《纳米乳液呼吸道合胞病毒RSV亚单位疫苗.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《纳米乳液呼吸道合胞病毒RSV亚单位疫苗.pdf（87页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104093421A43申请公布日20141008CN104093421A21申请号201280054495522申请日2012091061/533,06220110909USA61K39/15520060171申请人纳诺碧欧公司地址美国密歇根州72发明人V毕缇寇T韩缪达74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人赵蓉民陆惠中54发明名称纳米乳液呼吸道合胞病毒RSV亚单位疫苗57摘要本申请涉及免疫学领域，具体地，涉及呼吸道合胞病毒RSV表面蛋白的疫苗组合物，融合物F和糖蛋白G蛋白质亚单位疫苗，优选与免疫细胞靶向和增强物纳米乳液混合，以引起保护性免疫应答和避免疫。
2、苗疫苗引起的疾病加重。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014050686PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0543952012091087PCT国际申请的公布数据WO2013/036907EN2013031451INTCL权利要求书2页说明书47页附图37页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书47页附图37页10申请公布号CN104093421ACN104093421A1/2页21疫苗组合物，包括A至少一种呼吸道合胞病毒RSV表面抗原或其抗原片段；和B免疫增强型纳米乳液或其稀释物，包括小滴，其平均大小为约1000NM或更小，和I含水相。
3、；II至少一种油；III至少一种表面活性剂；和IV至少一种有机溶剂；其中所述至少一种RSV表面抗原包括在所述纳米乳液中。2权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述表面抗原是RSVF蛋白质、RSVG蛋白质、RSVF蛋白质的抗原片段、RSVG蛋白质的抗原片段、或其任意组合。3权利要求1或权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原来自人呼吸道合胞病毒，其以HRSVL19保藏在美国典型培养物保藏中心ATCC。4权利要求13任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原还包括至少一种指示减毒表型的核苷酸修饰。5权利要求14任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原或其抗原片段存在于融合蛋白质中。6权。
4、利要求15任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原是RSVF蛋白质的肽片段、RSVG蛋白质的肽片段、或其任意组合。7权利要求16任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原是多价的。8权利要求7所述组合物，其中所述多价表面抗原是RSVF蛋白质、RSVG蛋白质、RSVF蛋白质的抗原片段、RSVG蛋白质的抗原片段、或其任意组合。9权利要求18任一项所述疫苗组合物，其中所述免疫增强型纳米乳液能够诱发TH1免疫应答、TH2免疫应答、TH17免疫应答、或其任意组合。10权利要求19任一项所述疫苗组合物，还另外包括佐剂。11权利要求110任一项所述疫苗组合物，还包括至少一种药学上可接受的载体。12权利。
5、要求111任一项所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物被配制，用于经肠胃外、口服、鼻内或直肠施用。13权利要求12所述疫苗组合物，其中所述肠胃外施用是通过皮内、皮下、腹膜内或肌肉内注射。14权利要求113任一项所述疫苗组合物，还包括分离的RSV病毒体颗粒。15权利要求14所述疫苗组合物，其中所述RSV病毒体颗粒来自人呼吸道合胞病毒，其以HRSVL19保藏在美国典型培养物保藏中心ATCC。16权利要求14或权利要求15所述疫苗组合物，其中所述RSV病毒体颗粒通过所述纳米乳液失活。17权利要求1416任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV病毒基因组包括至少一个减毒突变。18权利要求117任一项所述疫苗组。
6、合物，其中所述疫苗组合物A对于对象不是全身毒性的；B在施用后产生最小炎症或不产生炎症；或权利要求书CN104093421A2/2页3C其任意组合。19权利要求118任一项所述疫苗组合物，其中所述纳米乳液小滴的平均直径选自小于约1000NM、小于约950NM、小于约900NM、小于约850NM、小于约800NM、小于约750NM、小于约700NM、小于约650NM、小于约600NM、小于约550NM、小于约500NM、小于约450NM、小于约400NM、小于约350NM、小于约300NM、小于约250NM、小于约200NM、小于约150NM、小于约100NM、大于约50NM、大于约70NM、大于。
7、约125NM、大于约125NM并且小于约600NM，和其任意组合。20权利要求119任一项所述疫苗组合物，其中所述纳米乳液包括A含水相；B约1油至约80油；B约01有机溶剂至约50有机溶剂；和C约0001表面活性剂至约10表面活性剂。21权利要求120任一项所述疫苗组合物，其中所述纳米乳液包括A含水相；B约1油至约80油；C约01有机溶剂至约50有机溶剂；D约0001至约10的一种或多种非离子表面活性剂；和3阳离子表面活性剂。22权利要求121任一项所述的疫苗组合物，其中在施用给对象之后，所述对象在单一施用所述疫苗后经历血清转换。23权利要求122任一项所述的疫苗组合物在制备药物中的用途。24。
8、权利要求23所述的用途，其中所述药物用于治疗婴儿。25权利要求23所述的用途，其中所述药物用于治疗老年对象、移植对象、患有慢性阻塞性肺疾病COPD的对象、或其任意组合。权利要求书CN104093421A1/47页4纳米乳液呼吸道合胞病毒RSV亚单位疫苗0001相关申请的交叉参考0002本申请要求美国临时申请号61/533,0622011年9月9日提交的权益，其通过引用被具体并入。0003本申请的领域0004本申请涉及免疫学领域，尤其地，涉及纳米乳液呼吸道合胞病毒RSV疫苗组合物，其包括与纳米乳液佐剂组合的至少一种RSV免疫原。RSV免疫原可以是任意合适的RSV抗原，诸如RSV表面蛋白质、融合物。
9、F和糖蛋白G蛋白质，以形成亚单位疫苗。纳米乳液RSV疫苗引起保护性免疫应答并且避免疫苗引起的疾病加重。0005发明的背景0006呼吸道合胞病毒RSV是世界范围内幼儿和老人中严重呼吸疾病的主要原因，并且，没有疫苗可对抗该病原体。人呼吸道合胞病毒HRSV是婴儿急性下呼吸道疾病的最常见病原，并且，在一生中可导致反复感染。其被归于副黏液病毒科PARAMYXOVIRIDAE肺病毒PNEUMOVIRUS属。如该科中的其他成员一样，HRSV具有两种主要的表面糖蛋白G和F，其在感染周期的初始阶段发挥重要作用。G蛋白介导病毒到细胞表面受体的附着，而F蛋白促进病毒和细胞膜的融合，使得病毒核糖核蛋白进入细胞质。00。
10、07呼吸道合胞病毒RSV感染常常导致细支气管炎，并且是发达国家中婴儿住院的主要原因。另外，RSV日益被描述为老年患者、移植患者和慢性阻塞性肺疾病COPD患者中的主要病原体HACKINGANDHULL,2002。开发安全和免疫原性疫苗以解决婴儿和老年群体展现出独特的时机。0008之前的疫苗制剂的病毒灭活方法诸如甲醛导致肺疾病加重和死亡率增加。对于病毒疫苗开发以解决RSV的广泛研究已经取得有限的成功。RSV疫苗开发的一些主要挑战包括，感染的早期、先天免疫逃避、不引起预防感染的免疫性的自然感染失败和与疫苗稳定性、纯度、再现性和效价有关问题有关联的疫苗加重疾病的证明GRAHAM,2011；SWANSO。
11、NANDSETTEMBRE,2011。0009方法已经包括用福尔马林灭活病毒和在感染RSV时证明疫苗引起的疾病加重。如下的观察对于产生中和抗体是必要的福尔马林灭活的疫苗已经显示疾病加重，包括显示对于预防加重重要的偏移的免疫应答对于保护性免疫应答和使F蛋白质处于其原始状态以维持构象表位是必要的KRUJIGEN,2011；SWANSON2011；MCLELLAN等,2011。对于福尔马林灭活的RSV疫苗疾病加重不归因于G蛋白质和G蛋白质抗体可降低病毒滴度和实际上保护免受疾病加重的证明表明，G蛋白质可被并入到候选疫苗中RADU等,2010；HAYNES等,2009；JOHNSON等,2004。减毒活。
12、疫苗的应用已经取得有限的成功，因为已经显示疫苗是最低免疫原性的GOMEZ等2009。重组病毒表达的F和G蛋白质疫苗的应用显示与下列有关的免疫原性降低低抗原表达水平、瞬时表达水平、细胞特异性和对于纯化F蛋白质在结构上可以是不成熟的并且不是引起中和抗体的适当形式的证明SINGHANDDENNIS,2007；KIM等,2010。在应用亚单位疫苗时，具有最佳F蛋白质水平对于引起适当的免疫应答是至关重要的，因为亚单位疫苗已经通过F和G蛋白质的低效和不适当表达而说明书CN104093421A2/47页5被阻止NALLET等,2009；HUANGANDLAWLOR2010。对于含有F蛋白质、甚至还有佐剂的亚。
13、单位疫苗不是完全保护性的和最佳的观察LANGLEY等,2009表明，病毒体内F蛋白质以其初始状态的呈递对于用作疫苗是重要的。0010与纳米乳液有关的之前的教导描述在美国专利号6,015,832中，该专利涉及灭活革兰氏阳性细菌、细菌芽孢或革兰氏阴性细菌的方法。该方法包括使革兰氏阳性细菌、细菌芽孢或革兰氏阴性细菌与灭活细菌的或灭活细菌芽孢的乳液接触。美国专利号6,506,803涉及利用乳液杀死或中和人体上或人体中的微生物剂例如，细菌、病毒、孢子、真菌的方法。美国专利号6,559,189涉及净化样品人、动物、食品、医疗器械等的方法，包括使样品与纳米乳液接触。纳米乳液在与细菌、病毒、真菌、原生动物或孢。
14、子接触时杀死病原体或使病原体失去能力。抗微生物纳米乳液包括季铵化合物、乙醇/甘油/PEG之一和表面活性剂。美国专利号6,635,676涉及两种不同的组合物和通过用任一组合物处理样品而净化样品的方法。组合物1包括乳液，其是抵抗细菌、病毒、真菌、原生动物和孢子的抗微生物乳液。乳液包括油和季铵化合物。美国专利号7,314,624涉及引起对免疫原的免疫应答的方法，包括用免疫原和纳米乳液的组合通过黏膜表面处理对象。纳米乳液包括油、乙醇、表面活性剂、季铵化合物和蒸馏水。US20050208083和US20060251684涉及纳米乳液，其含具有优选尺寸的小滴。US20070054834涉及包括季铵卤化物的。
15、组合物和利用其治疗感染状况的方法。季铵化合物可被提供作为乳液的部分。US20070036831和US20110200657涉及纳米乳液，其包括抗炎剂。描述纳米乳液的其它出版物包括美国专利号8,226,965，“METHODSOFTREATINGFUNGAL,YEASTANDMOLDINFECTIONS”；US20090269394，“METHODSANDCOMPOSITIONSFORTREATINGONYCHOMYCOSIS”；US20100075914，“METHODSFORTREATINGHERPESVIRUSINFECTIONS”；US20100092526，“NANOEMULSIONT。
16、HERAPEUTICCOMPOSITIONSANDMETHODSOFUSINGTHESAME”；US20100226983，“COMPOSITIONSFORTREATMENTANDPREVENTIONOFACNE,METHODSOFMAKINGTHECOMPOSITIONS,ANDMETHODSOFUSETHEREOF”；US20120171249，“COMPOSITIONSFORINACTIVATINGPATHOGENICMICROORGANISMS,METHODSOFMAKINGTHECOMPOSITIONS,ANDMETHODSOFUSETHEREOF”；和US20120064136，“。
17、ANTIAGINGANDWRINKLETREATMENTMETHODSUSINGNANOEMULSIONCOMPOSITIONS”。然而，这些参考文献均未教导本发明的方法、组合物和试剂盒。0011尤其地，美国专利号7,314,624描述纳米乳液疫苗。然而，该参考文献没有教导利用本发明的免疫原引起对RSV的保护性免疫应答的能力。0012涉及疫苗的现有技术包括，例如美国专利号7,731,967，“COMPOSITIONFORINDUCINGIMMUNERESPONSE”NOVARTIS，其描述抗原/佐剂复合物包括至少两种佐剂。美国专利号7,357,936，“ADJUVANTSYSTEMSANDVA。
18、CCINES”GSK，描述佐剂和抗原的组合。美国专利号7,323,182，“OILINWATEREMULSIONCONTAININGSAPONINS”GSK，描述疫苗组合物和油/水制剂。美国专利号6,867,000，“METHODOFENHANCINGIMMUNERESPONSETOHERPES”WYETH，描述病毒抗原和细胞因子IL12的组合。美国专利号6,623,739、6,372,227和6,146,632，名称均为“VACCINES”GSK，涉及包括抗原和/或抗原组合物的免疫原性组合物和由可代谢的油和水包油乳液形式的生育酚组成的佐剂。美国专利号6,451,325，“ADJUVANTFO。
19、RMULATIONCOMPRISINGASUBMICRONOILDROPLET说明书CN104093421A3/47页6EMULSION”CHIRON，涉及佐剂组合物，包括可代谢的油、乳化剂和抗原物质，其中油和乳化剂以水包油乳液的形式存在。佐剂组合物不含有任何聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段共聚物；和抗原物质不存在于佐剂组合物的内相中。最后，US20040151734，“VACCINEANDMETHODOFUSE”GSK，描述治疗患有或容易患有一种或多种性传播疾病STDS的女性对象的方法。该方法包括给需要的女性对象施用有效量的疫苗制剂，该制剂包括一种或多种抗原，所述抗原源自或结合导致STD的病原体和佐剂。。
20、0013在本领域中对于有效的RSV疫苗及其制造和应用方法仍存在需要。本发明满足这些需要。0014发明概述0015本发明提供通过组合至少一种关键免疫原性病毒表面抗原例如F和G蛋白质或其抗原片段与递送型和免疫增强型水包油纳米乳液而递送和引起针对RSV感染的保护性免疫应答的新方法。例如，本发明纳米乳液RSV亚单位疫苗引起TH1免疫应答、TH2免疫应答、TH17免疫应答、或其任意组合。0016纳米乳液RSV亚单位疫苗包括至少一种RSV免疫原，其是RSVF蛋白质、RSVG蛋白质、RSVF蛋白质的免疫原性片段、RSVG蛋白质的免疫原性片段、或其任意组合。另外，纳米乳液RSV亚单位疫苗包括平均直径小于约10。
21、00NM的小滴。存在于RSV亚单位疫苗中的纳米乳液包括A含水相，B至少一种油，C至少一种表面活性剂，D至少一种有机溶剂，和E任选地至少一种螯合剂。优选地，RSV免疫原存在于纳米乳液小滴中。在另外的实施方式中，纳米乳液RSV疫苗可经鼻内施用。在本发明再另外的实施方式中，纳米乳液RSV疫苗不含有机溶剂。而且，另外的佐剂可加入至纳米乳液RSV疫苗。0017在本发明的另外实施方式中，RSV病毒体颗粒还存在于纳米乳液RSV亚单位疫苗中。优选地，RSV病毒体颗粒存在于纳米乳液小滴中。RSV病毒体颗粒可经纳米乳液灭活。在一个实施方式中，RSV病毒基因组包括至少一个减毒突变。0018纳米乳液RSV亚单位疫苗可。
22、被配制成任何药学上可接受的剂型，诸如液体分散体、凝胶、气溶胶、肺气溶胶、鼻气溶胶、软膏、霜或固体剂型。0019RSV表面抗原和/或RSV病毒体颗粒可来自任意RSV毒株。在一个实施方式中，RSV表面抗原和/或RSV病毒体颗粒源自呼吸道合胞病毒RSV毒株L19RSVL19。在另外的实施方式中，RSVL19病毒是与病毒颗粒结合的融合物F和糖蛋白G结构蛋白质的超级生产者。在再另外的实施方式中，RSVL19病毒是减毒的人呼吸道合胞病毒HRSV毒株L19。在一个实施方式中，疫苗组合物包括人呼吸道合胞病毒，其以HRSVL19保藏在美国典型培养物保藏中心ATCC。0020在一个实施方式中，RSV表面抗原还包括。
23、至少一种指示减毒表型的核苷酸修饰。在另外的实施方式中，RSV表面抗原或其抗原片段存在于融合蛋白质中。RSV表面抗原可以是RSVF蛋白质的肽片段、RSVG蛋白质的肽片段、或其任意组合。另外，RSV表面抗原可以是多价的。0021在本发明的另外实施方式中，提供制备免疫原性制剂的方法，由此RSV毒株，诸如HRSVL19，通过导致减毒表型的减毒突变和缺失被遗传工程化。所得减毒RSV病毒在适当的细胞系中培养和收获。然后，纯化收获的病毒去除细胞和血清成分。然后，纯化病毒混合在可接受的制药学载体中用于疫苗组合物。因此，描述的是这样的疫苗组合物，其包括包含说明书CN104093421A4/47页7至少一个减毒突。
24、变的RSV病毒基因组诸如RSV毒株L19，优选与以下物质组合F蛋白质、G蛋白质、F和/或G蛋白质的抗原片段、或其任意组合。在再另外的实施方式中，疫苗组合物包括RSV病毒基因组诸如RSV毒株L19，其包含指示减毒表型的核苷酸修饰。0022在本发明的另外实施方式中，疫苗组合物对于对象不是全身毒性的，并且在施用后产生最小炎症或不产生炎症。在另外的实施方式中，对象在单一施用疫苗后经历血清转换。0023在一个实施方式中，描述的是增强对人呼吸道合胞病毒感染的免疫性的方法，包括给对象施用纳米乳液制剂其包括RSVF和/或G蛋白质和/或其抗原片段。本发明的另外实施方式涉及引起针对由人呼吸道合胞病毒引起的疾病增强。
25、的免疫性的方法，包括给对象使用有效量的本发明疫苗组合物的步骤。在一些实施方式中，对象在至少单一施用纳米乳液RSV疫苗后可产生保护性免疫应答。另外，免疫应答针对一种或多种RSV毒株可以是保护性的。对HRSV增强的免疫性的诱导取决于最佳水平抗原的存在。而且，对抗原临界水平的鉴定对于提供有力的免疫应答是重要的。对于RSVF蛋白质水平与中和抗体的存在和持续以及针对病毒攻击的保护直接相关的证明，表明使产生最佳水平的关键免疫原性F蛋白质的病毒毒株以其自然方向表达对于用作候选疫苗是基本的。0024在本发明进一步的实施方式中，RSVF和/或G蛋白质和/或其抗原片段和/或RSV病毒体颗粒被灭活，并辅助以纳米乳液。
26、制剂，以提供非感染性并且免疫原性病毒制剂。纳米乳液与候选疫苗的简单混合已经被显示同时产生黏膜和系统性免疫应答。RSV病毒体颗粒与纳米乳液的混合导致小滴的油核心中离散的抗原颗粒。抗原并入核心中，这使其处于促进正常抗原构象的自由形式。0025RSV疫苗可被配制为液体分散体、凝胶、气溶胶、肺气溶胶、鼻气溶胶、软膏、霜或固体剂型。另外，RSV疫苗可经任意药学上可接受的方法施用，诸如肠胃外、经口、经鼻内或经直肠。肠胃外施用可通过皮内、皮下、腹膜内或肌肉内注射进行。0026在本发明的另外实施方式中，纳米乳液RSV疫苗组合物包括A至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂；B至少一种阳离子表面活性。
27、剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中非阳离子表面活性剂是非离子表面活性剂；C至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中非阳离子表面活性剂是聚山梨醇酯非离子表面活性剂、波洛沙姆非离子表面活性剂、或其组合；D至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子表面活性剂，其是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、波洛沙姆188、波洛沙姆407、或其组合；E至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子表面活性剂，其是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、波洛沙姆188、波洛沙姆407、或其组合，并且其中非离子表面活性剂以约001至约50、或以约01至约3存在；E至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性。
28、剂，其中非阳离子表面活性剂是非离子表面活性剂，并且非离子表面活性剂以约005至约10、约005至约70、约01至约7或约05至约4的浓度存在；F至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子表面活性剂，其中阳离子表面活性剂以约005至约2或约001至约2的浓度存在；或G其任意组合。0027在本发明再另外的实施方式中，RSV疫苗包括低分子量脱乙酰壳多糖、中分子量脱乙酰壳多糖、高分子量脱乙酰壳多糖、葡聚糖、或其任意组合。低分子量脱乙酰壳多糖、中分说明书CN104093421A5/47页8子量脱乙酰壳多糖、高分子量脱乙酰壳多糖、葡聚糖、或其任意组合可存在于纳米乳液中。0028上面的一般性描述和下面对附图的。
29、简述以及详细描述均是示例性的和说明性的，并意图对所要求保护的发明提供进一步的说明。其它目标、优势和新特征通过以下对本发明的详细描述对于本领域技术人员而言将是显而易见的。附图简介0029图1显示具有和不具有30G总HA的20W805ECNE的TEM横截面图。右边的图图示HA抗原位于油小滴中。染成深色的抗原位于NE颗粒外面。0030图2显示用RSV免疫的BALB/C小鼠血清中RSV特异性IGG的终点滴度。仅用20W805EC混合F蛋白质免疫的组响应接种。条表示组平均水平。0031图3显示用NEFPTN免疫的BALB/C小鼠血清中RSV特异性IGG1A、IGG2AB、IGG2BC和IGED的终点滴度。
30、。血清在第二次免疫后两周获得。0032图4显示用纳米乳液NEF蛋白质接种小鼠的结果在经活RSV鼻内攻击后减轻疾病。免疫的小鼠经鼻内IN接种两次在第0和28天以NEF蛋白质、单独的F蛋白质，或仅以PBS进行处理。对照和接种的小鼠在通过105PFU活RSV加强IN后两周被攻击。病毒转录物的表达在感染后第八天通过肺RNA的QPCR测定。0033图5显示与未接种小鼠相比时，纳米乳液NERSV免疫不促进免疫强化。如下所述用NERSV接种小鼠。对照和接种的小鼠在第56天被攻击。气道高反应性在攻击后第八天经体积描述法评估。柱表示在单一、最优的静脉内剂量的乙酰甲基胆碱之后气道阻力的增加。0034图6显示纳米乳。
31、液NEF蛋白质接种的小鼠中炎症和黏液产生与对照并无不同。A描述在感染后第八天RSV感染的对照和NEF蛋白质接种的小鼠的代表性组织学过碘酸希夫，PAS；苏木精和曙红，HE。嗜伊红粒细胞不存在。在B中，MUC5AC和GOB5的表达在感染后第八天经肺RNA的QPCR评估。0035图7显示纳米乳液NEF蛋白质接种促进混合的TH1和TH2应答。小鼠被接种NEF蛋白质、单独的F蛋白质，如下所述，并被活RSV攻击。在A中，IL12P40和BIL17细胞因子的表达由肺RNA经QPCR评估。在C中，肺相关淋巴结LALN细胞悬浮液用RSVMOI,05再刺激。收集上清液用于分析BIOPLEX，以分析每个样品中细胞因。
32、子产量。0036图8显示F蛋白质单位，其在通过以下各种制剂施用/免疫后被测量145GF蛋白质；225GF蛋白质；355LRSV/丙酸内酯PL；456LRSV；505GF/56LRSV；61GF/56LRSV/丙酸内酯PL；和725GF/56LRSV。0037图9显示在仅经1F蛋白；仅经2RSV病毒；和经3RSV病毒F蛋白质免疫后，肺中IL4、IL5、IL13、IFN、IL17A和GOB5的MRNA表达。0038图10显示被免疫和攻击的小鼠的组织学检查。图10A显示初始RSV感染的组织学检查；图10B显示RSVNE免疫动物的组织学检查；图10C显示F蛋白质免疫动物的组织学检查；和图10D显示RS。
33、VF蛋白质免疫动物的组织学检查。0039图11显示通过L19和A2的HRSV感染的细胞溶胞产物SDS处理的的SDSPAGE。说明书CN104093421A6/47页90040图12显示RSV毒株L19和RSV毒株A2HRSV细胞溶胞产物细胞上清液的SDSPAGE。0041图13显示HRSV毒株L19和毒株A2纯化病毒的SDSPAGE。0042图14显示HRSV毒株L19和毒株A2F的蛋白质印迹和病毒感染后24小时的G蛋白质表达。0043图15通过蛋白质印迹评估显示病毒灭活，其中泳道含有1W805EC泳道1，2W805EC003B1,3葡聚糖泳道2，3W805EC03脱乙酰壳多糖中分子量乙酸泳道。
34、3，4W805EC03P407泳道4，5W805EC03脱乙酰壳多糖低分子量01乙酸泳道5，6仅介质泳道6；7PL灭活的病毒泳道7和8L19阳性对照泳道9。0044图16显示利用抗RSV抗体抗G进行的蛋白质印迹分析；L19病毒4106PFU/泳道、2106PFU/泳道和1106PFU/泳道/PL灭活组合W805EC，如所指示。在开始时图8A或14天后在4或室温RT图8B下分析样本。MM分子量。0045图17显示在用具有和不具有脱乙酰壳多糖的不同纳米乳液制剂IM接种的小鼠中接种后第三周的免疫应答IGG，G/ML1RSV毒株L1925W805EC01低分子量脱乙酰壳多糖；2RSV毒株L195W80。
35、5EC；3RSV毒株L1925W805EC；4RSV毒株L19PL灭活的病毒；和5未接种小鼠没有疫苗。0046图18显示接种时间表，用于在棉鼠中评估两种纳米乳液辅助的疫苗实施例13。评估的两种制剂包括W805EC和W80P1885EC115见下面表5和6。棉鼠接收两种剂量的30LIN的纳米乳液辅助的疫苗，其含有66GFPTN。它们在23周时被5105PFURSV毒株A2攻击。一半动物在第4天被处死，而另一半在第8天被处死。0047图19显示棉鼠中W80P1885EC纳米乳液灭活的RSV疫苗的免疫原性研究的结果。在左图中，Y轴显示特异性抗体对F蛋白质的终点滴度，和X轴以周为单位显示时间段。在右图。
36、中，Y轴显示血清抗体水平，为G/ML，和X轴以周为单位显示时间段。D4和D8显示攻击后血清中的抗体水平。0048图20显示棉鼠中W805EC纳米乳液灭活的RSV疫苗的免疫原性研究的结果。Y轴显示特异性抗体对F蛋白质的终点滴度，和X轴以周为单位显示时间段。0049图21显示棉鼠中RSV中和的免疫原性。棉鼠被经鼻内接种30L疫苗，在4周时加强和在0、4、6和8周时抽血。研究组包括两组，其接收混合以16105PFURSV毒株L19含33GF蛋白质N8或32105PFURSV毒株L19含66GF蛋白质N820W805EC纳米乳液，以及这样的两组，其接收混合以16105PFURSV毒株L19含33GF蛋。
37、白质N8或32105PFURSV毒株L19含66GF蛋白质N8的20W80P1885EC纳米乳液。中和单位NEU表示导致50空斑减少的最高稀释度的倒数。NEU测量在4周加强前和6周加强后2周时进行。在6周时获得的样本产生的体液免疫应答足以允许进行NEU分析。数据表示为几何平均值，具有95置信区间CI图21A。利用施佩尔曼秩相关系数在6周时对所有动物进行EU和NEU相关。0050图22显示第4天和第8天的中和抗体。图22A显示W80P1885EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果，和图22B显示W805EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果。所有棉鼠均显示针对疫苗RSV毒株L19的高中和抗体NU。
38、。中和抗体在攻击后稳定增加Y轴。第8说明书CN104093421A7/47页10天中和单位NU高于第4天NU。未接种小鼠在其血清中不显示任何中和活性。0051图23显示血清抗体的特异性活性，当与攻击后第4天相比时，显示血清抗体的特异性活性中和单位/ELISA单位趋于在第8天提高。图23A显示在第4天和第8天，W80P1885EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果NU/EU，Y轴。图23B显示在第4天和第8天，W805EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果NU/EU，Y轴。0052图24显示接收3剂量的RSVL19辅助的疫苗，然后被RSV毒株A2攻击的棉鼠在第4天的交叉保护。图24A显示W80P。
39、1885EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果，和图24B显示W805EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果。血清中和活性显示针对RSV毒株L19或RSV毒株A2相当的NU，表明两个RSV毒株之间的交叉保护。0053图25显示第4天在棉鼠肺中的病毒清除RSV毒株A2。接种的棉鼠接种W80P1885EC纳米乳液组合RSV毒株L19或W805EC纳米乳液组合RSV毒株L19显示从棉鼠肺中完成清除RSV毒株A2激发的病毒。未接种动物的肺显示103PFURSV毒株A2/克。0054图26显示IM棉鼠接种和攻击时间表。0055图27显示IM接种混合16105PFURSV毒株L19含33GF蛋白质的20W。
40、805EC纳米乳液的棉鼠中的血清免疫应答。Y轴显示14周周期内在攻击后第4天和攻击后第8天的血清IGG，G/ML。0056图28显示IM接种混合16105PFURSV毒株L19含33GF蛋白质的20W805EC纳米乳液的棉鼠中的血清免疫应答。图28A显示14周周期内在攻击后第4天和攻击后第8天的终点滴度Y轴。图28B显示14周周期内在攻击后第4天和攻击后第8天的ELISA单位Y轴。0057图29显示IM接种的棉鼠，与未接种动物相比，其在攻击后4天显示完全清除RSV4。显示第4天在棉鼠肺中的病毒清除RSV毒株A2。IM接种的棉鼠接种W805EC纳米乳液组合RSV毒株L19显示从棉鼠肺中完全清除R。
41、SV毒株A2激发的病毒。未接种动物显示肺的103PFURSV毒株A2或更高/克。0058图30显示IM或IN接种RSV疫苗含2105空斑形成单位PFU的L19RSV病毒和由20W805EC纳米乳液佐剂灭活的17G的F蛋白质的小鼠在8周周期X轴内的抗F抗体Y轴的测量结果。BALB/C小鼠N10/臂在第0和4周被IN或IM接种。分析血清的抗F抗体。0059图31显示RSV特异性细胞因子的测量结果。在BALB/C小鼠N10/臂在第0和4周IN或IM接种RSV疫苗含2105空斑形成单位PFU的L19RSV病毒和由20W805EC纳米乳液佐剂灭活的17G的F蛋白质后，在来自脾、子宫颈和肠淋巴结LN细胞中。
42、测量细胞因子。被测量的细胞因子包括IFNG、IL2、IL4、IL5、IL10和IL17。0060图32显示在BALB/C小鼠N10/臂在第0和4周IN或IM接种RSV疫苗含2105空斑形成单位PFU的L19RSV病毒和由20W805EC纳米乳液佐剂灭活的17G的F蛋白质后，肺组织中细胞因子IL4、IL13和IL17的测量结果。在IM施用后，IL4和IL13显示较高的表达，其中IL17在IN施用后显示较高的表达。0061图33显示在BALB/C小鼠N10/臂在第0和4周IN或IM接种RSV疫苗含2105空斑形成单位PFU的L19RSV病毒和17GF蛋白质后，小鼠中气道阻力CMH20/ML/SEC。
43、的测量结果。说明书CN104093421A108/47页110062发明描述0063I概述0064本发明提供RSV表面抗原、F和G蛋白质混合纳米乳液的新制剂，以解决在RSV疫苗的之前的数据中观察到的不足的免疫应答。针对RSV的最佳疫苗不仅要预防急性病毒感染，而且还要预防再感染。0065纳米乳液RSV亚单位疫苗包括至少一种RSV免疫原，其是RSVF蛋白质、RSVG蛋白质、RSVF蛋白质的免疫原性片段、RSVG蛋白质的免疫原性片段、或其任意组合。另外，纳米乳液RSV亚单位疫苗包括纳米乳液小滴，其平均直径小于约1000NM。优选地，RSV免疫原存在于纳米乳液小滴中。在本发明的另外实施方式中，RSV病。
44、毒体颗粒还存在于纳米乳液RSV亚单位疫苗中。优选地，RSV病毒体颗粒存在于纳米乳液小滴中。0066本发明提供新方法，其通过组合关键免疫原性RSV病毒表面抗原、F和/或G蛋白质与递送型和免疫增强型水包油纳米乳液，递送和引起针对RSV感染的保护性免疫应答。分离的RSV病毒表面抗原显示为独立于其它病毒成分，诸如病毒蛋白质NS1，的主要病毒免疫原可使导致疾病加重的免疫应答偏移，其是亚单位疫苗的重要基础。进一步，混合一种或多种RSV表面抗原与纳米乳液加强本发明的新颖性，其中所述纳米乳液优先封装抗原和充当适当的免疫细胞的递送系统而且还充当有效的免疫增强型组分。与其它亚单位疫苗和结果缺乏全功能的人疫苗的重组。
45、疫苗相比，纳米乳液RSV亚单位病毒表面抗原提供相比于之前的候选物在产生强的、可持续和保护性免疫应答的能力方面明显的新颖性。0067对RSV的增强的免疫性的引发取决于最佳水平的抗原的存在和呈递。组合分离的RSV表面抗原与纳米乳液提供新的方法，以将疫苗递送至免疫应答的合适的抗原呈递细胞。0068本发明纳米乳液组合物用作疫苗佐剂。佐剂用于1使抗原刺激特异性保护性免疫应答的物质与免疫系统接触和影响产生的免疫的类型以及免疫应答的质量量级或持续时间；2降低某些抗原的毒性；3降低保护性应答所需的抗原的量；4降低保护所需要的剂量数；5增强差的响应亚群的免疫性和/或7提供一些疫苗成分的溶解度。0069在一个实施。
46、方式中，可利用衍生自RSV和与纳米乳液混合的表面抗原F和G蛋白质构建多价亚单位疫苗。0070在另外的实施方式中，衍生物和融合蛋白质可自RSV表面抗原F和G蛋白质设计，然后与纳米乳液混合以产生亚单位疫苗。0071在一个实施方式中，亚单位疫苗可用一种或多种RSV表面抗原即，F和G蛋白质混合纳米乳液构建。完全有可能使F和G蛋白质一起加入并与纳米乳液混合在所得亚单位疫苗组合物中。在另外的实施方式中，混合纳米乳液的F或G蛋白质是根据本发明的合适的亚单位疫苗。F和/或G蛋白质的抗原片段也可用于本发明的纳米乳液RSV疫苗中。0072纳米乳液是水包油乳液，其由纳米尺寸的小滴与油水界面处的表面活性剂一种或多种组。
47、成。由于其尺寸，纳米乳液小滴被树突细胞胞饮，所述树突细胞控制细胞成熟和对免疫系统有效抗原呈递。当混合不同的抗原时，纳米乳液佐剂引起并上调强的体液和细胞TH1型应答以及黏膜免疫性MAKIDON等,“PRECLINICALEVALUATIONOFANOVELNANOEMULSIONBASEDHEPATITISBMUCOSALVACCINE”,PLOSONE382954；说明书CN104093421A119/47页121152008；HAMOUDA等,“ANOVELNANOEMULSIONADJUVANTENHANCINGTHEIMMUNERESPONSEFROMINTRANASALINFLUENZ。
48、AVACCINEINMICEINNATIONALFOUNDATIONFORINFECTIOUSDISEASE”,11THANNUALCONFERENCEONVACCINERESEARCHBALTIMORE,MD2008；MYC等,“DEVELOPMENTOFIMMUNERESPONSETHATPROTECTSMICEFROMVIRALPNEUMONITISAFTERASINGLEINTRANASALIMMUNIZATIONWITHINFLUENZAAVIRUSANDNANOEMULSION”,VACCINE,2125263801142003；BIELINSKA等,“MUCOSALIMMUNIZ。
49、ATIONWITHANOVELNANOEMULSIONBASEDRECOMBINANTANTHRAXPROTECTIVEANTIGENVACCINEPROTECTSAGAINSTBACILLUSANTHRACISSPORECHALLENGE”,INFECTIMMUN,758402092007；BIELINSKA等,“NASALIMMUNIZATIONWITHARECOMBINANTHIVGP120ANDNANOEMULSIONADJUVANTPRODUCESTH1POLARIZEDRESPONSESANDNEUTRALIZINGANTIBODIESTOPRIMARYHIVTYPE1ISOLATES,”AIDSRESEARCHANDHUMANRETROVIRUSES,242271812008；BIELINSKA等,“ANOVEL,KILLEDVIRUSNASALVACCINIAVIRUSVACCINE,”CLINVACCINEIMMUNOL,152348582008；WARREN等,“PHARMACOLOGICALANDTOXICOLOGICALSTUDIESONCETYLPYRIDINIUM,A。