一种疫苗制剂及其制备方法和用途.pdf

本发明提供了一种疫苗制剂及其制备方法和用途，所述疫苗制剂包含疫苗载体和抗原组分，其中所述疫苗载体为由微生物经水热转化获得的疫苗载体。本发明所述疫苗制剂是将微生物经水热转化获得的疫苗载体与抗原组分复配获得所述疫苗制剂。本发明通过水热反应制备的疫苗载体材料，其孔性、亲疏水性和表面免疫相关配体密度等性质得到优化，从而使得其与抗原组分复配时，抗原装载效率提高，使得疫苗制剂具有强烈的免疫激活效果，高效地增强负载抗原的免疫原性，通过机体对抗原形成的特异性免疫应答，实现针对特定疾病的免疫治疗及预防。此外，本发明疫苗制剂的原料来源广泛，在疫苗构建上具有普适性，可以构建针对不同疾病的多种疫苗制剂。

1.  一种疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂包含疫苗载体和抗原组分，其中所述疫苗载体为由微生物经水热转化获得的疫苗载体。

2.  根据权利要求1所述的疫苗制剂，其特征在于，所述微生物为病原性或非病原性微生物；
优选地，所述微生物为细菌、真菌或病毒中的任意一种；
优选地，所述微生物为干酪乳杆菌、双歧杆菌、分枝杆菌、葡萄球菌、乳酸球菌、副溶血性弧菌、酵母菌或腺病毒中的任意一种。

3.  根据权利要求1或2所述的疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗载体保留微生物模板的外形特征；
优选地，所述疫苗载体表面保留微生物模板的免疫相关的表面配体；
优选地，所述表面配体为膜多糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺、海藻糖或脂蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

4.  根据权利要求1-3中任一项所述的疫苗制剂，其特征在于，所述抗原组分为抗原蛋白、表位肽、抗原编码质粒DNA或mRNA中的任意一种或至少两种的组合。

5.  根据权利要求1-4中任一项所述的疫苗制剂的制备方法，其特征在于，所述方法是将微生物经水热转化获得的疫苗载体与抗原组分复配，获得所述疫苗制剂。

6.  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)微生物悬浮液经水热反应，洗涤，干燥得到疫苗载体；
(b)将步骤(a)得到的疫苗载体与抗原组分复配，获得所述疫苗制剂。

7.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述水热反应所使用的溶媒为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、氯化钠、氯化钾、醋酸钾、乙醇、 乙醛或戊二醛中的任意一种或至少两种的水溶液；
优选地，所述水溶液的浓度为0.001～1.000mol/L；
优选地，步骤(a)所述微生物悬浮液为将微生物投入所述溶媒中制成的悬浮液。

8.  根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述水热反应的步骤是将微生物悬浮液转移到水热反应釜中，并将水热反应釜置于恒温箱，恒温加热；
优选地，步骤(a)所述水热反应温度为100～400℃，优选为120～240℃；
优选地，步骤(a)所述水热反应压力为1～3MPa；
优选地，步骤(a)所述水热反应时间为0.5～72小时，优选为2～12小时，进一步优选为8～12小时；
优选地，步骤(a)所述洗涤为用纯水洗涤，所述干燥为冷冻干燥。

9.  根据权利要求6-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)还包括将所述疫苗制剂与免疫调节剂复配；
优选地，所述免疫调节剂为生物源性免疫调节剂或非生物源性免疫调节剂；
优选地，所述免疫调节剂为非甲基化胞苷酸鸟苷酸基序、单磷酰脂质A、白细胞介素2或白细胞介素12中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(b)所述复配为通过吸附、封装或者共混的方式进行复配。

10.  根据权利要求1-4中任一项所述的疫苗制剂在制备用于防治恶性肿瘤或感染类疾病药物中的用途；
优选地，所述感染类疾病为乙型肝炎、流行性感冒、细菌性肺炎或细菌性痢疾中的任意一种。

一种疫苗制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于疫苗制剂领域，具体涉及一种疫苗制剂及其制备方法和用途。
背景技术
在疫苗的发展历史当中，最初出现的疫苗利用减毒或者灭活的病原生物如细菌、病毒、立克次氏体等制成。通过这种方式获得的疫苗制剂在临床应用中存在着潜在的生物安全性问题，如引起严重的炎症反应和致病性病毒感染等。现代疫苗制剂则通常用提纯或重组的亚单位抗原来取代完整的病原生物，由于杜绝了病原体致病性复发的可能，大大提高了疫苗使用的生物安全性。然而相比于完整的病原微生物，蛋白或者多肽形式的亚单位抗原易遭受降解，同时难以被抗原提呈细胞(Antigen presentating cell，APC)摄取。更为重要的是由于缺乏病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，其接种后缺少“危险信号”，因此不能有效地激活APC。这些问题使得单独使用亚单位抗原时难以获得较强的免疫原性，最终导致了免疫应答效果的不尽理想。
对于获得性免疫机理的研究表明，虽然机体依靠对病原体上抗原部分的特异性识别和记忆获得免疫，但病原体中除抗体以外的其它特征成分在免疫形成中也起到了很大作用。在与病原体的相互作用过程中，病原体独特的形貌、表面生物学性质和向外分泌的各种生物学信号等，能够促使免疫相关细胞趋近、识别和吞噬包括抗原成分在内的病原体组分；同时病原体成分中的PAMP在与免疫相关细胞接触或摄取后，能够有效地激活这些机体细胞，诱导高水平的免疫应答的发生。正是由于病原体具有这样一系列的重要特征，机体免疫系统才能够有效地对其进行识别和应答。
受此启示，一些研究人员开始尝试开发具有仿病原体特征的疫苗制剂并获得了一些初步的成功。以目前最为成功的病毒小体(Virosome)为例，其因对病毒关键生理结构和形态的模仿而得名。Virosome是通过将病毒表面的功能性蛋白嵌入脂质体的双分子层而制得的一类特殊脂质体。包括流感病毒、水疱性口炎病毒和新城疫病毒等病毒的包膜蛋白都已经被成功用于Virosome的制备。利用其脂质层中嵌入的功能性病毒蛋白，Virosome具有如病毒一样的膜融合能力，因此能够模拟病毒感染动物机体的过程。更为重要的是，由于只使用少量低毒性病毒蛋白而不涉及其遗传性物质，Virosome在获得同病毒相似的细胞入侵能力的同时避免了在活体疫苗使用过程中的生物安全性问题。迄今，已有两种基于Virosome的人用疫苗在29个国家上市销售。目前Virosome应用的主要限制在于抗原装载上有较大的局限性，对抗原的分子尺寸、亲疏水性都有比较严格的要求，装载效率也有待提高。
尽管以Virosome为代表的仿生疫苗制剂现在仍处于发展初期，还存在着各种各样的不足，但是其已经取得的成功显示出了通过模仿病原体所构建的疫苗制剂的潜在优势和巨大发展空间。
因此，如果能够开发出一种在APC摄取、抗原提呈和免疫激活等各个环节都具有与病原体相似能力的疫苗制剂，将有望为许多重大疾病的预防和治疗提供有效的解决方案。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种疫苗制剂及其制备方法和用途。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包含疫苗载体和抗原 组分，其中所述疫苗载体为由微生物经水热转化获得的疫苗载体。
本发明应用简单且易于工业放大的水热合成法，通过在密闭空间中对水溶液进行加热，使反应环境达到亚临界或超临界状态，在此情况下，反应处于分子水平，反应效率极高，从而将微生物模板原料转化为疫苗载体。通过水热反应控制所得疫苗载体材料的孔性、亲疏水性和表面免疫相关配体密度等性质，由此可以对后续抗原成分的装载进行有效调控。相比于同样使用病原体微生物为原料的减毒和灭活疫苗，本发明不仅能够完全保证疫苗使用的安全性，同时通过水热过程对微生物表面生物学性质进行调控，还能够进一步提升相关的免疫激活能力。
优选地，所述微生物为病原性或非病原性微生物。
优选地，所述微生物为细菌、真菌或病毒中的任意一种。
优选地，所述微生物在种属上为但不限于干酪乳杆菌、双歧杆菌、分枝杆菌、葡萄球菌、乳酸球菌、副溶血性弧菌、酵母菌或腺病毒中的任意一种。
在本发明所述疫苗制剂中，所述疫苗载体保留微生物模板的外形特征，能够促进抗原提呈细胞对于疫苗载体及所负载抗原等的快速识别和摄取。
优选地，所述疫苗载体表面保留微生物模板的免疫相关的表面配体。
优选地，所述表面配体包括但不限于膜多糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺、海藻糖或脂蛋白中的任意一种或至少两种。
疫苗载体的这种表面特征能够促进免疫细胞活化和调控抗原在细胞内的转运和提呈途径，由此高效增强疫苗应用后的免疫应答水平。
在本发明所述疫苗制剂中，所述抗原组分为抗原蛋白、表位肽、抗原编码质粒DNA或mRNA中的任意一种或至少两种的组合。
例如，应用所述疫苗制剂对特定恶性肿瘤进行免疫预防或者治疗时，该疫 苗制剂中所包含的抗原组分可以是该肿瘤的一种或多种相关或者特异性抗原，也可以是携带这些抗原编码信息的质粒DNA或mRNA；应用所述疫苗制剂对感染类疾病进行免疫预防或者治疗时，该疫苗制剂中所包含的抗原可以是相应病原微生物的一种或多种特异性抗原蛋白，同样也可以是携带这些抗原编码信息的质粒DNA或mRNA。
另一方面，本发明提供了所述疫苗制剂的制备方法，所述方法是将微生物经水热转化获得的疫苗载体与抗原组分复配，获得所述疫苗制剂。
本发明所述疫苗制剂的制备方法包括以下步骤：
(a)微生物悬浮液经水热反应，洗涤，干燥得到疫苗载体；
(b)将步骤(a)得到的疫苗载体与抗原组分复配，获得所述疫苗制剂。
在本发明的疫苗制剂的制备方法中，步骤(a)所述水热反应所使用的溶媒为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、氯化钠、氯化钾、醋酸钾、乙醇、乙醛或戊二醛中任意一种或至少两种的水溶液。
优选地，所述水溶液的浓度为0.001～1.000mol/L，例如0.001mol/L、0.002mol/L、0.004mol/L、0.008mol/L、0.010mol/L、0.015mol/L、0.018mol/L、0.020mol/L、0.024mol/L、mol/L、0.028mol/L、0.030mol/L、0.040mol/L、0.060mol/L、0.080mol/L、0.100mol/L、0.150mol/L、0.200mol/L、0.250mol/L、0.300mol/L、0.350mol/L、0.40mol/L、0.450mol/L、0.500mol/L、0.550mol/L、0.600mol/L、0.700mol/L、0.800mol/L、0.900mol/L或1.000mol/L。
优选地，步骤(a)所述微生物悬浮液为将微生物投入所述溶媒中制成的悬浮液。
在本发明的疫苗制剂的制备方法中，步骤(a)所述水热反应的步骤是将步骤(a)得到的悬浮液转移到水热反应釜中，并将水热反应釜置于恒温箱，恒温 加热。
优选地，步骤(a)所述水热反应温度为100～400℃，例如100℃、110℃、120℃、140℃、160℃、180℃、200℃、220℃、240℃、260℃、280℃、300℃、320℃、340℃、360℃、380℃、390℃或400℃，优选为120～240℃。
优选地，步骤(a)所述水热反应压力为1～3MPa，例如1MPa、1.1MPa、1.2MPa、1.3MPa、1.4MPa、1.5MPa、1.6MPa、1.7MPa、1.8MPa、1.9MPa、2MPa、2.1MPa、2.2MPa、2.3MPa、2.4MPa、2.5MPa、2.6MPa、2.7MPa、2.8MPa、2.9MPa或3MPa。
优选地，步骤(a)所述水热反应时间为0.5～72小时，例如0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、23小时、25小时、28小时、30小时、33小时、36小时、40小时、45小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时、71小时或72小时，优选为2～12小时，进一步优选为8～12小时。
优选地，步骤(a)所述洗涤为用纯水洗涤，所述干燥为冷冻干燥。
在本发明的疫苗制剂的制备方法中，步骤(b)还包括将所述疫苗制剂与免疫调节剂复配。
优选地，所述免疫调节剂为生物源性免疫调节剂或非生物源性免疫调节剂。
优选地，所述免疫调节剂为非甲基化胞苷酸鸟苷酸基序(CpG)、单磷酰脂质A(MPLA)、白细胞介素2(IL-2)或白细胞介素12(IL-12)中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(b)所述复配为通过吸附、封装或者共混的方式进行复配。
作为优选技术方案，本发明的疫苗制剂的制备方法具体包括以下步骤：
(a)微生物悬浮液转移到水热反应釜，在温度120～240℃，压力1～3MPa下进行水热反应2～12小时，纯水洗涤，冷冻干燥后得到疫苗载体；
(b)将步骤(a)得到的疫苗载体与抗原组分以及免疫调节剂复配，获得所述疫苗制剂。
本发明用于制备疫苗载体的微生物具有广泛适用性，涵盖细菌、真菌和病毒等各类微生物；疫苗载体可以复配的抗原和免疫调剂的种类也有很大的选择性；采用本发明的技术方案通过选用不同的抗原，可以实现针对不同疾病的疫苗构建，因此本发明的技术方案在疫苗构建上具有普适性。
另一方面，本发明提供了所述疫苗制剂在制备用于防治恶性肿瘤或感染类疾病药物中的用途。
优选地，所述感染类疾病为乙型肝炎、流行性感冒、细菌性肺炎或细菌性痢疾中的任意一种。
本发明提供的疫苗制剂通过对病原体的特征形态、表面配体和分子信号的仿生，实现强烈的免疫激活效果，高效地增强所负载抗原的免疫原性。通过机体对抗原形成的特异性免疫应答，可以实现针对特定疾病的免疫治疗及预防。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过将微生物模板原料经水热反应制得的疫苗载体，与抗原组分以及任选地免疫调节剂复配得到疫苗制剂，使得疫苗载体材料的孔性、亲疏水性和表面免疫相关配体密度等性质得到优化，从而使得其与抗原组分以及任选的免疫调节剂复配时，抗原装载效率提高，使制备得到的疫苗制剂实现了强烈的免疫激活效果，高效地增强所负载抗原的免疫原性，通过机体对抗原形成的特异性免疫应答，实现针对特定疾病的免疫治疗及预防。此外，本发明的原料来源广泛，在疫苗构建上具有普适性，可以构建针对不同疾病的多种疫苗制剂。
附图说明
图1是实施例1制备的疫苗载体的扫描电镜(A)和透射电镜(B)图；
图2是实施例2制备的疫苗载体的扫描电镜图；
图3是实施例4制备的疫苗载体的扫描电镜图；
图4是实施例6制备的疫苗载体的扫描电镜图；
图5是实施例7制备的疫苗载体的扫描电镜图；
图6是实施例9中不同水热制备时间下制备的疫苗载体对甘露糖受体结合能力的比较图；
图7是实施例15中树突状细胞的各种表面信号的表达水平(A-E)及细胞因子分泌水平(F-J)图；
图8是实施例17中各组小鼠脾细胞中IFN-γ⁺CD8T细胞的百分比图；
图9是实施例17中各组小鼠中淋巴瘤细胞的裂解率图；
图10是实施例18中各组小鼠的肿瘤生长曲线(A)及生存期(B)图；
图11是实施例19中各组小鼠的肿瘤生长曲线(A)及生存期(B)图；
图12是实施例22中各组小鼠在第14、21、28和35天的OVA特异性IgG的滴度水平图；
图13是实施例24中各组疫苗对恶性肿瘤的免疫防治效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗载体，具体步骤如下：
将人工培养的干酪乳杆菌菌泥5g，分散于100mL 0.01mol/L盐酸溶液中制得微生物悬浮液，将其转移到置于恒温箱内的水热反应釜中，保持压力为3MPa，180℃下恒温加热10小时，将得到的沉淀物用纯水洗涤后冷冻干燥，得到疫苗载体(DB)。
利用扫描电镜(JEOL，JSM-6700F)和透射电镜(JEOL，JEM-1400)对制备得到的疫苗载体进行表征，如图1所示，所制备的疫苗载体保留了杆菌的形貌特征。另外，借助酸性溶剂环境下发生的剧烈水解反应，在载体表面形成了平均孔径27.66nm的多孔微观结构。
实施例2
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗载体，具体步骤如下：
将人工培养的干酪乳杆菌菌泥2g，分散于100mL 0.1mol/L盐酸溶液中制得微生物悬浮液，将其转移到置于恒温箱内的水热反应釜中，保持压力为2MPa，200℃下恒温加热12小时，将得到的沉淀物用纯水洗涤后冷冻干燥，得到疫苗载体。
利用扫描电镜对制备得到的疫苗载体进行表征，如图2所示，由于酸性溶剂环境下进行的水热反应，使载体材料表面形成了大量的大孔结构。
实施例3
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗载体，具体步骤如下：
将人工培养的干酪乳杆菌菌泥5g，分散于100mL 0.01mol/L盐酸溶液中制得微生物悬浮液，将其转移到置于恒温箱内的水热反应釜中，保持压力为3MPa，100℃下恒温加热72小时，将得到的沉淀物用纯水洗涤后冷冻干燥，得到疫苗载体。
实施例4
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗载体，具体步骤如下：
将人工培养的副溶血性弧菌菌泥10g，分散于50mL 1.00％(v/v)戊二醛溶液中，转移到置于恒温箱内的水热反应釜中，保持压力为1MPa，250℃下恒温加热2小时，将得到的沉淀物用纯水洗涤后冷冻干燥，得到疫苗载体。
利用扫描电镜对制备得到的疫苗载体进行表征，如图3所示，由于通过水热反应，载体材料表面形成了大量的大孔结构。
实施例5
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗载体，具体步骤如下：
将人工培养的副溶血性弧菌菌泥10g，分散于50mL 1.00％(v/v)戊二醛溶液中，转移到置于恒温箱内的水热反应釜中，保持压力为1MPa，400℃下恒温加热0.5小时，将得到的沉淀物用纯水洗涤后冷冻干燥，得到疫苗载体。
实施例6
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗载体，具体步骤如下：
人工培养的嗜热链球菌菌泥10g，分散于50mL 0.05g/mL氯化钠溶液中，转移到置于恒温箱内的水热反应釜中，180℃下恒温加热0.5小时，将得到的沉淀物用纯水洗涤后冷冻干燥，得到疫苗载体。
利用扫描电镜对制备得到的疫苗载体进行表征，如图4所示，水热处理制备的疫苗载体保留了嗜热链球菌的球形个体形态，同时还很好地保留了链球形的相互链接的结构特点。
实施例7
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗载体，具体步骤如下：
人工培养的乳酸片球菌菌泥10g，分散于50mL 0.1mol/mL乙醇溶液中，转移到置于恒温箱内的水热反应釜中，150℃下恒温加热72小时，将得到的沉 淀物用纯水洗涤后冷冻干燥，得到疫苗载体。
利用扫描电镜对制备得到的疫苗载体进行表征，如图5所示，水热处理所制备的疫苗载体完整地保留了乳酸片球菌的特征片球外形特点。
实施例8
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗载体，具体步骤如下：
人工培养的酵母菌菌泥10g，分散于50mL 0.001mol/mL氯化钠溶液中，转移到置于恒温箱内的水热反应釜中，300℃下恒温加热24小时，将得到的沉淀物用纯水洗涤后冷冻干燥，得到疫苗载体。
实施例9
在本实施例中，通过以下方法来测试疫苗载体与甘露糖受体的结合，具体步骤如下：
预先用牛血清蛋白封闭液对按照实施例1的方法在不同水热处理时间0h、4h、8h、12h、24h、48h和72h(其他条件和操作步骤均与实施例1相同)制备的疫苗载体(50μg)进行封闭，以避免后续步骤中与甘露糖受体的非特异性作用，随后将封闭的疫苗载体与20μg甘露糖受体共混并在4℃下孵育10h。
利用荧光修饰的抗CD206抗体对疫苗载体结合的甘露糖受体进行标记，并通过流式细胞仪(Becton Dickinson，CyAn^TM ADP)对荧光强度进行定量，测定不同水热处理时间的疫苗载体对于甘露糖受体的相对结合能力，如图6所示。
由图6可知，随着水热反应的持续进行，疫苗载体对甘露糖受体的相对结合量增多，随着水热反应的进行，干酪乳杆菌表面的甘露糖配体逐渐暴露，展现出极好的甘露糖受体结合能力。而当处理时间超过12h后，随着水热时间的延长，干酪乳杆菌表面的甘露糖配体又逐渐遭受破化，导致与甘露糖受体结合能力的持续下降。
实施例10
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗制剂，具体步骤如下：
将实施例1中制备的疫苗载体100μg与1mL含75μg/mL CpG 1862及1mL20μg/mL OVA(模式抗原卵白蛋白)的溶液在4℃下共混2小时，离心回收得到装载CpG和OVA的疫苗制剂。经测定，CpG的装载量为1.7wt％，OVA的装载量为5.3wt％。
实施例11
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗制剂，具体步骤如下：
将实施例1中制备的疫苗载体100μg与1mL含150μg/mL CpG 1862及80μg/mL OVA溶液在4℃下共混2小时，离心回收得到装载CpG和OVA的疫苗制剂。经测定，CpG的装载量约为4wt％，OVA的装载量约为40wt％。
实施例12
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗制剂，具体步骤如下：
将实施例1中制备的疫苗载体100μg与1mL含300μg/mL CpG 1862及200μg/mL OVA的溶液在4℃下共混2小时，离心回收得到装载CpG和OVA的疫苗制剂。经测定，CpG的装载量为8.0wt％，OVA的装载量为85.2wt％。
实施例13
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗制剂，具体步骤如下：
将实施例1中制备的疫苗载体100μg与1mL 120μg/mL CpG 1862在4℃下共混2小时，离心回收得到装载CpG的疫苗载体。随后，将装载CpG的疫苗载体继续与1mL 100μg/mL提取自小鼠乳腺癌4T1细胞株的全细胞抗原于4℃下共混2小时，离心回收后获得针对4T1乳腺癌的疫苗制剂。经测定结，CpG的装载量约为4.0wt％，全细胞抗原的装载量为40wt％。
实施例14
在本实施例中，通过以下方法来制备疫苗制剂，具体步骤如下：
将实施例2制备的疫苗载体100μg与1mL 20μg/mL IL-12在4℃下共混2小时，离心回收得到装载IL-12的疫苗载体。随后，将装载IL-12的疫苗载体继续与1mL 100μg/mL乙型肝炎表面抗原(HBsAg)在4℃下共混2小时，离心回收后制得针对乙型肝炎的疫苗制剂。经测定，IL-2的装载量为3.1wt％，HBsAg的装载量为13.5wt％。
实施例15
在本实施例中，通过以下方法来对疫苗制剂进行体外抗原提呈细胞激活试验，方法如下：
将实施例11制备的疫苗制剂与树突状细胞(主要的专职抗原提呈细胞)孵育24小时(其中OVA浓度为1μg/mL)。检测疫苗制剂(DB:CpG/OVA)对树突状细胞的激活效果，设PBS组、OVA组、CpG空白组(DB:OVA)、疫苗载体空白组(CpG+OVA)及100ng/mL脂多糖组(LPS+OVA)作为对照组，所有组的OVA浓度均为1μg/mL。检测指标包括表达于树突状细胞表面的T细胞识别信号SIINFEKL-MHC I、MHC II和共刺激信号CD40、CD80和CD86；胞外分泌的免疫促进细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，检测结果如图7所示。
由图7可知，相比于各对照组，疫苗制剂组(DB:CpG/OVA)能够有效地激活树突状细胞，上述指标均得到大幅提升。这说明疫苗制剂具有有效的免疫激活效果。
实施例16
在本实施例中，通过以下方法来对疫苗制剂进行体内抗原特异性CD8T细胞增殖试验，方法如下：
6～8周的雄性C57BL/6小鼠提前12小时进行OVA特异性CD8T细胞的静脉回输。随后，取实施例11制备的疫苗制剂(DB:CpG/OVA，含20μg OVA、50μg疫苗载体和2μg CpG)进行皮下免疫，设PBS、OVA、DB:OVA和CpG+OVA为对照组，对每只小鼠接种100μL每组的样品。
72小时后，提取小鼠淋巴结和脾细胞，利用流式细胞仪对其中OVA特异性CD8T细胞的增殖比例进行分析，结果显示，疫苗制剂(DB:CpG/OVA)组的小鼠体内的OVA特异性CD8T细胞的平均增殖比例高达94.8％，而OVA组则仅为13.4％。这说明制备的疫苗制剂实现了最终有效的免疫激活，增强了抗原的免疫原性。
实施例17
在本实施例中，通过以下方法来对疫苗制剂进行体内CD8T细胞激活试验，方法如下：
用实施例11制备的疫苗制剂对6～8周的雄性C57BL/6小鼠进行皮下免疫，疫苗制剂接种量为100μL。对照组设置同实施例16。28天后，提取小鼠脾细胞，对其中分泌IFN-γ的CD8T细胞(IFN-γ阳性CD8T细胞)的比例进行流式细胞分析。另外，将各组小鼠的脾细胞与表达OVA的淋巴瘤细胞E.G7(以不表达OVA的淋巴瘤细胞EL-4为对照)按5:1、10:1和20:1的比例(效应细胞与目标细胞比率)共孵育12小时，通过测定乳酸脱氢酶泄漏水平评价对E.G7细胞的杀伤能力。结果如图8和图9所示。
由图8可以看出，疫苗制剂组免疫小鼠的脾细胞中，具有细胞杀伤能力的IFN-γ阳性CD8T细胞(IFN-γ⁺CD8T细胞)所占百分比获得大幅提升，即有 效地激活了CD8T细胞。由图9可以看出，在淋巴瘤细胞E.G7组中细胞裂解率显著高于不表达OVA的淋巴瘤细胞EL-4对照组，这说明应用疫苗制剂后对目标肿瘤细胞表现出最强的实际杀伤能力。
实施例18
在本实施例中，通过以下方法来对疫苗制剂进行恶性肿瘤免疫治疗试验，方法如下：
6～8周的雄性C57BL/6小鼠在第0天进行E.G7肿瘤细胞(5×10⁶)接种，在第7天肿瘤体积达到0.5cm×0.5cm×0.5cm后，用实施例11制备的疫苗制剂进行皮下免疫，疫苗制剂接种量为100μL。其中疫苗制剂组增加一组接受二次加强免疫的二免组(2×DB:CpG/OVA)，在第14天进行强化疫苗接种。对照组设置同实施例16，另外设置接种减毒李斯特菌(lm-OVA)的小鼠作为阳性对照组。随后对小鼠的荷瘤体积以及生存情况进行记录，结果如图10所示。
由图10可知，接种疫苗制剂能够取得与减毒李斯特菌(lm-OVA)相当的肿瘤生长抑制效果，能够明显降低小鼠的荷瘤体积，而在进行二免强化治疗后，疫苗制剂能够有效延缓肿瘤生长，延长小鼠的平均生存期。
实施例19
在本实施例中，通过以下方法来对疫苗制剂进行恶性肿瘤早期免疫治疗试验，方法如下：
6～8周的雄性C57BL/6小鼠在第0天进行E.G7肿瘤细胞(5×10⁶)接种，在第4天，用实施例11制备的疫苗制剂进行皮下免疫，疫苗制剂接种量为100μL，在第11天进行强化疫苗接种。同时设立PBS组和OVA组作为对照组。随后对小鼠的荷瘤体积以及生存情况进行记录，结果如图11所示。
由图11可知，在进行二免强化治疗后，疫苗制剂能够完全阻止肿瘤生长， 极大地保证了小鼠的存活率。
实施例20
在本实施例中，通过以下方法来对疫苗制剂进行恶性肿瘤免疫治疗试验，方法如下：
6～8周的雌性BALB/c小鼠在第0天进行4T1肿瘤细胞(5×10⁶)乳房垫原位接种，在第7天肿瘤体积达到0.5cm×0.5cm×0.5cm后，每只小鼠接种100μL实施例13制备的疫苗制剂(含20μg全细胞抗原、50μg疫苗载体和2μg CpG)。随后对小鼠的荷瘤体积以及生存情况进行记录，结果显示，在进行二免强化治疗后，疫苗制剂能够有效延缓肿瘤生长，小鼠的平均生存期从PBS组的46.3天增加至63.8天。
实施例21
在本实施例中，通过以下方法来对疫苗制剂进行抗原特异性中央记忆细胞分化试验，方法如下：
利用实施例11制备的疫苗制剂对6～8周的雄性C57BL/6小鼠进行皮下免疫，疫苗制剂接种量为100μL。第35天取小鼠淋巴结细胞，测定中央记忆细胞占OVA特异性CD8T细胞群体的比例。结果显示，经过二次免疫之后中央记忆T细胞的比例为22.5％，而OVA免疫小鼠的这一比例仅为2.6％。
实施例22
在本实施例中，通过以下方法来对疫苗制剂进行抗原特异性抗体滴度试验，方法如下：
用实施例11制备的疫苗制剂对6～8周的雄性C57BL/6小鼠进行皮下免疫，疫苗制剂接种量为100μL。设置初次免疫(DB:CpG/OVA)和二次免疫(2×DB:CpG/OVA)两个治疗组，并设置共混了500μg铝佐剂的OVA组和OVA 组作为对照组。分别于第14、21、28和35天取小鼠血清，测定其中OVA特异性IgG的滴度水平，结果如图12所示。
由图12可知，经过二次加强免疫之后，疫苗制剂能够取得好于铝佐剂组的OVA特异性IgG抗体表达水平，且效果持久，达到甚至超过市售铝佐剂的水平。
实施例23
在本实施例中，通过以下方法来对抗乙型肝炎疫苗制剂进行抗原特异性抗体滴度试验，方法如下：
按照与实施例21同样的方案，以BALB/c雌性小鼠为对象，对实施例14中所制备的抗乙型肝炎疫苗制剂的抗体激发效果进行考察，同样设置共混了500μg铝佐剂的OVA作为对照组。
结果表明疫苗制剂具有强烈而持久的抗原特异性IgG抗体激发效果，抗体滴度从第14天起到35天，维持在大于6000的高位水平，而市售铝佐剂在相同期间的抗体滴度平均为3700左右。
实施例24
在本实施例中，通过以下方法来对疫苗制剂进行恶性肿瘤免疫防治试验，方法如下：
用实施例11制备的疫苗制剂对6～8周的雄性C57BL/6小鼠按进行皮下免疫，疫苗制剂接种量为100μL。具体地，分别于第0天和第7天进行初次免疫(DB:CpG/OVA)和二次免疫(2×DB:CpG/OVA)，以OVA组为对照组。第21天对小鼠进行腋下E.G7细胞接种，接种量为1×10⁶个细胞。随后，对肿瘤的发生发展情况进行记录，结果如图13所示。
由图13可知，疫苗制剂初次免疫组(DB:CpG/OVA)小鼠肿瘤体积明显小于OVA组，在疫苗制剂二次免疫组(2×DB:CpG/OVA)中，7只小鼠中只有一 只小鼠最终形成了肿瘤负荷，且肿瘤体积很小，这说明疫苗制剂可以对恶性肿瘤起到免疫防治的效果。
因此，本发明通过将微生物模板原料经水热反应制得的疫苗载体，与抗原组分以及任选地免疫调节剂复配得到疫苗制剂，使得疫苗载体材料的孔性、亲疏水性和表面免疫相关配体密度等性质得到优化，从而使得其与抗原组分以及任选的免疫调节剂复配时，抗原装载效率提高，使得制备得到的疫苗制剂实现了强烈的免疫激活效果，高效地增强所负载抗原的免疫原性，通过机体对抗原形成的特异性免疫应答，实现针对特定疾病的免疫治疗及预防。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的疫苗制剂及其制备方法和用途，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。