在国际专利申请PCTWO2009/135031中描述的那些。也应当理解天然氨基酸可以被化学修饰的氨基酸所替代。通常，这样的化学修饰的氨基酸提高了多肽半衰期。0073如本文使用的两个氨基酸序列之间“同一性百分数”指由将进行比较的两个序列之间相同氨基酸的百分数，从所述序列的最佳比对获得，该百分数是纯粹统计。
27、学意义的，并且这两个序列之间的差异随机分布于所述氨基酸序列中。如本文使用的“最佳比对”或“最优的比对”指确定的同一性百分数（见下文）最高的比对。两个氨基酸序列之间的序列比较通常是通过比较之前已经根据最佳比对来比较的这些序列来实现的；该比较是在比较节段（SEGMENT）上实现的，以便鉴定和比较局部区域相似性。除了手动方式之外，可通过使用SMITH和WATERMAN开发的总体同源性算法（ADAPPMATH,VOL2,P482,1981），可通过使用NEDDLEMAN和WUNSCH开发的局部同源性算法（JMOLBIOL,VOL48,P443,1970），PEARSON和LIPMAN开发的相似性方法（。
28、PROCNATLACDSCIUSA,VOL85,P2444,1988），通过使用这类算法的计算机软件在WISCONSINGENETICSSOFTWAREPACKAGE,GENETICSCOMPUTERGROUP,575SCIENCEDR,MADISON,WIUSA中的GAP、BESTFIT、BLASTP、BLASTN、FASTA、TFASTA，通过使用MUSCLE多重比对算法（EDGAR,ROBERTC,NUCLEICACIDSRESEARCH,VOL32,P1792,2004），实现用于进行比较的最佳序列比对。为了得到最优局部比对，可以优选地使用具有BLOSUM62矩阵的BLAST软件。通过。
29、比较最佳比对的这两个序列来确定的两个氨基酸序列之间的同一性百分数，所述氨基酸序列能够涵盖相对于参见序列的添加或缺失，以便得到这两个序列之间的最佳比对。通过确定这两个序列之间相同位点的数目，用该数值除以比较位点的总数，得到的结果乘以100以得到这两个序列之间的同一性百分数，而计算同一性百分数。说明书CN104093841A6/23页80074优选地，白细胞介素15衍生物为IL15激动剂或超激动剂。在本领域技术人员可以简单地鉴定IL15激动剂或超激动剂。作为IL15激动剂或超激动剂的实例，可以引用在国际专利申请WO2005/085282或ZHU等的（JIMMUNOL,VOL1836,P359860。
30、7,2009）中公开的那些。0075更优选地，所述IL15激动剂或超激动剂选自包括L45D、L45E、S51D、L52D、N72D、N72E、N72A、N72SN72Y和N72P的组中/由L45D、L45E、S51D、L52D、N72D、N72E、N72A、N72SN72Y和N72P组成的组中（参照人IL15的序列，SEQIDNO3）。0076如本文使用的术语“IL15R的SUSHI结构域”具有本领域中其一般含义，指在IL15R的信号肽之后第一个半胱氨酸残基（C1）开始，在所述信号肽之后第四个半胱氨酸残基（C4）终止的结构域。所述SUSHI结构域相应于IL15R的细胞外区域的一部分对于它结合I。
31、L15是必需的（WEI等，JIMMUNOL，VOL1671，P277282，2001）。0077所述IL15R或其衍生物的SUSHI结构域具有人IL15R的SUSHI结构域对人白细胞介素15的结合活性的至少10，优选至少25，更优选至少50。可以通过WEI等公开的方法（上述，2001）简单地确定所述结合活性。0078所述IL15R的SUSHI结构域为哺乳动物IL15R的SUSHI结构域，优选灵长类IL15R的SUSHI结构域，更优选人IL15R的SUSHI结构域。0079本领域技术人员可简单地鉴定哺乳动物IL15R的SUSHI结构域。作为实例，可以引用来自褐家鼠（登录号XP_002728555。
32、）、来自小家鼠（登录号EDL08026）、来自黄牛（登录号XP_002692113）、来自家兔（登录号XP_002723298）、来自食蟹猴（登录号ACI42785）、来自豚尾猴（登录号ACI42783）、来自智人（登录号CAI41081）、来自恒河猴（登录号NP_001166315）、苏门达腊猩猩（登录号XP_002820541）、白颈白眉猴（登录号ACI42784）、普通狨（登录号XP_002750073）或豚鼠（登录号NP_001166314的IL15R的SUSHI结构域。0080如本文使用的术语“哺乳动物IL15R的SUSHI结构域”指共有序列SEQIDNO4。0081优选地，包括哺乳。
33、动物IL15R的SUSHI结构域的氨基酸序列的多肽指共有序列SEQIDNO5。0082本领域技术人员可简单地鉴定灵长类IL15R的SUSHI结构域。作为实例，可以引用来自家兔、来自食蟹猴、来自豚尾猴、来自智人、来自恒河猴、苏门答腊猩猩、白颈白眉猴或普通狨的IL15R的SUSHI结构域。0083如本文使用，术语“灵长类IL15R的SUSHI结构域”指共有序列SEQIDNO6。0084优选地，包括灵长类IL15R的SUSHI结构域的氨基酸序列的多肽指共有序列SEQIDNO7。0085本领域技术人员可简单地鉴定人IL15R的SUSHI结构域，并且所述人IL15R的SUSHI结构域是指氨基酸序列SEQ。
34、IDNO8。0086优选地，包括人IL15R的SUSHI结构域的氨基酸序列的多肽指SEQIDNO9。0087如本文使用，术语“IL15R的SUSHI结构域的衍生物”指具有与选自由SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8和SEQIDNO9组成的组中的氨基酸序列至少92（即相当于约5个氨基酸取代的同一性百分数的氨基酸序列，优选地至少96（即相当于约2个氨基酸取代），更优选地至少98（即相当于约1个说明书CN104093841A7/23页9氨基酸取代）。这样的衍生物包括L15R的SUSHI结构域的四个半胱氨酸残基，可以由本领域技术人员基于他/她的常识和。
35、本专利申请的教导简单地鉴定。还应当理解天然氨基酸可以被化学修饰的氨基酸所替代。通常，这样的化学修饰的氨基酸能够提高多肽半衰期。0088根据优选的实施方式，缀合物包括（II）含有IL15R或其衍生物的SUSHI和HINGE结构域的氨基酸序列的多肽。0089所述IL15R铰链结构域定义为开始于SUSHI结构域后的第一个氨基残基且终止于糖基化的第一个潜在位点前的最后一个氨基酸残基的氨基酸序列。在人IL15R中，所述绞链区的氨基酸序列由十四个氨基酸组成，所述十四个氨基酸位于该IL15R的SUSHI结构域之后的相对于所述SUSHI结构域的C末端位置，即所述IL15R绞链区开始于所述（C4）半胱氨酸残基后。
36、的第一个氨基酸且终止于第十四个氨基酸（以标准的“从N末端到C末端”方向的计数）。0090所述IL15R的SUSHI和铰链结构域为哺乳动物IL15R的SUSHI和铰链结构域，优选灵长类IL15R的SUSHI和铰链结构域，更优选人IL15R的SUSHI和铰链结构域。0091本领域技术人员可简单地鉴定哺乳动物IL15R的SUSHI和铰链结构域的氨基酸序列可以。如本文使用，术语“哺乳动物IL15R的SUSHI和铰链结构域”指共有序列SEQIDNO10。0092本领域技术人员可简单地鉴定灵长类IL15R的SUSHI和铰链结构域的氨基酸序列。如本文使用，术语“灵长类IL15R的SUSHI和铰链结构域”指共。
37、有序列SEQIDNO11。0093本领域技术人员可简单地鉴定人IL15R的SUSHI和铰链结构域的氨基酸序列。如本文使用，术语“人IL15R的SUSHI和铰链结构域”指共有序列SEQIDNO12。0094如本文使用，术语“IL15R的SUSHI和铰链结构域的衍生物”指具有与选自由SEQIDNO10、SEQIDNO11和SEQIDNO12组成的组中的氨基酸序列至少93（即相当于约5个氨基酸取代）的同一性百分数的氨基酸序列，优选地至少97（即相当于约2个氨基酸取代），更优选地至少98（即相当于约1个氨基酸取代）。这样的衍生物包括L15R的SUSHI结构域的四个半胱氨酸残基，并可以由本领域技术人员基。
38、于其常识和本专利申请的教导简单地鉴定。还应当理解天然氨基酸可以被化学修饰的氨基酸所替代。通常，这样的化学修饰的氨基酸能够提高多肽半衰期。0095缀合物的多肽I）和多肽II）都可以是非共价连接的，例如在美国专利8,124,084B2中公开的复合物中。可通过提供合适量的多肽I），提供合适量的多肽II），在合适的PH和离子状态下混合这两种多肽足以允许复合物（即缀合物）形成的持续时间，并可选择地浓缩或纯化所述复合物，简单地获得所述缀合物或复合物。例如，根据标准方法使用肽合成仪；通过在细胞或细胞提取物中分别表达每种多肽，然后分离和纯化所述多肽，形成所述复合物（即缀合物）的多肽。可选择地，通过在相同细胞或。
39、细胞提取物中表达多肽I）和多肽II），然后，例如使用色谱技术，例如具有针对淋巴因子部分、淋巴因子受体部分或复合物的抗体的亲和色谱，分离和纯化该复合物，可形成本发明的治疗性多肽复合物。0096也可以使用双官能蛋白质偶联剂或在融合蛋白中共价连接缀合物的多肽I）和多肽II）。说明书CN104093841A8/23页100097本领域技术人员熟知双官能蛋白质偶联剂，例如使用他们的方法，包括例如N琥珀酰亚胺基2吡啶基二硫代丙酸酯（SPDP）、琥珀酰亚胺基N马来酰亚胺基甲基环己烷1羧酸酯、亚氨基硫烷（IT）、亚氨酸酯的双官能衍生物（盐酸二甲基亚氨酸酯）、活性酯类（例如辛二酸二琥珀酸亚胺酯）、醛类（例如戊二。
40、醛）、双叠氮化合物（例如双对叠氮基苯甲酰己二胺、双重氮衍生物（例如双对重氮苯甲酰己二胺、二异氰酸酯（例如甲苯2,6二异氰酸酯）和双活性氟化合物（例如1,5二氟2,4二硝基苯）。0098术语“融合蛋白”指通过最初编码单独的蛋白质的两种或更多种基因连接产生的蛋白质。其也称为嵌合蛋白。该融合基因的翻译产生具有衍生自每种原始蛋白的功能特性的单一多肽。通过用于生物学研究或治疗的DNA重组技术人工产生重组融合蛋白。重组融合蛋白是通过融合基因的遗传工程化产生的蛋白质。这通常包括从编码第一个蛋白质的CDNA序列除去终止密码子，然后通过连接PCR或重叠延伸PCR在框架中附加第二个蛋白质的CDNA序列。然后，由细。
41、胞将DNA序列表达为单个蛋白质。该蛋白质可以工程化为包括两种原始蛋白质的全序列或任一个序列的仅一部分。0099在优选的实施方式中，缀合物为融合蛋白。0100白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列可以位于相对于IL15R或其衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列的C末端或N末端位置。优选地，白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列位于相对于IL15R或其衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列的C末端位置。0101白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列与IL15R或其衍生物的SUSHI结构域的氨基酸序列可以被第一“接头”氨基酸序列隔开。所述第一“接头”氨基酸序列可以具有足够保证融合蛋白形成合适的二级和三级结构。
42、的长度。0102所述第一接头氨基酸序列的长度可以变化，而不会显著地影响融合蛋白的生物活性。通常，第一接头氨基酸序列包括至少一个，但少于30个氨基酸，例如230个氨基酸，优选1030个氨基酸，更优选1530个氨基酸，进一步更优选1525个氨基酸，最优选1822个氨基酸的接头。0103优选的接头氨基酸序列为允许缀合物采用合适构象的那些（即允许通过IL15R/信号通路的合适的信号传导活动的构象。0104最合适的第一接头氨基酸序列（1）将采用柔性延伸构象，（2）不会显示出发展为有序二级结构的倾向，所述二级结构可与融合蛋白的功能域相互作用，和（3）具有最小的疏水性或带电特性，所述疏水性或带电特性可促进与。
43、功能蛋白结构域的相互作用。0105优选地，所述第一接头氨基酸序列包括选自由GLY（G）、ASN（N）、SER（S）、THR（T）、ALA（A）、LEU（L）和GLN（Q）组成的组中，最优选地选自由GLY（G）、ASN（N）和SER（S）组成的组中的接近中性的氨基酸。0106美国专利NO5,073,627和5,108,910中描述了接头序列的实例。0107更特别地适用于本发明的示例性柔性接头包括SEQIDNO13（SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ）、SEQIDNO14（SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG）或SEQIDNO15（SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ）的序列编码的。
44、那些。0108本发明的免疫细胞因子的抗体0109术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其相当于包括通过二硫键互连的两个相同的重说明书CN104093841A109/23页11（H）链（全长时约5070个KDA）和两个相同的轻（L）链（全长时约25KDA）的四个多肽链的四聚体。轻链分为和。重链分为、或，并分别限定抗体的同种型为IGG、IGM、IGA、IGD和IGE。每个重链由N末端重链可变区（本文缩写为HCVR）和重链恒定区组成。对于IGG、IGD和IGA，重链恒定区由三个结构域（CH1、CH2和CH3）组成；对于IGM和IGE，其由4个结构域（CH1、CH2、CH3和CH4）组成。每个轻链由N末端轻链。
45、可变区（本文缩写为LCVR）和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。HCVR和LCVR区域可以进一步分为称为互补决定区（CDR）的高可变性区域、称为构架区（FR）的更保守的散布区域。每个HCVR和LCVR由按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。根据已知的惯例，对各个结构域的氨基酸进行归属。抗体结合特定抗原的功能能力取决于各个轻链/重链对的可变区，且主要由CDR确定。0110如本文使用，术语“抗体”指单克隆抗体本身。单克隆抗体可以是人抗体、嵌合抗体和/或人源化抗体。0111有利地，术语抗体指IGG，例如。
46、IGG1、IGG2（IGG2A或IGG2B、IGG3和IGG4。优选地，术语抗体指IGG1或IGG2，更优选IGG2A。0112“嵌合抗体”指由鼠科动物免疫球蛋白的可变区和人免疫球蛋白的恒定区组成的抗体。该改变仅包含用鼠科动物恒定区取代人抗体的恒定区，从而产生可具有对于药物用途可接受的足够低的免疫原性的人/鼠科动物嵌合体。已经报道了用于产生这样的嵌合抗体的大量方法，从而构成本领域技术人员的常识的一部分（参见，例如美国专利NO5,225,539）。0113“人源化抗体”指通过改变具有非人互补决定区（CDR）的抗体的序列，部分或完全由衍生自人抗体种系的氨基酸序列组成的抗体。通过本领域目前已知的技术。
47、进行该抗体可变区以及最终CDR的人源化。作为实例，英国专利申请GB2188638A和美国专利NO5,585,089公开产生重组抗体的方法，其中抗体被取代的唯一部分是互补决定区或“CDR”。CDR移植技术已用于产生由鼠科动物CDR和人可变区框架和恒定区组成的抗体（参见，例如RIECHMANN等，NATURE，VOL332，P323327,1988）。这些抗体保留FC依赖性效应子功能所必需的、但是不太可能引起针对该抗体的免疫应答的人恒定区。作为实例，可变区的框架区被相应的人框架区取代，保持非人CDR的基本完整，或者甚至用衍生自人基因组的序列替换CDR（参见例如专利申请US2006/25885）。在。
48、为了响应于人免疫系统而改变其免疫系统的遗传修饰的小鼠中完全地产生人类抗体。如上述，使用所述抗体的免疫特异性片段，包括代表单链形态的片段，对于用在本发明方法中是足够的。0114人源化抗体还指包括人框架、至少一个来自非人抗体的CDR的抗体，其中存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即至少约85或90、优选至少95相同。因此，可能除了CDR，人源化抗体的所有部分都与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。例如，人源化的免疫球蛋白通常不涵盖嵌合体小鼠可变区/人恒定区抗体。作为实例，可以如下进行人源化免疫球蛋白的设计当氨基酸属于下述类别时，将被使用的人免疫球蛋白（受体免疫球蛋白）的。
49、框架氨基酸被来自提供CDR的非人免疫球蛋白（供体免疫球蛋白）的框架氨基酸替换（A）在所述位置的受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸对于人免疫球蛋白是不常见的，而在所述位置的供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对于人免疫球蛋白是常见的；（B）氨基酸的位置紧邻CDR的一个；或（C）在三维免疫球蛋白模型中，框说明书CN104093841A1110/23页12架氨基酸的任一个侧链原子在CDR氨基酸的任一个原子的约56埃（中心至中心）之内（QUEEN等，PROCNATLACADSCIUSA，VOL88,P2869,1991）。当在该位置受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸和供体免疫球蛋白中的相应氨基酸的每个对于人免疫球蛋白不常见时，在该位置这样的氨基酸被对于人免疫球蛋白典型的氨基酸替换。0115如本文使用的术语“抗体片段”指能够与其抗体对应物的相同的抗原反应的抗体片段。本领域技术人员可简单地鉴定这样的片段，并且本发明所涵盖，作为举例，包括FAB片段（例如通过木瓜蛋白酶消化）、FAB片段（例如通过胃蛋白酶消化和部分还原）、FAB2片段（例如通过胃蛋白酶消化、FACB（例如通过纤溶酶消化）、FD（例如，通过胃蛋白酶消化、部分还原。