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本发明公开了一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株，该菌株为大肠杆菌；保藏名称为大肠埃希氏菌；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2014年10月24日；保藏编号：CGMCCNo.9842。本发明所述的大肠杆菌制备的大肠杆菌菌剂。本发明体内活性高、成本低的制备活性短肽的大肠杆菌菌株。

1.  一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株，其特征在于：该菌株为大肠杆菌；保藏名称为大肠埃希氏菌；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2014年10月24日；保藏编号：CGMCC No.9842。

2.  根据权利要求1所述的大肠杆菌制备的大肠杆菌菌剂。

3.  根据权利要求1所述的大肠杆菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的大肠杆菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所得大肠杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得大肠杆菌细胞的超声裂解沉淀。

4.  制备权利要求3所述大肠杆菌菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将菌株单菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培养基中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm摇床培养12-14h；
(2)将培养液按2％的接种量转接入含50μg/ml的Kana的TB培养液中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm；
(3)摇瓶将大肠杆菌菌种培养至菌体OD值达到0.6-0.8，添加IPTG至终浓度为0.02-0.2mM，温度为20-37℃诱导培养时间为5-20h后，取样SDS-PAGE分析，制得大肠杆菌菌剂。

5.  根据权利要求4所述的大肠杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述LB培养基按质量百分比由1％Tryptone、0.5％Yeast extract、1％NaCl、pH 7.0的组分组成。

6.  根据权利要求4所述的大肠杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述TB培养液按质量百分比由1.2％Tryptone、2.4％Yeast extract、0.4％glycerol、0.2％KH₂PO4和1.6％K₂HPO₄的组分组成。

7.  按照权利要求1所述的大肠杆菌菌株在制备治疗高血压药中的应用。

一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株。
背景技术
大肠杆菌是存在于恒温动物肠道中的一种革兰氏阴性圆形杆菌。大多数的大肠杆菌的菌株是没有危害的，但是一些血清型可以导致人类严重的食物中毒。没有危害的大肠杆菌是肠道的正常菌群的一部分，其产生维生素K2对宿主是有益的，而且还能防止肠道中其他致病性病源菌的生成。大肠杆菌占整个肠道菌群的0.1％，粪口传播途径是该病原菌致病的重要途径。同时大肠杆菌是被广泛研究的原核模式生物，因其可作为重组DNA的宿主，是微生物学和生物技术领域的一个重要的细菌。正因为大肠杆菌具有如此重要的作用，通过表型研究空间环境下的细菌突变株，并利用基因组、转录组、蛋白质组三大组学研究方法，研究细菌对空间环境的适应性变化，关注其致病性、耐药性的变化，为预防感染性疾病在空间站中的发生奠定基础。
目前已有大量“通过常规分离手段纯化高纯活性肽”的专利报道，尽管研究者们鉴定出的某些肽段显示出极强的生理活性，如IPP、VPP、IKW、LHP等降血压肽和YHY、PHH、YKY、YPPAK、HDHPVC等抗氧化肽，但由于蕴藏于母体蛋白序列中的有效活性肽段比例低，导致酶解后期的低产率和高分离成本，除了极少数活性肽段，如IPP、VPP等有产品问世外，大多数高活性功能肽并没有得到有效开发利用。
随着基因工程技术的发展，利用DNA重组技术，将表达活性肽的基因克隆到某些微生物或动物体内，通过生物体直接表达出所需肽类，可大大增加其产量和纯度。目前，有关“利用基因工程菌制备活性肽”的专利报道已呈逐年增多的趋势。尽管利用基因工程技术制备高活性短肽已取得了技术上的突破，但活性肽多聚体的基因设计、表达效率及下游分离工艺有待进一步的完善。
近年来，细胞生物学和分子生物学的研究表明人体内除了具有升压物质及系统外，尚具有许多内源性减压物质及系统，以维持血压的相对稳定。如果将降血压肽和抗氧化肽联合应用于心血管疾病的预防与控制，将会起到良好的效果。已有不少研究报道了通过酶解法同步制备高降血压肽与抗氧化联合作用的相关报道。但是，目前尚无利用基因工程菌同步制备ACE 抑制肽和抗氧化肽的报道。
目前，缺乏一种体内活性高、成本低的制备活性短肽的大肠杆菌菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种体内活性高、成本低的制备活性短肽的大肠杆菌菌株。
本发明的技术方案如下：本发明提供了一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株，该菌株为大肠杆菌；保藏名称为大肠埃希氏菌Escherichia coli；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2014年10月24日；保藏编号：CGMCC No.9842。
本发明所述的大肠杆菌制备的大肠杆菌菌剂。
本发明所述的大肠杆菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的大肠杆菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所得大肠杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得大肠杆菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明制备所述大肠杆菌菌剂的方法，包括如下步骤：
(1)将菌株单菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培养基中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm摇床培养12-14h，
(2)将培养液按2％的接种量转接入含50μg/ml的Kana的TB培养液中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm，
(3)摇瓶将大肠杆菌菌种培养至菌体OD值达到0.6-0.8，添加IPTG至终浓度为0.02-0.2mM，温度为20-37℃诱导培养时间为5-20h后，取样SDS-PAGE分析，制得大肠杆菌菌剂。
进一步地，在步骤(1)中，所述LB培养基按质量百分比由1％Tryptone、0.5％Yeast extract、1％NaCl、pH 7.0的组分组成。
进一步地，在步骤(2)中，所述TB培养液按质量百分比由1.2％Tryptone、2.4％Yeast extract、0.4％glycerol、0.2％KH₂PO₄和1.6％K₂HPO₄的组分组成。
本发明所述的大肠杆菌菌株在制备治疗高血压药中的应用。
有益效果：本发明的菌株体内活性高、成本低的特点。大肠杆菌菌剂属于生物制剂，完全没有因化学药剂的使用所带来的化学抗药性等问题。获得的重组多肽中的活性小肽能被胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶有效释放，制得的活性肽混合体具有高体内降压活性及抗 氧化活性。本发明终产品小肽混合物协同降压的同时能改善血管内皮细胞功能，多角度预防与维护心血管健康；本发明菌株在制备治疗高血压药中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明所构建重组质粒示意图；
图2为本发明的重组质粒PCR鉴定示意图；
图3为本发明的重组质粒的双酶切鉴定示意图；
图4为SDS-PAGE鉴定重组蛋白包涵体表达示意图；
图5为SDS-PAGE鉴定重组蛋白纯化示意图；
图6为SDS-PAGE鉴定重组多肽A3纯化示意图；
图7为SDS-PAGE鉴定重组蛋白可溶性表达示意图。
具体实施方式
下面将通过附图和具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1
本发明提供了一种菌株，一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株，该菌株为大肠杆菌；保藏名称为大肠埃希氏菌；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2014年10月24日；保藏编号：CGMCC No.9842。
本发明所述的大肠杆菌制备的大肠杆菌菌剂。
本发明所述的大肠杆菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的大肠杆菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所得大肠杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得大肠杆菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明制备所述大肠杆菌菌剂的方法，包括如下步骤：
(1)将菌株单菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培养基中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm摇床培养12h，所述LB培养基为1％Tryptone、0.5％Yeast extract、1％NaCl、pH 7.0。所述LB培养基按质量百分比由1％Tryptone、0.5％Yeast extract、1％NaCl、pH 7.0的组分组成。
(2)将培养液按2％的接种量转接入含50μg/ml的Kana的TB培养液中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm,所述TB培养液按质量百分比由1.2％Tryptone、2.4％Yeast extract、0.4％glycerol、0.2％KH₂PO₄和1.6％K₂HPO₄的组分组成。
(3)摇瓶将大肠杆菌菌种培养至菌体OD值达到0.6，添加IPTG至终浓度为0.2mM，温度为37℃诱导培养时间为5h后，取样SDS-PAGE分析，制得大肠杆菌菌剂。
本发明所述的大肠杆菌菌株在制备治疗高血压药中的应用。
如图1至图7所示，图1为本发明所构建重组质粒示意图；图2为本发明的重组质粒PCR鉴定示意图，泳道M为DL10000DNA标样，泳道1、2、3均为同一PCR产物(以重组质粒pET28a-ESA3为模板，引物5’-TTCCTGGAACCGGA-3’和5’-CCAAGCCACACGA AAC-3’为上下游引物)；图3为本发明的重组质粒的双酶切鉴定示意图，M为DNA Marker，泳道1-5分别为Nco I/Bam HI、Bam HI/Hind III、Hind III/Xho I、Bam HI/Xho I、Nco I/Xho I双酶切产物，泳道6为重组质粒；图4为SDS-PAGE鉴定重组蛋白包涵体表达示意图，泳道M为蛋白标样，泳道1、2和3分别为诱导后重组菌超声破碎原液、超声上清和超声沉淀；图5为SDS-PAGE鉴定重组蛋白纯化示意图，M蛋白质Marker，0透析后的融合蛋白，泳道1、2、3分别为终浓度1.0、1.5、2.0mol/L氯化钠纯化后的融合蛋白；图6为SDS-PAGE鉴定重组多肽纯化示意图，泳道M为蛋白标样，泳道1为融合蛋白Elps-SUMO-A3经SUMO蛋白酶酶解后的产物，泳道2和3分别为在上述酶解产物中加入终浓度1.0mol/L氯化钠盐析后的离心上清和沉淀；图7为SDS-PAGE鉴定重组蛋白可溶性表达示意图；泳道M为蛋白标样，泳道1、2和3分别为诱导后重组菌超声破碎原液、超声上清和超声沉淀；
本发明的一种重组活性肽，所述重组活性肽是由活性肽单体叠加或定向串联而成的，所述活性肽单体包括降血压肽单体和抗氧化肽单体，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1。
本发明的一种编码所述的重组活性肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2。
所述的抗氧化肽单体有DTHK、YPIL、FLEPDY、YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、HYRPFW、Y EPDY和IWAPFY；所述降血压肽单体有MRW、WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、DGL、IPP、IKP、IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY和IVY。
所述活性肽单体部分肽段的N末端为胃蛋白酶酶切位点；所述活性肽单体部分肽段的C末端为胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶切位点；所述重组降血压肽和抗氧化肽中部分活性肽单体之间由带有胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶切位点的连接片段串联而成。
本发明同步制备所述的重组活性肽的方法，包括如下步骤：
(1)重组降血压肽和抗氧化肽及其编码基因的设计与优化；
本发明的人工合成序列表SEQ ID NO：2所示的基因；本发明中的活性肽单体均从所构建 活性肽数据库中筛选，其中部分活性肽根据复合功能肽前体的设计需要进行人为改造。所筛选活性肽的总特点为：抗胃肠酶消化；易于胃肠酶的完整释放；具有高体内生物活性。经初步筛选，选定ACE抑制肽单体为：MRW、WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、DGL、IPP、IKP、IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY、IVY等；选定抗氧化肽单体为：DTHK、YPIL、FLEPDY、YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、HYRPFW、Y EPDY、IWAPFY等。
以活性肽单体理论上易于胃肠消化酶有效释放为前提，采用直接首尾连接，或采用合适的连接短肽(2-3氨基酸残基，具有生物活性)，或将含有部分相同氨基酸残基的不同活性肽进行叠加，将筛选到的目标活性肽定向串联组装成复合功能肽前体重组活性肽，并利用蛋白质结构预测软件和基因优化软件指导重组活性肽及其基因的设计，旨在使得重组活性肽基因理论上能在工程菌细胞中实现稳定高效表达。
基于以上策略，本发明所设计重组降血压肽和抗氧化肽的氨基酸序列如下：

编码重组降血压肽和抗氧化肽的核苷酸序列如下：

(2)重组表达载体及重组菌的构建；
如图1所示，重组质粒pET28a-ESA3的构建。采用分子克隆技术，将步骤(1)所设计并优化的重组活性肽基因克隆入pET28a的Hind III和Xho I位点，并分别在重组活性肽上游的Nco I和BamHI位点以及Bam HI和Hind III位点克隆入类弹性蛋白纯化标签ELPs基因和SUMO 融合标签基因，构建重组表达载体pET28a-ESA3，并转化E.coli BL21(DE3)，获得工程菌。
如图2所示，以重组质粒pET28a-ESA3为模板，引物5’-TTCCTGGAACCGGA-3’和5’-CCAAGCCACACGAAAC-3’为上下游引物进行PCR，获得了约340bp的PCR产物，与预期目的片段重组活性肽的大小相近。
重组质粒分别经限制性内切酶Nco I/Bam HI、Bam HI/Hind III、Hind III/Xho I、Bam HI/Xho I、Nco I/Xho I进行双酶切鉴定。
Nco I/Bam HI双酶切反应体系如下：

Bam HI/Hind III、Hind III/Xho I、Bam HI/Xho I、Nco I/Xho I双酶切体系同上。充分混匀后37℃保温2h，反应结束后加6μL电泳上样缓冲液终止反应，经1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察酶切结果。结果如图3所示，1-5号泳道显示Nco I/Bam HI、Bam HI/Hind III、Hind III/Xho I、Bam HI/Xho I、Nco I/Xho I双酶切所得片段大小与ELPs基因片段(573bp)、SUMO基因片段(294bp)、A3基因片段(345bp)、SUMO-A3基因片段(639bp)和ELPs-SUMO-A3基因片段(1218bp)的大小相符。经进一步的测序证实，所克隆基因序列及读码框均正确无误，说明重组质粒构建成功。构建能高效表达与纯化重组降血压肽和抗氧化肽的表达载体；所述表达载体为pET28a，宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。采用DNA重组技术，将序列表SEQ ID NO：2所示的基因插入pET28a的Hind III和Xho I位点中，并分别在基因的上游的Nco I和Bam HI位点以及Bam HI和Hind III位点克隆入类弹性蛋白纯化标签ELPs基因和SUMO融合标签基因，获得重组表达载体pET28a-ESA3。
(3)用所述表达载体转化宿主菌构建基因工程菌；并转化E.coli BL21(DE3)，获得工程菌；重组蛋白Elps-SUMO-A3在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达
挑含重组质粒pET28a-ESA3的E.coli BL21(DE3)单菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培养基(1％Tryptone、0.5％Yeast extract、1％NaCl、pH 7.0)中，37℃，200rpm摇床培养过夜，后将过夜培养液按2％的接种量转接入含50μg/ml的Kana的TB培养液(1.2％Tryptone、2.4％Yeast extract、0.4％glycerol、0.2％KH₂PO₄、1.6％K₂HPO₄)中，37℃，200rpm，摇瓶培养至菌体OD_600nm值达到0.6-0.8，添加IPTG至终浓度为0.2mM，37℃，诱导培养5h后，取样SDS-PAGE分析，如图4得知，工程菌在诱导培养5h后，相对诱导前样，有一分子 量约45kDa的蛋白条带出现，以上表明重组蛋白Elps-SUMO-A3在E.coli BL21(DE3)成功获得融合表达，经灰度扫描分析，重组蛋白的表达量占细胞总蛋白的65％以上，其中90％以上以包涵体形式表达，且包涵体中目标蛋白的纯度在80％以上。
(4)利用所述工程菌表达重组活性肽；Elps-SUMO-A3包涵体制备及复性
将培养所得菌液分装，4000rpm离心5min获得菌体沉淀，向沉淀中分别加入20ml pH 8.0PBS缓冲液重悬，重悬后的菌液于300W、工作2s、间隔8s，冰浴条件下超声破碎50min。破碎液于4℃、8000rpm离心10min，所获包涵体沉淀用等体积6mol/l尿素重悬，冰浴10h。4℃、8000rpm离心10min，保留上清。取包涵体复溶后的上清分别于透析液1、透析液2、透析液3中冰浴梯度透析6h(透析液含10mmol/l Tris-HCl pH 8.0，1mmol/l EDTA，150mmol/l NaCl，10％甘油)。透析液1尿素浓度为4mol/l，透析液2尿素浓度为2mol/l，透析液3尿素浓度为1mol/l。透析结束，将样品于4℃、8000rpm条件下离心10min，保留上清，即复性得到可溶性的融合蛋白Elps-SUMO-A3。
(5)重组蛋白Elps-SUMO-A3及重组多肽A3的分离纯化 
利用标签纯化及标签去除技术获取重组活性肽；透析后，经重新折叠后的重组蛋白溶液中还含有少量的杂蛋白，需进行纯化。上述制备的重组蛋白由于含有Elps标签，因此可用加盐离心纯化。取透析所得蛋白溶液，加入终浓度为1.0、1.5和2.0mol/L的NaCl混合均匀后于30℃条件下水浴10min，常温离心10min，收集沉淀，向沉淀中加入1mL 4℃预冷的pH 8.0PBS缓冲液重悬，冰浴1h后于离心取上清进行电泳分析。结果如图5所示，图中浓度分别为1.0、1.5、2.0mo/L NaCl沉淀后，复溶于pH 8.0PBS的融合蛋白电泳图。比较图中目标蛋白条带，目标蛋白Elps-SUMO-A3在氯化钠诱导作用下形成的沉淀中杂质减少。由于盐浓度在一定范围内会导致蛋白质的溶解或沉淀，因此不同浓度氯化钠对溶液中杂蛋白的影响程度不同。比较图中结果，采用1.5mol/L NaCl对溶液进行纯化，所获得的沉淀中纯度最高。因此选用1.5mol/L的氯化钠对复性后的重组蛋白Elps-SUMO-A3进行纯化。对于可溶表达的如序列表SEQ ID NO：1所示的目标蛋白直接进行标签技术纯化，而对包涵体表达的目标蛋白先进行变性与复性再进行标签技术纯化，向加盐离心沉淀中加入等体积预冷的4℃的pH 8.0PBS缓冲液重悬，冰浴6h后离心，上清液即是纯化所得蛋白溶液，经过两次离心循环即可获得纯度95％以上的目标蛋白。；通过Elps标签纯化技术纯化融合蛋白以及采用SUMO蛋白酶裂解及加盐离心去除二联体融合标签Elps-SUMO，获得重组多肽A3，其纯化示意图见图6。
(6)采用胃蛋白酶和/或胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶酶解制得活性肽
采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解重组降血压肽和抗氧化肽，超滤得小肽混合体，再脱盐去杂，冷冻干燥样品，质检制得降血压肽和抗氧化肽。
本发明所述的重组降血压肽和抗氧化肽在制备治疗高血压药中的应用。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：依据实施例1中步骤(1)和步骤(2)构建工程菌pET28a-ESA3/E.coli BL21(DE3)。
在步骤(1)中，将菌株单菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培养基中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm摇床培养13h。
在步骤(3)中，摇瓶将大肠杆菌菌种培养至菌体OD值达到0.7，添加IPTG至终浓度为0.06mM，温度为20℃诱导培养时间为20h后，取样SDS-PAGE分析，制得大肠杆菌菌剂。
如图7得知，工程菌在低温低诱导剂浓度条件下诱导培养20h后，相对诱导前样，有一分子量约45kDa的蛋白条带出现；超声破碎细胞后，目标蛋白的可溶性表达水平达到60％以上。取超声破碎上清，加入终浓度为1.5mol/l的NaCl混合均匀后于30℃条件下水浴10min，常温离心，保留沉淀。向沉淀中加入等体积预冷的4℃pH 8.0PBS缓冲液重悬，冰浴6h后离心，上清液即是纯化所得蛋白溶液，经过两次离心循环即可获得纯度95％以上的目标蛋白。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：
在步骤(1)中，将菌株单菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培养基中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm摇床培养14h。
在步骤(3)中，摇瓶将大肠杆菌菌种培养至菌体OD值达到0.7，添加IPTG至终浓度为0.1mM，温度为30℃诱导培养时间为10h后，取样SDS-PAGE分析，制得大肠杆菌菌剂。
重组小肽混合物的制备及其活性鉴定。取适量制备所得的Elps-SUMO-A3，按照3％的添加量加入SUMO蛋白酶，30℃酶解5h。酶解结束后，向酶解液中加入终浓度1.5mol/l的氯化钠，30℃水浴10min后，8000r/min离心10min，保留上清液，即为重组活性肽。体外模拟人体自然生理消化过程，将2mg/ml的重组活性肽溶液用盐酸调节pH至2.0，加入2％胃蛋白酶，37℃下水解4h，沸水浴终止反应，调pH至7.0，取部分水解液测定肽活性。在剩余的水解液中加入2％的胰酶(或胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物)，37℃水解4h，沸水浴终止反应。胃蛋白酶水解液(H1)；胰酶水解液(H2)；复合酶水解液(H3)。经体外ACE抑制活性及抗氧化活性检测，结果显示多聚体重组活性肽的胃肠消化酶水解液H1、H2和H3均显示出了极强的ACE抑制活性和抗氧化活性，其中，水解液H2的ACE抑制IC50在1.0μg/ml以下，SHR动物实验也证实重组活性肽的胃肠酶水解液H1、H2和H3均具有显著的降压效应，其中H3在0.5mg/kg灌胃剂量下灌胃4h后，降压幅度能达到45mmHg。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。