一株在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌.pdf

本发明涉及一株在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌。所述内生真菌为青霉属（Penicillium sp.）SJ3，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 10468。将千年桐内生真菌SJ3接种于千年桐土培苗，通过对植株生物量、叶片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性的测定，得出接种该菌株的处理的生物量、叶片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性均基本较大程度高于对照，表明其在低磷环境下对促进植株生物量增长具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能在低磷环境下促进千年桐植株生物量生长。

1.  一株在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌，其特征在于：该真菌为青霉属（Penicillium sp.）SJ3，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 10468。

2.  一种如权利要求1所述的一株在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌的应用菌液，其特征在于：所述应用菌液的制备方法，将所述的青霉属（Penicillium sp.）SJ3菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×10⁶cfu/ml，备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

3.  一种如权利要求2所述的应用菌液的用途，其特征在于：所述应用菌液用于千年桐苗木根际土壤浇施或苗木直接接种。

一株在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌
技术领域  
本发明涉及一株在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌。
背景技术  
植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。
植物内生真菌的分布广、种类多，前人研究表明从绝大多数植物体内都能分离得到内生真菌，由此可见内生真菌普遍存在于植物体内。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。
目前，有关内生真菌对千年桐生长的影响研究还存在空白。
发明内容  
本发明的目的在于提供一株在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌。
该真菌为青霉属（Penicillium sp.）SJ3，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 10468。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
该菌的分离、纯化包括：
A、材料：将采集得到不同年份的根、枝茎、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；  
B、消毒：75%酒精漂洗30s→无菌水冲洗3-4次→15%的次氯酸钠漂洗（根7min，茎5min，叶3min）→无菌水冲洗4-5次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法；
C、接种部位的选择：叶片：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝茎：上中下分为3部位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分；  
D 、接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养5—7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化；
固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养；
E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Penicillium功能菌株；
上述的一种在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×10⁶cfu/ml即为成品备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。
上述的一种在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液用于千年桐苗木根际土壤浇施或苗木直接接种。
上述的一种在低磷环境下促进千年桐生物量增长的内生真菌应用菌液的应用方法，是用5.5×10⁶cfu/ml菌液，按每株100ml在林地浇于每株千年桐的根际。
本发明涉及的菌株是从千年桐植株中分离纯化得到的，经接种于千年桐土培苗，根据各项指标综合评判，进一步证实其在低磷环境下能促进千年桐生物量的增长，寻找到对促进植株生物量增长的有益的功能内生真菌可应用于生产。
通过菌液浇施的方法接种于千年桐幼苗，并在接种15天后进行低磷胁迫试验，在胁迫15d时、30d时、45d时、60d时进行取样测定植株叶片酸性磷酸酶活性，并在胁迫至60d时测定其生物量及根系酸性磷酸酶活性。根据测得的各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有缓解低磷胁迫的作用，寻找到对促进植株生物量有益的功能内生真菌可应用于生产。通过对植株生物量、叶片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性的测定，得出接种该菌株的处理的生物量、叶片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性均基本较大程度高于对照，表明其在低磷环境下对促进植株生物量增长具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能在低磷环境下促进千年桐植株生物量生长。
附图说明
图1为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗生物量的影响。
图2为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗叶片酸性磷酸酶活性的影响。
图3为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗根系酸性磷酸酶活性的影响。
具体实施方式
一、根际土壤浇施与苗木直接接种应用
试验材料为千年桐幼苗为建阳市林业局提供的千年桐一年生苗。本试验采用土培盆栽试验，选择长势一致的苗木于2015年5月定植于直径15cm，高10cm的塑料盆中。每盆放入相等质量的3kg黄心土，为了保证后期苗木接菌的准确性，往每盆土壤中滴入10-15滴甲醛(福尔马林)消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24h。待土壤内甲醛渗透消毒完全，除去塑料薄膜，将剩余的甲醛蒸发，以免影响幼苗的移植成活率。将苗木植入，经过一个月的恢复性生长，在千年桐幼苗根际施入菌株浓度为5.5×10⁶cfu/ml的菌液100ml，连续三天浇施，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。
菌液制备：将供试菌株接入50mL的液体培养基，培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2，在恒温振荡培养箱中经过72h的培养。用无菌生理盐水按十倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度配制成5.5×10⁶cfu/mL。
二、低磷胁迫试验设计
盆栽试验土壤的基质为黄心土。经测定该土壤中各养分物质见表1。接种15天后进行低磷胁迫试验处理，这段时间主要是让接种菌株侵入植株。
表1 基质土壤养分情况
Table 1 Nutrient content of basic soil
单位：mg/g\

本试验设计了4个磷处理水平，每个水平3个重复（表2）。磷肥采用KH₂PO₄，定期施氮肥、钾肥及其他微量元素，直至收获。低磷胁迫于2014年7月21日、7月28日和8月4日分三次进行。根据天气状况及时为千年桐苗补充水分。
表2 低磷胁迫试验设计
Table 2 The experimental design of low phosphorus stress
单位：mg/kg

在胁迫15d时、30d时、45d时、60d时进行取样测定，检测方法如下：
（1）生物量的测定
将植株的不同部位分别放入信封中并标上记号，放入烘箱105℃烘干半小时（钝化酶），在60℃下烘干，经过12h后，称重后再放入烘箱中，重复测定直至恒重为止。称得样品的重量（W），即为样品干重，以此表示植株的生物量，精确到0.01g。
（2）酸性磷酸酶活性测定
叶片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性的测定均采用购自南京建成生物工程研究所的酸性磷酸酶（ACP）测剂盒（货号：A060-1 50T/48样）进行测定。
操作步骤：
1）样本前处理:准确称取组织重量，按重量(g):体积(ml)=1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，制成10%组织匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液待测。（取部分上清液测蛋白浓度，蛋白浓度测定采用购自南京建成生物工程研究所的考马斯亮蓝法蛋白测定试剂盒进行测定）
2）操作表：

混匀，室温放置10分钟，520nm，准确吸取0.25m1各管反应液加入到新的96孔板中，空白管调零，酶标仪测定各孔吸光度（OD值）。
3）计算公式：

注：其中所需的蛋白浓度采用购自南京建成生物研究所的蛋白测定试剂盒（货号：A045-2 考马斯亮蓝法）进行测定。操作步骤如下：
1）取部分酸性磷酸酶制备的匀浆上清液按照下述操作表进行操作。
2）操作表：

混匀，静置10分钟，520nm，准确吸取0.25m1各管反应液加入到新的96孔板中，空白管调零，酶标仪测定各孔吸光度（OD值）。
3）计算公式：

（3）数据处理
数据整理与作图采用Excel2003，数据的统计学分析采用SPSS16.0与DPS7.05。
三、结果与分析
不同低磷胁迫下不同处理对千年桐生物量的影响
生物量是反映苗木生产力水平的重要指标，它与苗木的生长发育存在着非常密切的关系。四个不同低磷胁迫条件分别为：正常条件、轻度胁迫、中度胁迫、重度胁迫。如图1所示，在四个不同低磷胁迫程度下，接种菌株SJ3的幼苗的生物量分别比对照大26.06%、20.10%、11.23%、24.47%，由此可得，菌株SJ3有利于促进植株生物量的生长。
不同低磷胁迫条件下不同菌种对千年桐幼苗酸性磷酸酶活性的影响
酸性磷酸酶（Acid Phosphatase Activity，以下简称APA）是一种普遍存在于植物体和土壤中十分重要的水解酶，其活性高低能够反映植物体和土壤中的磷含量的状况。在低磷胁迫条件下，植物可以通过调整和改善自身的生理特性增加磷的吸收来适应恶劣的环境，如植物体内能够分泌酸性磷酸酶促进难溶性无机磷和有机磷的溶解。
（1）不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗叶酸性磷酸酶活性的影响
由图2可知，在四个不同低磷胁迫条件下，从整个胁迫过程看，处理SJ3的叶片酸性磷酸酶活性基本都大于对照。在正常条件下，处理SJ3的叶片酸性磷酸酶活性在胁迫至30d、60d时分别比对照组高30.11%、8.90%；在轻度胁迫下，处理SJ3的叶片酸性磷酸酶活性在胁迫至15d、30d、45d、60d时分别比对照组高249.06%、274.84%、443.36%、108.96%；在中度胁迫下，处理SJ3的叶片酸性磷酸酶活性在胁迫至30d、45d时分别比对照组高59.21%、152.91%；在重度胁迫下，处理SJ3的叶片酸性磷酸酶活性在胁迫至15d、30d、45d、60d时分别比对照组高217.86%、132.86%、42.27%、121.94%。由此可见，在不同胁迫条件下，菌株SJ3对千年桐幼苗的叶片酸性磷酸酶活性有促进作用。
（2）不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗根系酸性磷酸酶活性的影响
由图3可知，在四个不同低磷胁迫条件下，接种菌株SJ3的幼苗根系的生物量分别比对照大169.58%、6.40%、117.77%、120.41%，由此可得，菌株SJ3有利于激发千年桐幼苗根系酸性磷酸酶活性。
本发明发现一株能促进千年桐缓解低磷胁迫促进植株生物量增长的内生真菌，将该株千年桐内生真菌菌株采用浇根的方法接种于千年桐幼苗。通过对植株生物量、叶片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性的测定，得出接种该菌株的处理的生物量、叶片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性均基本较大程度高于对照，表明其对于缓解低磷胁迫促进植株生物量增长具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进千年桐缓解低磷胁迫促进植株生物量生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。