一种具有协同抑制病毒诱导细胞转化与白血病的药物组合及其应用.pdf

本发明公开了一种具有协同抑制病毒诱导细胞转化与白血病的药物组合及其应用。本发明的药物组合由JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂组成；所述JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂为SMI-4a；所述PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂为Rapamyicn或LY294002。通过实验证明：本发明的药物组合的应用能够有效的在细胞水平上协同诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时在小鼠活体实验上能够更显著的抑制肿瘤生长，为慢性髓性白血病的治疗提供了新的思路。

1.  JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂在制备具有如下(1)-(4)中至少一种功能的产品中的应用：
(1)预防和/或治疗慢性髓性白血病；
(2)抑制JAK/STAT/Pim信号通路和PI3K/AKT/mTOR信号通路下游的共同底物磷酸化；
(3)促进肿瘤细胞凋亡；
(4)抑制肿瘤细胞成瘤能力。

2.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和所述PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂的物质的量比为(0.3125-10)：1。

3.  根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂为SMI-4a；所述PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂为Rapamyicn或LY294002；
所述SMI-4a和所述Rapamyicn的物质的量比为(0.625-10)：1；
所述SMI-4a和所述LY294002的物质的量比为(0.3125-2.5)：1。

4.  根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述共同底物为eIF4B；所述肿瘤细胞为白血病细胞；所述白血病细胞具体为NS2细胞或K562细胞。

5.  一种产品，其活性成分为JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂；所述产品的用途为如下(1)-(4)中的至少一种：
(1)预防和/或治疗慢性髓性白血病；
(2)抑制JAK/STAT/Pim信号通路和PI3K/AKT/mTOR信号通路下游的共同底物磷酸化水平；
(3)促进肿瘤细胞凋亡；
(4)抑制肿瘤细胞成瘤能力。

6.  根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和所述PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂的物质的量比为(0.3125-10)：1。

7.  根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于：所述JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂为SMI-4a；所述PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂Rapamyicn或LY294002；
所述SMI-4a和所述Rapamyicn的物质的量比为(0.625-10)：1；
所述SMI-4a和所述LY294002的物质的量比为(0.3125-2.5)：1。

8.  根据权利要求5-7中任一所述的产品，其特征在于：所述共同底物为eIF4B；所述肿瘤细胞为白血病细胞；所述白血病细胞具体为NS2细胞或K562细胞。

9.  权利要求1-4中任一所述的应用或权利要求5-8中任一所述的产品，其特征在于：所述产品为药物。

一种具有协同抑制病毒诱导细胞转化与白血病的药物组合及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有协同抑制病毒诱导细胞转化与白血病的药物组合及其应用，属于生物医药领域。
背景技术
癌症的发生常常伴随着机体细胞内信号通路的异常活化，不同类型的肿瘤发生改变的信号通路也不尽相同。针对发生异常的通路，有选择性的使用相应的分子抑制剂能够有效的达到特异性治疗的目的。比如临床上用于治疗乳腺癌的药物—Herceptin(赫赛汀)，可以有针对性并且有效地治疗Her2蛋白过表达导致的乳腺癌。然而绝大部分类型的肿瘤往往有多条具有相似功能的信号通路发生异常，这种功能冗余使得单独抑制一条通路无法达到有效治疗癌症的目的。
v-Abl基因是鼠白血病病毒携带一类癌基因，其编码的v-Abl癌蛋白能够诱导小鼠淋巴细胞发生恶性转化，进而发展为小鼠白血病。而人类中存在一种与v-Abl极为类似的Bcr-Abl基因，该基因能够诱使人发生慢性髓性白血病。无论是v-Abl蛋白还是Bcr-Abl蛋白，在诱导淋巴细胞恶性转化的过程中都会导致JAK/STAT/Pim以及PI3K/AKT/mTOR通路的活化。目前抑制Pim通路的分子抑制剂是SMI-4a，抑制PI3K/AKT/mTOR通路的分子抑制剂有针对mTOR的Rapamyicn(雷帕霉素)，以及针对PI3K的LY294002。
SMI-4a是一种ATP竞争性抑制剂，主要针对的靶分子是Pim分子家族中的Pim1及Pim2激酶，对其它丝/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶没有明显的抑制效果。在体外细胞水平上的研究表明，SMI-4a能够抑制膀胱癌细胞和白血病细胞的增殖，同时也能阻滞细胞周期，促进细胞启动凋亡程序。在分子水平上SMI-4a通过抑制Pim激酶的活性来降低Pim下游底物(如4EBP1，Bad等)的磷酸化水平。在体外活体动物水平上的实验显示，裸鼠口服SMI-4a能够显著抑制肿瘤细胞的成瘤能力，并且对药物无不良反应。小鼠口服药物1小时后取肿瘤进行生化分析发现，Pim激酶下游分子的磷酸化水平明显下调，证明该药物在小鼠体内能够有效抑制Pim激酶的活性。然而在很多类型的肿瘤中，SMI-4a的使用并不能达到理想的治疗效果。
Rapamycin的作用靶点为mTOR分子，通过抑制该分子的下游信号传递，Rapamycin目前发现能够用于治疗癌症、糖尿病、肥胖症、神经系统疾病如阿兹海默症等多种人类重大疾病。FDA于1999年批准该药上市，可作为抗肿瘤药物使用。在小鼠体内实验表明，Rapamycin治疗能够有效抑制小鼠移植瘤的生长，促进肿瘤坏死。LY294002是第一个人工合成的PI3K的抑制剂，被广泛用于PI3K/AKT/mTOR通路的特性研究中。通过抑制PI3K的活性进而诱导AKT失活，LY294002能够抑制多种肿 瘤细胞系的增殖并且诱导细胞凋亡(如结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤等)。体内研究也表明，LY294002也能够抑制肿瘤的生长，作用于鼠癌性腹膜炎模型具有明显药效。LY294002的使用能明显抑制卵巢癌生长和腹水形成。但是在某些类型的肿瘤模型上(如v-Abl癌蛋白或Bcr-Abl蛋白诱导淋巴细胞发生的恶性转化模型)，无论是LY294002还是Rapamycin，其治疗效果都大打折扣。这与肿瘤细胞的异质性以及细胞内存在功能类似的其它活化信号通路有关。
发明内容
本发明的一个目的是提供JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂的用途。
本发明提供了JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂在制备具有如下(1)-(4)中至少一种功能的产品中的应用：
(1)预防和/或治疗慢性髓性白血病；
(2)抑制JAK/STAT/Pim信号通路和PI3K/AKT/mTOR信号通路下游的共同底物磷酸化；
(3)促进肿瘤细胞凋亡；
(4)抑制肿瘤细胞成瘤能力。
上述应用中，所述JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和所述PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂的物质的量比为(0.3125-10)：1。
上述应用中，所述JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂为SMI-4a；所述PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂为Rapamyicn或LY294002；
所述SMI-4a和所述Rapamyicn的物质的量比为(0.625-10)：1；
所述SMI-4a和所述LY294002的物质的量比为(0.3125-2.5)：1。
上述应用中，所述共同底物为eIF4B；所述肿瘤细胞为白血病细胞；所述白血病细胞具体为NS2细胞或K562细胞。
本发明的另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂；所述产品的用途为如下(1)-(4)中的至少一种：
(1)预防和/或治疗慢性髓性白血病；
(2)抑制JAK/STAT/Pim信号通路和PI3K/AKT/mTOR信号通路下游的共同底物磷酸化水平；
(3)促进肿瘤细胞凋亡；
(4)抑制肿瘤细胞成瘤能力。
上述产品中，所述JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂和所述PI3K/AKT/mTOR信号 通路抑制剂的物质的量比为(0.3125-10)：1。
上述产品中，所述JAK/STAT/Pim信号通路抑制剂为SMI-4a；所述PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂Rapamyicn或LY294002；
所述SMI-4a和所述Rapamyicn的物质的量比为(0.625-10)：1；
所述SMI-4a和所述LY294002的物质的量比为(0.3125-2.5)：1。
上述产品中，所述共同底物为eIF4B；所述肿瘤细胞为白血病细胞；所述白血病细胞具体为NS2细胞或K562细胞。
上述应用或上述产品中，所述产品为药物。
本发明提供了一种能够明显协同抑制v-Abl癌蛋白诱导小鼠淋巴细胞恶性转化以及Bcr-Abl癌蛋白诱导人慢性髓性白血病的药物组合。通过实验证明：该药物组合的应用能够有效的在细胞水平上协同诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时在小鼠活体实验上能够更显著的抑制肿瘤生长，为慢性髓性白血病的治疗提供了新的思路。
附图说明
图1为SMI-4a与Rapamycin处理K562细胞后eIF4B磷酸化水平变化情况。图中4h和8h指药物处理K562细胞的时间。
图2为SMI-4a与Rapamycin不同浓度组合处理NS2细胞后的细胞凋亡检测结果。
图3为SMI-4a与Rapamycin不同浓度组合处理K562细胞后的细胞凋亡检测结果。
图4为SMI-4a与LY294002不同浓度组合处理K562细胞后的细胞凋亡检测结果。
图5为compusyn软件分析SMI-4a与Rapamycin对K562细胞的协同作用。
图6为采用SMI-4a与Rapamycin处理裸鼠后K562细胞的肿瘤生长曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
SMI-4a是Merck公司的产品，产品目录号为526523；
Rapamycin是Santa Cruz Biotechnology公司的产品，产品目录号为sc-3504。
DMSO是AMRESCO公司的产品，产品目录号为0231-500ML。
RPMI Medium 1640粉末培养基是life technologies公司的产品，产品目录号为31800-022。
Millex过滤器是Millpore公司的产品，产品目录号为SLGP033RB。
PBS缓冲液的制备方法：将7.9g NaCl、0.2g KCl、0.24gKH₂PO₄和1.8g K₂HPO₄溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。
实施例1、药物组合在同时抑制JAK/STAT/Pim以及PI3K/AKT/mTOR信号通路中 共同底物磷酸化中的应用。
一、试验材料及方法
JAK/STAT/Pim信号通路以及PI3K/AKT/mTOR信号通路存在共同的下游底物eIF4B，eIF4B的活性与Abl癌蛋白诱导细胞恶性转化密切相关。单独抑制一条通路无法有效的下调eIF4B的磷酸化水平，因此无法对肿瘤细胞的存活造成有效的干预。
本发明设置如下组：
对照组：在含有DMSO(稀释浓度为1︰2000)的细胞培养基中培养肿瘤细胞K562(购自美国ATCC细胞库)；
单独药物组(SMI-4a)：在含有浓度为12.5μM SMI-4a(溶剂为DMSO)细胞培养基中培养肿瘤细胞K562；
单独药物组(Rapamycin)：在含有浓度为5μM Rapamycin(溶剂为DMSO)的细胞培养基中培养肿瘤细胞K562；
两种药物联用组(12.5μM SMI-4a与5μM Rapamycin)：在含有浓度为12.5μM SMI-4a和浓度为5μM Rapamycin的细胞培养基中培养肿瘤细胞K562；
上述含有各物质的细胞培养基，为将各物质与细胞培养基混匀，得到的培养基，使各物质达到需要的浓度。
上述细胞培养基的制备方法：用去离子水溶解RPMI Medium 1640粉末培养基，每升加入2g碳酸氢钠，并使用盐酸调整pH值至7.2～7.3，用0.22μm孔径的Millex过滤器过滤，得到细胞培养基。
培养4h和8h后通过Western blot检测肿瘤细胞中eIF4B(Gene ID：1975)的磷酸化水平，检测具体步骤如下：
1、从恒温CO₂培养箱中取出K562细胞，直接在培养皿中用培养基收集全部细胞，1000rpm，离心5min，弃上清，收集沉淀；用PBS缓冲液洗涤沉淀2次后，转移细胞于1.5ml离心管中，3000rpm，4℃，离心3min，弃PBS上清，获得细胞。
2、根据细胞的数量，向步骤1中获得的细胞中加入一定体积的细胞裂解液(并加入蛋白酶抑制剂PMSF，终浓度为2mM)，吹打混匀后置于冰上静置裂解30min(每隔10min涡旋振荡10s)。
3、裂解结束后，12000rpm，4℃，离心10min，弃沉淀，取上清；将上清移入新的离心管内。根据收集的上清量加入相应的上样缓冲液，100℃水浴5min后，得到蛋白样品。
4、步骤3获得的蛋白样品经过SDS-PAGE凝胶电泳、恒流转膜、5％BSA封闭、依次孵育eIF4B磷酸化抗体及相应二抗后，最后化学发光检测eIF4B蛋白的磷酸化水平，使用X光胶片保存实验结果。其中，eIF4B磷酸化抗体为兔源单克隆抗体(购买 公司Santa Cruz Biotechnology，产品编号sc-293101)，二抗为羊抗兔IgG，HRP标记(购买公司Jackson，产品目录号111-035-045)。
5、将NC膜进行striping处理，再次封闭，依次孵育eIF4B蛋白总量抗体及相应二抗。eIF4B总量抗体为人eIF4B单克隆抗体(鼠源，购买公司Santa Cruz Biotechnology，产品编号sc-376062)，二抗为羊抗鼠IgG，HRP标记(购买公司ABGENT，产品目录号LP1002a)。实验以β-actin为内参，一抗为β-actin抗体(鼠源，Sigma公司，Cat.NO.A2066)，二抗为羊抗鼠IgG，HRP标记(购买公司ABGENT，产品目录号LP1002a)。实验重复三次。
二、试验结果
Western blot结果如图1所示：在eIF4B总量比较一致的情况下，两种药物联用组(12.5μM SMI-4a与5μM Rapamycin)比单独药物组能够更明显的抑制eIF4B的磷酸化水平。说明同时抑制JAK/STAT/Pim信号通路以及PI3K/AKT/mTOR信号通路能够更有效的抑制这两条通路下游的共同底物eIF4B的磷酸化。
实施例2、药物组合在协同诱导恶性转化细胞发生凋亡中的应用
一、试验材料及方法
1、离心收集NS2或K562细胞(NS2细胞为本实验室用小鼠白血病病毒转化的小鼠白血病细胞系)，PBS液洗涤一次，用RPMI 1640培养基悬浮细胞，分装到12孔板；添加不同浓度的药物组合，轻轻混匀后置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。
2、SMI-4a与Rapamycin联用处理NS2细胞24h，SMI-4a与Rapamycin联用处理K562细胞36h，SMI-4a与LY294002联用处理K562细胞48h，药物组合中各药物的浓度具体如图2、图3和图4所示；
上述处理为将NS2细胞或K562细胞在含有不同浓度的SMI-4a与不同浓度的Rapamycin的细胞培养基或在含有不同浓度的SMI-4a与不同浓度的LY294002的细胞培养基中培养。以将NS2细胞或K562细胞在含有DMSO(稀释浓度为1︰2000)的细胞培养基中培养作为对照。
3、分别收集药物处理后的细胞至1.5ml离心管，PBS液洗涤一次，弃上清，收集沉淀；用500μl binding buffer重悬沉淀并转移至流式管。
4、再向流式管的沉淀中分别加入5μl Annexin-V-FITC及Propidium Iodide(两者皆为凋亡染料)，混匀后，室温避光染色5-15min，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。
二、试验结果
流式细胞仪分析得到的细胞存活结果如图2、图3和图4所示：使用单独药物处理后细胞凋亡的比例很小，但12.5μM的SMI-4a与10μM的Rapamycin联用处理NS2 细胞24h能够诱导99％的细胞发生凋亡，12.5μM的SMI-4a与20μM的LY294002联合使用48h能够诱导64％的K562细胞发生凋亡，而25μM的SMI-4a与10μM的Rapamycin联用36h能够诱导89％的K562细胞发生凋亡。说明SMI-4a与Rapamycin/LY294002联用能够极为显著的促进NS2及K562细胞发生凋亡。
使用药物协同分析软件compusyn对SMI-4a与Rapamycin组合处理K562细胞36h后细胞凋亡情况的分析结果如图5所示：图5中每个点代表一个药物浓度组合，横轴代表药物诱导凋亡的效果，越大代表凋亡越显著，纵轴代表药物组合协同指数，小于1代表具有协同效果，越小协同效果越显著，等于1代表叠加效果，即两种药物联用只起到1+1＝2的效果，大于1则代表药物组合具有拮抗效果。以上结果表明：同时抑制这两条通路能够达到极为显著的协同效果。
实施例3、药物组合在抑制肿瘤细胞成瘤能力中的应用
一、试验材料及方法
SPF级裸鼠(Balb/C)(是维通利华公司的产品)，雌性，5周龄，20只，体重为14-16g。
1、将K562细胞用PBS收集、洗涤、混匀，通过细胞计数取1×10⁸个细胞平均分到20个1.5ml离心管中，即5×10⁶/管。
2、离心后取上清，用预冷的170μl的PBS重悬(总体积200μl左右)。
3、分别给20只小鼠经右侧背部皮下注射5×10⁶个K562细胞。每隔2天，观察裸鼠肿瘤的生长情况，使用游标卡尺测量瘤块的长、宽，体积计算公式为长×宽×宽/2。第10天左右瘤块体积约为150mm³左右。
4、将小鼠随机分为4组，5只/组，分别如下，第11天开始给药：
对照组：各给药组采用相应药物溶剂进行同样方式给药。
SMI-4a组：采用口服给药方式，给药浓度为30mg/kg(小鼠体重)SMI-4a，给药使用的溶剂配方为65％的5％葡萄糖水溶液、30％丙二醇和5％吐温80混匀的混合液；
Rapamycin组：采用腹腔注射，给药浓度为4mg/kg(小鼠体重)Rapamycin，给药使用的溶剂配方为溶剂为2％乙醇、5.2％丙二醇、5.2％吐温80和无菌水混匀的混合液；
SMI-4a+Rapamycin组：SMI-4a给药浓度为30mg/kg SMI-4a(口服给药)，且Rapamycin给药浓度为4mg/kg Rapamycin(腹腔注射)。药物联用组的剂量同单独使用组的剂量。
药物联用组同时给予两种药物治疗。两天给药一次，并测量记录肿瘤大小。接种肿瘤后第29天停止给药，处死裸鼠，测量肿瘤大小。
二、试验结果
结果如图6所示：SMI-4a单独处理小鼠能够在一定程度上抑制肿瘤的生长，Rapamycin单独处理可以比较明显的对K562细胞的成瘤能力进行干预，而使用两种药物治疗时，小鼠荷瘤受到极为显著的抑制，体积明显小于其余处理组。
以上动物实验表明：药物组合(SMI-4a+Rapamycin组)能够同时抑制JAK/STAT/Pim信号通路以及PI3K/AKT/mTOR信号通路，明显干预K562细胞诱导的裸鼠体内肿瘤形成过程，为慢性髓性白血病的治疗提供了新的思路。