生防菌B29的发酵方法.pdf

生防菌B29的发酵方法，涉及一种芽孢杆菌的发酵方法。是要解决现有的脂肽类抗生素产生菌产抗生素的能力较低，芽孢产生缓慢，产率低的问题。方法：一、将生防菌B29甘油菌转划线至LB平板上，培养，挑取单菌落转接至LB培养基中，培养得到活化菌种；二、将活化的菌种接种于LB培养基中，培养作为发酵罐种子；三、全自动发酵罐发酵生防菌B29菌株：灭菌温度121℃，罐压0.8MPa；发酵温度33～34℃，搅拌速度340～350r/min，消沫灵敏度5；发酵全程控制溶氧不低于30％，pH值6～8，溶氧控制与搅拌通气联动。该方法可在16小时以内完全形成芽孢，脂肽类抗生素产量显著提高，本发明用于发酵生产脂肽类抗生素。

1.  生防菌B29的发酵方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、将-80℃保存的生防菌B29甘油菌种于室温融化后，挑取一环转划线至LB平板上，于37℃培养24h，用接种环挑取单菌落转接至LB液体培养基中，于30℃、200r/min培养24h，得到活化菌种；
二、将活化的菌种接种于LB液体培养基中，于30℃、200r/min培养24h，作为发酵罐种子；
三、全自动发酵罐发酵生防菌B29菌株：将发酵罐种子接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：
灭菌：采用发酵罐自动程序进行灭菌，最高温度121℃，罐压0.8MPa，到达最高温度维持15min；
初始参数设定：发酵温度33～34℃，搅拌速度340～350r/min，消沫灵敏度5；
自动控制设定：设发酵液的初始饱和溶氧量为100％，在发酵全程中溶氧不低于初始饱和溶氧量的30％，pH值为6～8，溶氧控制与搅拌通气联动。

2.  根据权利要求1所述的生防菌B29的发酵方法，其特征在于步骤一中所述生防菌B29为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B29。

3.  根据权利要求1或2所述的生防菌B29的发酵方法，其特征在于步骤三中全自动发酵罐为20L，其中装入10L发酵培养基。

4.  根据权利要求3所述的生防菌B29的发酵方法，其特征在于所述发酵培养基按重量百分含量由1％的葡萄糖、0.8％的酵母膏、0.5％的NaCl、0.02％的MgSO₄、0.02％的K₂HPO₄、0.02％的CaCO₃和余量的蒸馏水组成，调整pH至7.0，于115℃灭菌20min，备用。

5.  根据权利要求4所述的生防菌B29的发酵方法，其特征在于步骤三中发酵温度33.2～33.8℃。

6.  根据权利要求4所述的生防菌B29的发酵方法，其特征在于步骤三中发酵温度33.07℃。

7.  根据权利要求6所述的生防菌B29的发酵方法，其特征在于步骤三中搅拌速度342～348r/min。

8.  根据权利要求6所述的生防菌B29的发酵方法，其特征在于步骤三中搅拌速度347.8r/min。

9.  根据权利要求8所述的生防菌B29的发酵方法，其特征在于步骤三中pH值为6.5～7.5。

10.  根据权利要求8所述的生防菌B29的发酵方法，其特征在于步骤三中pH值为6.91。

生防菌B29的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种芽孢杆菌的发酵方法。
背景技术
植物病害给农业造成严重经济损失，施用化学药剂是人类防治植物病害的主要策略。但是，长期大量施用化学农药导致的农药残留、环境污染、危害人类健康、破坏生态平衡、病害产生抗药性等问题日益突出。生物防治因其对环境、生态友好，对人类健康、安全、无毒等优点得到了世界各国的广泛重视并发挥着越来越重要的作用。
生防菌B29的菌株保藏号CGMCC 0752，经鉴定属于芽孢杆菌属，其对多尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌等多种植物病原真菌均有抑制作用，是高效广谱的生防菌株。芽孢杆菌防治植物病害的研究现状芽孢杆菌易从土壤和植株中分离得到，能产生耐热、抗逆性的芽孢，具有显著的生防潜力。并且芽孢杆菌利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。芽孢杆菌在自然生长和发酵培养后期可产生的具有抗菌活性的脂肽类抗生素，包括伊枯草菌素(iturins)、泛革素(fengycin)和表面活性素(surfactin)等。目前脂肽类抗生素产生菌产抗生素的能力普遍较低。另外在实际科研中发现，随着实验的延长，菌株的产孢率逐年下降，为后续科研工作带来诸多弊端，也制约实际的生产科研需求，因此寻求产孢条件的控制变为极为重要。
发明内容
本发明是要解决现有的脂肽类抗生素产生菌产抗生素的能力较低，芽孢产生缓慢，产率低的问题，提供一种生防菌B29的发酵方法。
本发明生防菌B29的发酵方法，按以下步骤进行：
一、将-80℃保存的生防菌B29甘油菌种于室温融化后，挑取一环转划线至LB平板上，于37℃培养24h，用接种环挑取单菌落转接至LB液体培养基中，于30℃、200r/min培养24h，得到活化菌种；
二、将活化的菌种接种于LB液体培养基中，于30℃、200r/min培养24h，作为发酵罐种子；
三、全自动发酵罐发酵生防菌B29菌株：将发酵罐种子接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：
灭菌：采用发酵罐自动程序进行灭菌，最高温度121℃，罐压0.8MPa，到达最高温度维持15min；
初始参数设定：发酵温度33～34℃，搅拌速度340～350r/min，消沫灵敏度5；
自动控制设定：设发酵液的初始饱和溶氧量为100％，在发酵全程中溶氧不低于初始饱和溶氧量的30％，pH值为6～8，溶氧控制与搅拌通气联动。
步骤一中生防菌B29为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B29，已在《高效生防菌B29抗菌物质基因组文库的构建》(黑龙江科学，2013年9月，第4卷第9期)中公开，可由文章作者处获得。
本发明的有益效果：
利用本发明的方法发酵生防菌B29，菌株可在16小时以内完全形成芽孢，解决了原有发酵过程中芽孢产生缓慢，产率低的问题(目前脂肽类抗生素产生菌的芽孢形成时间大于24小时)。本发明的发酵方法可使脂肽类抗生素产量达到0.72～0.79mg/mL，与现有方法相比得到了显著的提高。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式生防菌B29的发酵方法，按以下步骤进行：
一、将-80℃保存的生防菌B29甘油菌种于室温融化后，挑取一环转划线至LB平板上，于37℃培养24h，用接种环挑取单菌落转接至LB液体培养基中，于30℃、200r/min培养24h，得到活化菌种；
二、将活化的菌种接种于LB液体培养基中，于30℃、200r/min培养24h，作为发酵罐种子；
三、全自动发酵罐发酵生防菌B29菌株：将发酵罐种子接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：
灭菌：采用发酵罐自动程序进行灭菌，最高温度121℃，罐压0.8MPa，到达最高温度维持15min；
初始参数设定：发酵温度33～34℃，搅拌速度340～350r/min，消沫灵敏度5；
自动控制设定：设发酵液的初始饱和溶氧量为100％，在发酵全程中溶氧不低于初始饱和溶氧量的30％，pH值为6～8，溶氧控制与搅拌通气联动。
步骤一中所述LB平板为LB固体培养基。
LB液体培养基：酵母粉1％(质量)，胰蛋白胨0.5％(质量)，NaCl 0.5％(质量)，调整pH至7.0，于115℃，灭菌20min，备用。LB固体培养基是在LB液体培养基中添加1％(质量)的琼脂粉。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中生防菌B29为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B29。其它与具体实施方式一相同。
本实施方式所述枯草芽孢杆菌B29已在《高效生防菌B29抗菌物质基因组文库的构建》(黑龙江科学，2013年9月，第4卷第9期)中公开，可由文章作者处获得。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤三中全自动发酵罐为20L，其中装入10L发酵培养基。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述发酵培养基按重量百分含量由1％的葡萄糖、0.8％的酵母膏、0.5％的NaCl、0.02％的MgSO₄、0.02％的K₂HPO₄、0.02％的CaCO₃和余量的蒸馏水组成，调整pH至7.0，于115℃灭菌20min，备用。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中发酵温度33.2～33.8℃。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中发酵温度33.4～33.6℃。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中发酵温度33.07℃。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中搅拌速度342～348r/min。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中搅拌速度344～346r/min。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中搅拌速度347.8r/min。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤三中pH值为6.5～7.5。其它与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤三中pH 值为6.91。其它与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式生防菌B29的发酵方法，按以下步骤进行：
一、将-80℃保存的生防菌B29甘油菌种于室温融化后，挑取一环转划线至LB平板上，于37℃培养24h，用接种环挑取单菌落转接至含有5ml LB液体培养基的试管中，于30℃、200r/min培养24h，得到活化菌种；
二、将活化好的菌种接种于含有50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，于30℃、200r/min培养24h，作为发酵罐种子；
三、全自动发酵罐发酵生防菌B29菌株：将发酵罐种子接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：
灭菌：采用发酵罐自动程序进行灭菌，最高温度121℃，罐压0.8MPa，到达最高温度维持15min；
初始参数设定：发酵温度33.07℃，搅拌速度347.8r/min，消沫灵敏度5；
自动控制设定：设发酵液的初始饱和溶氧量为100％，在发酵全程中溶氧不低于初始饱和溶氧量的40％，pH值为6.91，溶氧控制与搅拌通气联动。
步骤一中生防菌B29为枯草芽孢杆菌B29，已在《高效生防菌B29抗菌物质基因组文库的构建》(黑龙江科学，2013年9月，第4卷第9期)中公开，可由文章作者处获得。
步骤一中所述LB平板为LB固体培养基。
步骤一中LB液体培养基：酵母粉1％(质量)，胰蛋白胨0.5％(质量)，NaCl 0.5％(质量)，调整pH至7.0，于115℃，灭菌20min，备用。LB固体培养基是在LB液体培养基中添加1％(质量)的琼脂粉。
步骤三中所述发酵培养基按重量百分含量由1％的葡萄糖、0.8％的酵母膏、0.5％的NaCl、0.02％的MgSO₄、0.02％的K₂HPO₄、0.02％的CaCO₃和余量的蒸馏水组成，调整pH至7.0，于115℃灭菌20min，备用。
本实施方式中生防菌B29菌株可在16小时以内完全形成芽孢，解决了原有发酵过程中芽孢产生缓慢，产率低的问题。其脂肽类抗生素产量为0.7623mg/mL。