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本发明公开了一种可特异性结合TRB3的多肽或其衍生物在制备治疗或预防糖尿病性心肌病的药物中的应用；所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种；所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。本发明的多肽或多肽衍生物能够特异性地与TRB3结合，从而阻断TRB3与P62蛋白的相互作用，该肽段的衍生物Pep2-A1，Pep2-A2，Pep2-A3可以治疗高脂饮食诱导的2型糖尿病。

1.  一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗和/或预防糖尿病性心肌病的药物中的应用；
所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种；
所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。

2.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9中的任一种所示。

3.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种的多肽的N端与细胞穿膜肽连接。

4.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种的多肽的C端与细胞穿膜肽连接。

5.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可特异性结合TRB3的多肽或其衍生物作为单一活性成分在制备治疗或预防糖尿病性心肌病的药物中的应用。

6.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可特异性结合TRB3的多肽或其衍生物与其他抗糖尿病性心肌病的药物联合作为活性成分在制备治疗或预防糖尿病性心肌病的药物中的应用。

7.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病性心肌病为糖尿病性心肌病中的心室异常重构。

8.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病性心肌病为糖尿病性心肌病中的心力衰竭。

9.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病性心肌病为糖尿病性心肌病中的心脏组织纤维化。

10.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病性心肌病为由胰岛素抵抗导致的糖尿病性心肌病。

一种多肽在制备治疗或预防糖尿病性心肌病药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种多肽及其衍生物在制备治疗和/或预防糖尿病性心肌病药物中的应用。
背景技术
糖尿病是严重威胁人类健康的内分泌代谢紊乱疾病，以高血糖、高血脂为主要特征。其中2型糖尿病发病率占糖尿病患者90%以上，表现为胰岛素抵抗，并伴有糖尿病并发症的发生，继发于糖尿病的心血管并发症是导致糖尿病患者死亡的首要原因。流行病学调查发现，糖尿病患者有70-80％死于心血管并发症。糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者的主要心脏并发症，该病由代谢紊乱及微血管病变引发心肌广泛灶性坏死及纤维化进而导致心脏重构，并最终发展为心功能异常和心力衰竭。
糖尿病性心肌病的发病机制与胰岛素抵抗密切相关，与正常人群相比，糖尿病心肌病患者表现出明显的胰岛素抵抗；机体对胰岛素的敏感性降低可以诱发明显的高血压、左心室肥厚和功能障碍，进而引发心力衰竭。Ozcan等人证实内质网应激（ERS）异常是引起胰岛素抵抗，诱发糖尿病的重要途径，抑制ERS可以显著增加肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素的敏感性，改善糖尿病和肥胖。自噬被认为具有维持内质网功能和稳态的作用，自噬受损会引起ERS。
自噬是生物进化过程中产生的一种细胞蛋白和细胞器的循环利用机制，参与多种疾病如神经退行性疾病、癌症及心脏疾病等的病理过程。自噬过程广泛存在于正常的生理过程中，作为细胞对不良环境的一种防御机制，参与内质网应激引起的异常蛋白和受损细胞器的降解、炎症和氧自由基的清除以维持正常细胞稳态；但是自噬过度往往会导致胞内重要组分被降解，细胞发生死亡，因此自噬也被认为是另一种形式的程序性细胞死亡。无论是自噬过 度还是自噬不足都可能导致疾病发生。在正常心脏中，存在着低水平的自噬活动，若自噬缺陷可引起心功能不全甚至心力衰竭。
TRB3（Tribbles Homologue3）是Tribbles同源蛋白家族成员之一，最早在果蝇中被鉴定到，并发现该蛋白能抑制有丝分裂，调节发育过程中细胞的增殖、迁移及形态形成。在哺乳动物中，有三种Tribbles同源蛋白：TRB1，TRB2和TRB3，它们都是假激酶蛋白家族成员。这三种蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶样结构域（Kinase like domain,KD），但却缺乏ATP的结合位点和催化残基，因此没有激酶活性。尽管如此，Tribbles蛋白却具有接头蛋白样的功能，参与多种蛋白复合体的组装。在哺乳动物Tribbles家族成员中，TRB3的研究最为深入，其相互作用蛋白包括转录因子、泛素连接酶、细胞膜上II型BMP受体以及MAPK、PI3K信号通路成员。通过与这些蛋白相互作用，TRB3参与了糖脂代谢、脂肪细胞分化、凋亡、应激和胶原表达等的调控。
肿瘤细胞内TRB3的过度表达能降低自噬关键性抑制因子mTOR蛋白水平，并抑制多个自噬相关蛋白，例如II型LC3、Becline-1、PI3K3C表达增多，进而造成自噬相关货车蛋白P62产生堆积，证明肿瘤细胞内TRB3表达能诱导自噬受到抑制。P62是反映自噬动态过程的重要指标，作为“货车蛋白”，P62蛋白结构域中的泛素相关结构域（Ubiquitin associated domain,UBA）能与泛素化蛋白（Ubiquitin,Ub）结合，并把它们募集到自噬体膜上与LC3结合，这个过程主要通过P62蛋白的LIR（LC3-Interacting Region,LIR）结构域与LC3结合，介导泛素化蛋白的降解，P62的表达水平也随之降低。自噬受到抑制时，P62与其结合的泛素化蛋白不能及时降解，在胞浆内堆积而表达升高。肿瘤细胞内的TRB3主要与P62蛋白发生相互作用，进而阻断其他泛素化蛋白与P62蛋白的结合，造成自噬通路被抑制，诱导肿瘤细胞的发生和转移。
近来的研究证据表明，TRB3在糖尿病性心肌病的发生、发展过程中都具有重要的调节作用。链脲菌素（STZ）诱导的2型糖尿病小鼠心脏组织中TRB3的表达明显升高，TRB3可通过抑制Akt活性干扰胰岛素信号通路， 引发2型糖尿病小鼠心脏组织炎症和纤维化，沉默TRB3可以显著改善糖尿病小鼠心脏肥厚和组织胶原沉积。Tang等人也发现糖基化终产物（AGEs）激活TRB3/MAPK信号通路介导的I型和III型胶原表达，参与糖尿病性心肌病组织纤维化的发生。因此，研究和开发TRB3蛋白的抑制剂，或者阻断其与P62蛋白结合的物质，将为糖尿病性心肌病的临床治疗提供有效且崭新的手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前缺乏能有效利用的TRB3蛋白抑制剂的现状，而提供一种能特异性结合TRB3的多肽及其在制备治疗和/或预防糖尿病性心肌病的药物中的应用。
本发明提供的技术方案是：一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗和/或预防糖尿病性心肌病的药物中的应用；
所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种；
所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。
本发明中，所述的如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中，可适当引入氨基酸替换，缺失或添加，只要改变后的氨基酸序列仍然能够形成能与TRB3特异性结合的多肽且该多肽仍然保持改变前的活性即可。
本发明中，所述的细胞穿膜肽为本领域常规所述的细胞穿膜肽，只要其能辅助将所述多肽送入细胞以发挥作用即可，一般而言，所述的细胞穿膜肽为由10～30个氨基酸组成的短肽分子。所述的细胞穿膜肽较佳地为Pep2多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；即在本发明中，所述的多肽衍生物较佳地为以Pep2多肽连接如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种多肽后所形成的嵌合多肽。所述的细胞穿膜肽还可以为HIV-1病毒反转录激活因子（Trans-activator transcription，Tat） 蛋白的TAT肽（YGRKKRRQRRR，其氨基酸序列如SEQ ID：5所示）、果蝇触角同源异型蛋白的转录因子Antp肽（RQIKIWFQNRRMKWKK，其氨基酸序列如SEQ ID：6所示）、Pep-1肽（KETWWETWWTEWSQPKKKRKV，其氨基酸序列如SEQ ID：7所示）、MPG肽（GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV，其氨基酸序列如SEQ ID：8所示）和RGD肽（Ar g-Gly-Asp，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示）中的任一种或多种。所述细胞穿膜肽较佳地连接在所述多肽的N端或者C端，更佳的是N端。
本发明所述多肽及其衍生物可以作为活性成分用于制备预防和/或治疗糖尿病性心肌病的药物。所述的“活性成分”是指具有预防和/或治疗糖尿病性心肌病功能的化合物，即所述多肽或所述多肽的衍生物用于制备预防和/或治疗糖尿病性心肌病的药物。在该药物中，所述多肽或所述多肽的衍生物可以单独作为活性成分，也可以和其他化合物一起作为活性成分。
本发明中，所述的药物可以包含生理学或药学上可接受的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料，较佳地选自壳聚糖及其衍生物、卡波姆和脂质体中的一种或多种。因此，在本发明中，所述的多肽或所述多肽的衍生物较佳地与所述药物辅料组成药物组合物。所述的药物组合物的剂型可以为本领域常规所述的各种剂型，较佳地是固体、半固体或液体的形式，可以是水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。所述药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药，所述注射给药较佳地包括：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射途径给药。
本发明所述的药物组合物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，使用剂量较佳地为0.1～15mg/kg，更佳地为5～10mg/kg，最优选为5mg/kg，给药次数较佳地为一天一次或数次。
本发明中，所述的糖尿病性心肌病能够引发多种病症，本发明所述的多肽或所述多肽的衍生物能够针对性地治疗该些病症，所述病症较佳地为糖尿病性心肌病引起的心室异常重构，或者，较佳地为糖尿病性心肌病引起的心 力衰竭，或者，较佳地为糖尿病性心肌病引起的心脏组织纤维化。
本发明中，所述的糖尿病性心肌病较佳地为由胰岛素抵抗导致的糖尿病性心肌病。
在预防或治疗糖尿病性心肌病时，本发明所述的药物组合物可以单独使用或者和其他药物联合使用。
在符合本领域常识的基础上，上述的各优选条件可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的多肽或多肽衍生物能够特异性地与TRB3结合，从而阻断TRB3与P62蛋白的相互作用，该肽段的衍生物Pep2-A1，Pep2-A2，Pep2-A3可以治疗高脂饮食诱导的2型糖尿病，效果非常显著。
附图说明
图1为免疫共沉淀方法验证在心肌细胞中P62蛋白与TRB3蛋白之间存在相互作用的结果图。
图2为STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠模型制备、动物分组、Pep2-A1、Pep2-A2、Pep2-A3多肽给药安排。
图3：Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心室壁厚度和心功能的影响。从左到右，从上到下依次为对照组、模型组、Pep2-A1、Pep2-A2、Pep2-A3多肽给药组小鼠的典型超声心动图。
图4：Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心室前壁（LVAWd）、后壁（LVPWd）和室间隔（IVSd）厚度的影响。
图5：Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心脏短轴缩短率（FS）和射血分数（EF）的影响。
图6：Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心脏血流动力学指标左心室收缩压上升最大速率（+dP/dtmax）（图6（A））和舒张压下降最大速率（-dP/dtmax）（图6（B））的影响。
图7：Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心脏组织纤维化的影响。图7（A）从左到右依次为对照组、模型组、Pep2-A1、Pep2-A2、Pep2-A3多肽给药组小鼠心脏组织胶原经天狼星红染色后的代表性图片，图7（B）为胶原面积统计结果。
图8：Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心脏组织细胞因子TGF-β1的影响。图8（A）为对照组、模型组、Pep2-A1、Pep2-A2、Pep2-A3多肽给药组小鼠心脏组织TGF-β1典型免疫组化图，图8（B）为TGF-β1表达统计结果。
图9：Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心脏组织细胞因子IL-6的影响。图9（A）为对照组、模型组、Pep2-A1、Pep2-A2、Pep2-A3多肽给药组小鼠心脏组织IL-6典型免疫组化图，图9（B）为IL-6表达统计结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，部分物质的全称或相应的中文名称如下：
Langendorff：离体心脏灌流装置；
KHB：Krebs-Henseleit缓冲液；
Laminin：层粘连蛋白；
HEPES：羟乙基哌嗪乙硫磺酸；
BSA：牛血清白蛋白；
EDTA：乙二胺四乙酸；
NP-40：乙基苯基聚乙二醇；
TBST：含吐温-20的Tris缓冲液；
PMSF：苯甲基磺酰氟
PBS：pH7.4的磷酸缓冲液
Leu（Leupeptin，亮肽素）、Pep（Pepstatin，胃酶抑素）、Apr（Aprotinin，胰蛋白酶抑制剂）、DTT（Dithiothreitol，二硫苏糖醇）：均为蛋白酶抑制剂。
下述实施例中，序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的多肽分别称为A1、A2和A3，其连接Pep2细胞穿膜肽（Pep2的氨基酸序列为HLYVSPW，如序列表中SEQ ID NO:4所示）后形成的嵌合多肽分别称为Pep2-A1、Pep2-A2和Pep2-A3，上述多肽或嵌合肽均由北京赛百盛基因技术有限公司人工合成。A1、A2和A3通过两个谷氨酸链连接到Pep2的C端。以上嵌合肽的序列结构如下：
Pep2-A1序列为：
“N”-His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ser-Leu-Ser-Gln-Met-Leu-Ser-Met-“C”（其序列如序列表中SEQ ID NO:10所示）。
Pep2-A2的序列为：
“N”-His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys-“C”（其序列如序列表中SEQ ID NO:11所示）。
Pep2-A3的序列为：
“N”-His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ile-Gly-Ala-Ala-Leu-Asp-Thr-Ile-“C”（其序列如序列表中SEQ ID NO:12所示）。
下述实施例中所述室温如本领域常规所述，一般指15～25℃。
实施例1原代大鼠心肌细胞分离与培养
雄性大鼠（6周龄）腹腔注射10000U/kg肝素，并按50mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉后，迅速开胸取心脏，立即放入冰冷的PBS中。清理结缔组织并剥离主动脉，将心脏悬挂于Langendorff灌注装置并固定，使 心脏周围及灌流液的温度均保持在37℃，经主动脉逆行灌流Krebs-Henseleit缓冲液KHB（含有118mM NaCl、4.8mM KCl、25mM HEPES、1.25mM K₂PO₄、1.25mM MgSO₄、11mM葡萄糖和5mM牛磺酸，pH7.4）5分钟，随后换消化液（含有0.7mg/mL II型胶原酶，0.2mg/mL透明质酸酶，0.1%BSA和25μMCa²⁺）持续灌注10分钟，将消化液中的Ca²⁺浓度从25μM补充到100μM，再灌注5分钟。当心脏变软后，将心脏剪下置入KHB中，剪去心房和基底部组织，将心室组织剪成约1×1×1mm碎块，用吸管轻轻吹打，见到单个细胞和细胞团脱落，用240μm的尼龙网过滤，滤液经500转/分离心后置于KHB中，重复离心一次并去上清，将沉淀细胞悬于DMEM培养基（含有2mg/mL BSA、2mM L-肉毒碱、5mM肌酸、5mM牛磺酸、100IU/mL青霉素和100ug/mL链霉素）。细胞计数后铺于Laminin包被的培养皿，培养于培养箱（37℃，5%CO₂）中，待细胞贴壁2小时后更换DMEM培养基，并于DMEM培养基中加入25mM高糖刺激。12小时后在培养基中直接加入0.5mM的Pep2-A1、Pep2-A2、Pep2-A3，使其终浓度为5μM，相互作用24小时后收集细胞。
实施例2免疫共沉淀的方法验证蛋白p62与蛋白TRB3在心肌细胞内存在相互作用
免疫共沉淀试剂如下：
（1）裂解液A液：0.6057g Tris碱，1.7532g NaCl，0.1017g MgCl₂·6H₂O，0.0742g EDTA，10mL甘油，10mL10%NP-40，加去离子水至150mL，用HCl调pH值至7.6，定容至191mL，充分混匀，0.45μm滤膜过滤，4℃储存。
（2）裂解液B液：200μL2Mβ-磷酸甘油，4mL 2.5M NaF，2mL 100mM NaVO₃，2mL 100mM PMSF，200μL 1M DTT，1mg/mL的Leu、Pep、Apr各200μL，总体积共9mL。母液于-20℃储存。使用前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀，得到免疫共沉淀裂解液。
（3）Protein A/G Plus-Agarose购自美国Santa cruz公司。
具体操作步骤如下：
1）收集培养的原代大鼠心肌细胞。
2）以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白，将蛋白调整至15μg/μl，取200μg蛋白留作“输入细胞裂解液”，以作为对照。
3）剩余蛋白（除“输入细胞裂解液”之外的总蛋白，大约2mg）加入2μg P62抗体（购自Sigma公司）或者与P62抗体种属相同的正常IgG抗体（购自Santa cruz公司），同时加入10μL Protein A/G Plus-Agarose充分重悬，4℃缓慢旋转摇动过夜。4℃、3000rpm离心5min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到Agarose。加入0.5mL免疫共沉淀裂解液，混匀，冰浴静置1min，4℃、3000rpm离心30sec，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入20-30μL2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性3min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
结果如图1所示，在心肌细胞内TRB3蛋白与P62蛋白存在明显的结合，而Pep-A1，Pep-A2，Pep-A3可以显著干扰这种结合。其中输入代表初始细胞裂解液，输出代表经过P62抗体及对照抗体IgG沉淀过的裂解液。
实施例3链脲菌素（STZ）加高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠模型制备、实验分组及给药方案
1、模型制备
SPF级C57BL/6J小鼠（雄性，3-4周龄）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。小鼠适应性饲养一周后，按体重随机分为2组：高脂+STZ组40只，给予高脂高糖饲料(含有35%脂肪，18%蛋白质，47%碳水化合物)；对照组10只，持续给予基础饲料（含有4%脂肪，18%蛋白质，78%碳水化合物）直到实验结束。持续4周后，高脂+STZ组腹腔注射链脲菌素STZ溶液100mg／kg（溶于0.1M柠檬酸缓冲液，PH4.5），并继续给予高脂高糖饲料； 对照组腹腔注射溶剂0.1M柠檬酸缓冲液。再持续4周后尾静脉取血检测血糖（BG），血糖>11.1mM表示高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠模型构建成功。
2、实验分组及给药方案
将高脂+STZ组的小鼠按血糖>11.1mM（表示建模成功）随机分为四组并持续给予高脂高糖饲料：模型组（糖尿病组）和给药组（Pep2-A1,Pep2-A2或Pep2-A3）。给药组分别按5mg/kg的剂量每3天尾静脉注射Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3的溶液（将Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3多肽干粉溶于PBS缓冲液所得）1次；模型组给予对照溶剂PBS。持续给药12周后进行小鼠心功能检测，收集心脏进行心脏结构、心肌细胞形态及组织病理学检测。具体给药分组和时间安排见图2，图2中，虚线代表给予基础饲料，实线代表给予高脂饲料，第4周STZ造模，第8周将模型组和给药组按血糖统一分组，持续到第20周检测心功能和组织细胞形态。
实施例4超声心动检测评价小鼠心脏功能和形态
实验结束前一日，小鼠按50mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉后，对其胸腹部进行脱毛处理，仰卧位固定于超声检测台，使用VisualSonics Vevo770（VisualSonics，加拿大）超声系统进行检测：先用10M Hz超声探头对小鼠心脏长轴方向进行B型超声监测，确定左心室乳头肌位置后，再转为心脏短轴方向进行监测，并记录其10～20个心动周期的M型超声变化图；用Vevo770软件分别测量舒张末期左室前壁厚度（LVAWd）、左室后壁厚度（LVPWd）、室间隔厚度（LVSd）、短轴缩短率（Fractional Shortening，FS）、射血分数（Ejection Fraction，EF）等各项心脏结构和心功能指标。
心室异常重构是糖尿病性心肌病重要的心脏结构病理改变。VasualSonics超声心动检测结果发现：STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病后第16周，模型组小鼠出现明显的心室壁变厚和心功能降低等病理改变，以及明显的心衰表现，而Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3可以显著抑制LVAWd和IVSd的增加，改善FS和EF心脏功能指标。图3为代表性超声心动图，图4为心脏结构指标LVAWd、IVSd和LVPWd具体统计结果，图5为心功 能指标FS和EF具体统计结果（#p<0.05与正常组比较，*p<0.05与模型组比较）。
实施例5血流动力学检测评价小鼠心脏功能
实验结束时对小鼠进行血流动力学检测，腹腔注射10000U/kg肝素，并按50mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，仰卧位固定，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉，用PE10导管（购自Alcolt Biotech公司）进行插管至左心室，连接血管与压力换能器。MPA2000生理信号采集仪（购自Alcolt Biotech公司）记录心室内血流动力学的改变，计算出反映左室收缩功能的血流动力学指标-左心室收缩压最大上升速率（+dP/dt_max）以及反映左室舒张功能的指标-左心室舒张压下降最大速率（-dP/dt_max）。
结果发现，STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病第16周，模型组小鼠表现出左心室收缩和舒张功能的显著下降，表现为+dP/dt_max和-dP/dt_max均低于正常小鼠（分别降低44%和45%），而Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3可以显著改善+dP/dt_max和-dP/dt_max。图6为心功能指标+dP/dt_max和-dP/dt_max具体统计结果，与模型组比较，Pep2-A1、Pep2-A2、Pep2-A3分别提高+dP/dt_max44.8%、57.3%、51.2%；提高-dP/dt_max44.8%、53.4%、44.8%，#p<0.05与正常组比较，*p<0.05与模型组比较。
实施例6病理组织学分析
实施例5结束后，收集部分心脏经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋并进行横切，经苏木素-伊红（HE）染色，评价整体心脏结构改变。组织切片经天狼星红染色后偏振光显微镜下观察，确定心脏胶原沉积情况判断纤维化程度，并应用高清晰彩色病理图文分析系统Spot Advanced3.0获得高清晰的天狼星红特殊染色的病理图片（200倍放大）。使用Image-Pro Plus5.1测量每个视野天狼星红染色后胶原着色面积。每组分析6-8个标本，每个标本随机选取10个视野，取均值代表一个动物胶原组织在心脏组织内的含量和表达强度。通过非参数方差分析比较各组“胶原绝对面积”。
心脏组织纤维化是心脏病致死的重要原因之一。胶原绝对面积百分率是 评价组织纤维化程度的可靠指标，利用天狼星红染色检测心脏组织胶原沉积可以在一定程度反映心肌纤维化的情况。正常组心肌组织胶原组织相对较少，STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心肌组织胶原明显增加，形成严重心肌纤维，胶原绝对面积百分率增至正常值的3倍，Pep2-A1、Pep2-A2或Pep2-A3可以显著降低STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心肌组织胶原沉积。结果如图7所示，与模型组比较，Pep2-A1、Pep2-A2和Pep2-A3给药组分别降低56.2%、55.5%和53.5%（#p<0.05与正常组比较，*p<0.05与模型组比较）。
实施例7免疫组织化学检测心脏组织细胞因子表达
免疫组织化学染色检测心脏组织TGF-β1和IL-6表达变化，SP试剂盒（SP9001或SP9003）和显色剂DAB（ZLI-9032）由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。采用SABC（strept avidin-biotin complex）免疫组化染色方法进行检测，主要步骤包括：常规脱蜡、水化；3％过氧化氢去除内源性过氧化物酶；胰酶组织抗原修复；正常血清封闭；加一抗（TGF-β1：Santa Cruz，用PBS以1:100稀释；IL-6：Santa Cruz，用PBS以1:100稀释）4℃过夜；加入生物素化标记的抗兔属性二抗（中杉金桥，用PBS以1:100稀释），ABC复合物（亲合素-生物素-过氧化物酶复合物），DAB（二氨基联苯胺）覆盖组织并显色30秒，PBS洗脱；透明，封片。阳性染色为胞浆或胞核棕色颗粒，阴性对照以PBS或正常山羊血清代替一抗。
获得性免疫Th1/Th2反应极化方向的紊乱是造成心肌病理性重构的因素之一。TGF-β1是典型的Th2型细胞因子，它可以将心脏成纤维细胞活化为肌成纤维细胞，并且刺激肌成纤维细胞产生细胞外基质促进心脏纤维化，通过免疫组织化学分析证实，与模型组比较，Pep2-A1,Pep2-A2或Pep2-A3可以显著降低心脏中TGF-β1的表达，分别可以降低44%、53%或49%，（结果如图8所示，#p<0.05与正常组比较，*p<0.05与模型组比较）。Th0细胞分化为TH1和TH2细胞亚群是受多种细胞因子调控的。已有研究资料表明：IL-6不仅可以促进CD4⁺Th2细胞的分化，同时也有可以上调CD4⁺T细胞 SOCS-1基因的表达，干扰了IFNγ受体的信号转导，从而阻断了IFNγ对IFNγ基因的自我调节，实现IL-6对Th1细胞的负性调控，因此它在平衡Th1/Th2免疫反应中起着重要的调节作用。免疫组织化学的结果表明：模型组小鼠心脏组织中IL-6的表达水平与正常组比较升高2.8倍，而Pep2-A1,Pep2-A2或Pep2-A3与模型组比较，可以显著降低IL-6的表达46%、48%、32%（图9，#p<0.05与正常组比较，*p<0.05与模型组比较）。