基于异羟肟酸的胶原酶抑制剂 本发明涉及可溶性人CD23的抑制剂形成的新的及其在治疗与过量可溶性CD23(s-CD23)生成有关的诸如自身免疫疾病及过敏症病症中的用途。
CD23(低亲核力IgE受体FceRⅡ,Blast2)为表达在成熟细胞变种表面的45kDaⅡ型整合蛋白，所述细胞包括B及T淋巴细胞、巨嗜细胞、自然杀伤细胞、朗格罕氏细胞、单核细胞及血小板(Delespesse等，Adv Immunol,49[1991]149-191)。在嗜酸性细胞上也存在CD23样分子(Grangette等，J Immunol,143[1989]3580-3588)。CD23也与免疫反应的调节作用有关(Delespesse等，Immunol Rev,125[1992]77-79)。人CD23以两种不同调节的异构形式-a及b存在，其区别仅在细胞内的N末端氨基酸上(Yokota等Cell,55[198]6 11-618)。在人中组成a异构体仅在B-淋巴细胞上发现，而由IL 4诱导的b型物在所有能够表达CD23的细胞中都有发现。
已知完整的细胞结合CD23(i-CD23)经过由细胞表面的裂解导致形成许多定义明确的可溶性碎片(s-CD23)，这些碎片是由复杂的系列蛋白水解作用产生的，其机制尚不清楚(Bourget等J BiolChem,269[1994]6927-6930)。尽管尚未证实，但可以推测全部保留与i-CD23所共有的C末端植物凝血素结构域的这些蛋白水解的主要可溶性碎片(Mr37、33、29及25KDa)顺序经37kDa碎片的初始形成而产生(Letellier等J Exp Med,172[1990]693-700)。另一种细胞内分裂的方式产生在C末端区域不同于i-CD23地稳定的16kDa碎片(Grenier-Brosette等Eur J Immu nol,22[1992]1573-1577)。
数种活性归于人的膜结合iCD23，已显示它们在IgE调节中起作用。具体活性包括：a)抗原呈现，b)IgE介导的嗜酸性细胞的细胞毒性，c)B细胞回到淋巴结和脾脏的产生中心d)IgE合成的向下调节(downregulation)(Delespesse等，Adv Immunol,49,[1991]149-191)。三个较大分子量可溶性CD23碎片(Mr37、33及29kDa)具有多功能细胞因子性质(似乎在IgE产生中起主要作用)。因此，s-CD23的过量生成与IgE的过量生成有关，是过敏性疾病例如外因性哮喘、鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、特应性皮炎及过敏症的证明(Sutton和Gould,Nature,366,[1993]421-428)。
其它源于s-CD23的生物活性包括B细胞生长的刺激及单核细胞介质释放的诱导。这样，已观察到在患B慢性淋巴细胞白血病的患者(Sarfati等Blood,71[1988]94-98)及在患风湿性关节炎的患者(Chomarat等，Arthritis and Rheumatism,36 1993]234-242)的血清中s-CD23浓度的升高。许多文献建议CD23在炎症中起作用。首先，已有报道sCD23结合于细胞外受体，所述受体当激活时与细胞介导的炎症反应有关。因而有报道sCD23直接激活单核细胞TNF、IL-1及IL-6释放(Armant等，第108卷，J.Exp.Med105-1011(1994))。据报道CD23与B2-整联蛋白粘附分子、CD11b及CD11c在单核细胞/巨噬细胞上相互作用(S.Lecoanet-Henchoz等，Immunity,3卷；119-125(1995))，引发NO2，过氧化氢及细胞因子(IL-1、IL-6及TNF)释放。最后，IL-4或IFN诱导CD23的表达以及作为sCD23由人单核细胞释放。膜结合sCD23受体与IgE/抗IgE免疫复合物或抗CD23 mAb的连接激活cAMP和IL-6生成及血栓烷B2生成，证明在炎症中CD23的受体介导的作用。
由于CD23的这些多种性质，抑制s-CD23生成的化合物就应该具有双重作用：a)通过保持i-CD23在B细胞表面的浓度增强IgE合成的负反馈抑制，及b)抑制s-CD23的大分子量可溶性碎片(Mr 37、33及29kDa)的免疫刺激细胞因子活性。此外，CD23裂解的抑制可以减弱sCD23诱导的单核细胞的活性及介质的生成，进而减轻炎症反应。
国际专利申请号PCT/EP95/02693(Smithkline Beechanm plc)公开抑制基质金属蛋白酶(例如胶原酶、stromelysin及明胶酶)作用的化合物是转染进入哺乳类细胞培养体系的人可溶性CD23释放的有效抑制剂。已知的基质金属蛋白酶抑制剂包括列于表中的专利申请描述的化合物。
表专利申请公开的化合物特定化合物及制备方法实施例号US-A-4,595,700如权利要求(1)定义的式(Ⅰ)化合物，任选进一步在本说明书中辅助定义。 1至8.US-A-4,599,361 1至7.GB-A-2 268 934 1至10.GB-A-2 272 441 1至5.EP-A-0 231 081 1至8.EP-A-0 236 872 1至28.EP-A-0 262 053 1至15.EP-A-0 273 689 1至38.EP-A-0 276 436 1至44.EP-A-0 274 453 1至8.EP-A-0 320 118 1至5.EP-A-0 489 577 1至25.EP-A-0 489 579 1至4.EP-A-0 497 192 1至80.EP-A-0 498 665 1至27.EP-A-0 520 573 1至34.EP-A-0 574 758 1至43.EP-A-0 575 844 1至27.EP-A-0 606 046 1至32.EP-A-0 613 883 1至7.EP-A-0 621 270 1至40.WO 90/05716 1至38.WO 90/05719 1至26.WO 91/02716 1至17.WO 92/09563如权利要求(1)或(2)定义的化合物式(1)或(2) 1至21.
表续专利申请公开的化合物特定化合物及制备方法实施例号WO 92/13831如权利要求(1)定义的式(Ⅰ)化合物，任选进一步在本说明书中辅助定义。 1至27.WO 92/21360 1至5.WO 92/22523 Ⅰ至Ⅹ.WO 93/14096 1至8.WO 93/20047 1至14.WO 93/24475 1至6.WO 93/24449 1至8.WO 94/00119 1至86.WO 94/07481 1至15.WO 94/12169 1至24.WO 94/21625 1至7.WO 94/21612 1至116.WO 94/24140 1至5.WO 94/25434 1至7.WO 94/25435实施例1WO 95/04033实施例1至7WO 95/04715全部实施例WO 95/12603全部实施例按照本发明提供式(Ⅰ)化合物：其中R和R3分别独立为氢、烷基、链烯基、炔基或芳基；R1为芳甲基；及R2为烷基、链烯基、芳基、环烷基或环烯基。
烷基、链烯基及炔基在此是指包括含有多至6个碳原子的直链和支链基团并任选由一个或多个选自芳基、杂环基、(C1-6)烷硫基、(C1-6)链烯硫基、(C1-6)炔基硫基、芳硫基、杂环硫基、(C1-6)烷氧基、芳基(C1-6)烷氧基、芳基(C1-6)烷硫基、氨基、单或双(C1-6)烷氨基、环烷基、环烯基、羧基和其酯、羟基及卤素的基团取代。
环烷基及环烯基在此是指包括具有3-8元环碳原子的基团及任选由上述对于烷基、链烯基及炔基的基团取代。
用于此处的术语“芳基”包括苯基和萘基如2-萘基。包括苯基和萘基的合适的芳基基团可任选由多至5个，优选多至3个取代基取代。合适的取代基包括卤素、(C1-6)烷基、芳基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基、(C1-6)烷氧基(C1-6)烷基、卤代(C1-6)烷基、羟基、硝基、氨基、单和双-N-(C1-6)烷基氨基、酰胺基、酰氧基、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨甲酰基、单和双-N-(C1-6)烷基氨甲酰基、(C1-6)烷氧羰基、芳氧羰基、脲基、胍基、磺酰胺基、氨基磺酰基、(C1-6)烷硫基、(C1-6)烷基亚磺酰基、(C1-6)烷基磺酰基、杂环基及杂环基(C1-6)烷基。此外两个相邻环碳原子可由(C3-5)亚烷基链连接形成碳环。
用于此处的术语“杂环基”和“杂环的”除另有说明外，适于包括芳香的和非芳香的、单环的和稠合的，所述环适于含有多至四个选自氧、氮及硫的杂原子，及每个环可以未取代或由例如多至三个取代基取代。每个杂环的环适于具有4-7个，优选5或6环原子。稠合的杂环的环系可以包括碳环的环及需要包括仅一个杂环的环。
优选杂环基团的取代基选自卤素、(C1-6)烷基、芳基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基、(C1-6)烷氧基(C1-6)烷基、卤代(C1-6)烷基、羟基、氨基、单和双-N-(C1-6)烷基氨基、酰胺基、羧酸盐、羧酸酯、氨甲酰基、单和双-N-(C1-6)烷基羰基、芳氧羰基、(C1-6)烷氧羰基(C1-6)烷基、芳基、氧基团、脲基、胍基、磺酰胺基、氨基磺酰基、(C1-6)烷硫基、(C1-6)烷基亚磺酰基、(C1-6)烷基磺酰基、杂环基及杂环基(C1-6)烷基。
在本发明的特别的方面，R为氢或甲基，任选由芳硫基或杂环基硫取代；和/或R1为苄基团；和/或R2为苄基团；和/或R3为氢、甲基或苄基。
按照另外的方面，本发明提供式(Ⅰ)化合物在生产治疗或预防包含s-CD23过量生成的病症例如过敏、炎症失调及自身免疫疾病的药品中的用途。
本发明的另一个方面提供治疗或预防包含s-CD23过量生成的病症例如过敏、炎症失调及自身免疫疾病的方法，该方法包括给需要的人或非人的哺乳动物以式(Ⅰ)化合物。
本发明也提供治疗或预防包含s-CD23过量生成的病症例如过敏、炎症失调及自身免疫疾病的的药用组合物，该组合物包括式(Ⅰ)化合物及任选的药学上可接受的载体。
具体的炎性疾病包括CNS紊乱例如阿尔茨海默氏病、多发性硬化症及多发性梗塞痴呆，以及炎症介导的中风和脑外伤的后遗症。
应该理解式(Ⅰ)化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物及其药学上可接受的衍生物也包括在本发明中。
式(Ⅰ)化合物的盐包括例如衍生自无机或有机酸例如氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、对-甲苯磺酸、磷酸、硫酸、乙酸、三氟甲酸、丙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、丙二酸、琥珀酸、乳酸、草酸、酒石酸及苯甲酸的酸加成盐。
盐也可用碱生成。此类盐包括由无机或有机碱衍生的盐，例如碱金属盐如钠或钾盐，及有机胺盐例如吗啉、哌啶、二甲胺或二乙胺盐。
令人惊奇地发现本发明化合物为强效及选择性的CD23作用抑制剂，同时与上述先有技术的化合物比较显示减低的胶原酶抑制活性。
本发明化合物可以用任何适当的常规方法制备，例如使用类似于下述专利介绍的方法：WO 90/05716、WO 93/24475、WO94/21625、WO 95/19956、WO 90/05719、WO 91/02716、WO92/13831、WO 93/20047、EP-A-0214639、EP-A-0236872、EP-A-0274453、EP-A-0489577、EP-A-0489579、EP-A-0497192、EP-A-0574758及USP 4599361。
按照本发明的另一个方面提供制备如上定义的式(Ⅰ)化合物的方法，该方法包括：
(a)式(Ⅱ)化合物脱保护：其中R-R3如上定义，及X为如苄基或三甲基硅烷基的保护基，或
(b)式(Ⅲ)化合物：其中R-R3定义如上，与羟胺或其盐反应或
(c)式(Ⅳ)化合物：其中R1-R3定义如上，与硫醇反应得到式(Ⅰ)化合物，其中R为由烷硫基、芳硫基、芳烷硫基或杂环基硫基取代的甲基，或
(d)将式(Ⅰ)化合物转变成如上定义的式(Ⅰ)的不同的化合物。
式(Ⅱ)、(Ⅲ)及(Ⅳ)化合物为新的并且形成本发明的另一个方面。
式(Ⅱ)化合物可通过式(Ⅲ)化合物与保护的羟胺反应制得。式(Ⅲ)化合物可通过式(Ⅴ)化合物：其中R-R3如上定义，及Y为如t-丁基的保护基的水解制得。
合适的异羟肟酸保护基在本领域是熟知的，包括苄基、三甲基硅烷基、t-丁基及t-丁基二甲基硅烷基。
合适的羧酸保护基在本领域是熟知的并包括t-丁基、苄基及甲基。
式(Ⅴ)化合物可通过式(Ⅵ)化合物：其中，R1-R3及Y如上定义，及Z为使ZCH2-是R的基团的还原制备。
式(Ⅴ)化合物也可通过式(Ⅶ)化合物：其中R、R1及Y定义如上，与式(Ⅷ)化合物或其活化的衍生物：其中R2和R3定义如上，反应制得。
式(Ⅲ)化合物也可由式(Ⅸ)化合物：其中R1-R3定义如上，与硫醇反应得到式(Ⅲ)化合物，其中R为由烷硫基、芳硫基、芳烷硫基或杂环基硫基取代的甲基而制备。
式(Ⅸ)化合物也可由式(Ⅹ)化合物：其中R1-R3及Y的定义如上的水解制得。
式(Ⅹ)化合物也可通过式(Ⅺ)化合物：其中R1及Y定义如上，与如上定义的式(Ⅷ)化合物或其衍生物反应制得。
所述原料及其它试剂可由商业购得或可由熟知的及常规方法合成。
本发明化合物的异构体包括立体异构体可制成此类异构体的混合物或单独的异构体。所述单独的异构体可通过任一合适的方法制备，例如所述单独的立体异构体可由手性底物起始经立体专一的化学合成制备或通过使用已知方法经分离非对映异构体混合物制得。在优选的方面，本发明提供(ⅠA)化合物：
优选所述化合物以基本上纯的形式分离。
如在此所述的可溶性人CD23生成抑制剂具有有用的医疗性质。优选所述活性化合物以药学上可接受的组合物给药。
所述组合物优选口服给药。然而也可采用其它给药方式，例如以喷雾剂、气雾剂形式或其它常规吸入方法治疗呼吸道疾病；或对患有心力衰竭的患者胃肠道外给药。其它替代给药形式包括舌下给药或透皮给药。
所述组合物可为片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、锭剂、栓剂、可复制粉末剂，或液体制剂，例如口服或无菌胃肠道外溶液或混悬液的形式。
为了得到一致的给药优选本发明组合物为单位剂量形式。
口服给药的单位剂量制剂形式可为片剂及胶囊剂并可含有常规辅助剂诸如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、西黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘油；制片润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙酸淀粉钠或微晶纤维素；或药学上可接受的润湿剂如十二烷硫酸钠。
所述固体组合物可通过混合、填充或制片的常规方法制得。重复混合操作可用于将活性试剂分散于应用大量填充剂的那些组合物中。此种操作在本领域理所当然是常规的。所述片剂可按照在常规药学实践中熟知的方法包衣，特别是包肠溶衣。
口服液体制剂可以为例如乳剂、糖浆剂或酏剂形式，或可作为在使用前用水或其它合适溶媒复制的干化合物提供。此种液体制剂可含有常规添加剂诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水溶媒(可包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、油酯诸如甘油酯、丙二醇或乙二醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸；如果需要，也可含有常规调味剂或着色剂。
对于胃肠道外给药，液体单位剂量形式通过应用所述化合物和无菌溶媒制得，并且取决于所用浓度可以或者为悬浮的或者溶于溶媒中。制备注射溶液时所述化合物可溶于注射用水并在装入合适的小瓶或安瓿内并密封前过滤灭菌。更有利的是可将辅助剂诸如局部麻醉剂、防腐剂及缓冲剂溶于所述溶媒中。为了增强稳定性，所述组合物在加入所述小瓶后冷冻并真空除去水。胃肠道外悬浮剂除所述化合物悬浮于溶媒中而不是溶于其中，并且灭菌不能通过过滤完成外基本按相同的方式制备。所述化合物在悬浮于无菌溶媒中之前可暴露于环氧乙烷中灭菌。更有利的是，表面活性剂或润湿剂包括在所述组合物中以使所述化合物易于均匀分布。
本发明化合物也适于作为呼吸道给药的鼻吸剂或气雾剂或作为喷雾器的溶液，或作为吸入法的微细粉剂，单独或与惰性载体如乳糖结合提供。在此种情况下，活性化合物的颗粒适于具有直径小于50微米，优选小于10微米例如直径在1-50微米、1-10微米或1-5微米的范围内。如果适当，可以包括少量其它抗哮喘剂及支气管扩张剂，例如拟交感胺诸如异丙肾上腺素、新异丙肾上腺素、羟甲叔丁肾上腺素、苯肾上腺素及麻黄碱；黄嘌呤衍生物如茶碱和氨茶碱以及皮质类固醇如氢化泼尼松及肾上腺兴奋剂如ACTH。
根据给药的方法所述组合物可含有0.1％-99％(重量)，优选10-60％(重量)的活性物质。优选吸入给药的范围为10-99％，特别优选60-99％，例如90、95或99％。
微细粉末制剂可按计量剂量或借助合适的吸入活化装置以气雾剂给药。
合适的计量剂量气雾剂制剂包含常规抛射剂、助溶剂如乙醇，表面活性剂如油醇，润滑剂如油醇，干燥剂如硫酸钙及密度调节剂如氯化钠。
合适的喷雾器溶液是等渗灭菌溶液，任选缓冲的例如在pH4-7之间含有多至20mg/ml化合物(但更通常含0.1-10mg/ml)，用于标准喷雾设备使用。
有效量取决于本发明化合物相对效力、治疗疾病的严重程度及患者的体重。适当的本发明组合物的单位剂量可包括0.1-1000mg本发明化合物(经吸入为0.001-10mg)及更通常含1-500mg，例如1-25或5-500mg。此种组合物可按对70kg的成人每天1mg-1g及特别是5-500mg的剂量每天给药1-6次，更通常为每天2-4次。即在约1.4×10-2mg/kg/天-14mg/kg/天的范围内及特别是在7×10-2mg/kg/天-7mg/kg/天的范围内。
下述实施例说明本发明但不以任何形式限制它。生物试验方法方法1：使用下述方法研究受试化合物抑制可溶性CD23释放的能力。RPMI 8866细胞膜CD23裂解活性分析：
表达高浓度CD23的人Epstein-Barr病毒转化的B细胞系，RPMI8866细胞的质膜(Sarfati等，Immunology 60[1987]539-547)用水溶液萃取方法纯化。在匀浆缓冲液(20mM HEPES pH7.4,150mMNaCl,1.5mM MgCl2,1mM DDT)中重新悬浮的细胞经Parr高压罐中的N2空化打碎，并且与其它膜混合的质膜部分由在10000Xg下离心回收。将轻的沉淀悬浮于0.2M磷酸钾(pH7.2，每1-3g湿细胞使用2ml)并弃掉核沉淀。膜经分配于Dextran500(6.4％w/w)与聚乙二醇(PEG)5000(6.4％w/w)(ref)之间进一步分离(在0.25M蔗糖中，每10-15mg膜蛋白16g的量)[Morre and Morre,Bio Techniques 7,946-957(1989)]。相经简单离心(1000Xg)分离并收集PEG(上部)相，用20mM磷酸钾缓冲剂(pH7.4)稀释3-5倍，并在100000Xg下离心回收该相中的膜。将沉淀悬浮于磷酸缓冲盐水中并构成富集3-4倍的质膜以及其它细胞膜(例如，溶酶体，Golgi)。将所得膜等分并储存于-80℃。在6.6％Dextran/PEG部分得到富集10倍的质膜。
分离的膜于37℃孵育达4小时产生CD23碎片，该碎片由所述膜在用得自P30994的5uM制备1淬灭该分析后经0.2微米Durapore过滤板(Millipore)过滤分得。由所述膜释放的sCD23用得自The BindingSite的EIA kit(Birmingham,UK)测定或类似应用MHM6抗CD23mAb[Rowe等，Int.J.Cancer,29,373-382(1982)]或另一个抗CD23 mAb作为在EIA夹层中的捕获抗体。在总体积50ul磷酸缓冲盐水中的0.5ug膜蛋白制得的可溶性CD23的量由EIA测得，并且与在各种浓度抑制剂存在下所得的量比较。抑制剂是在水溶液或二甲基亚砜(DMSO)中制备，并且最终DMSO的浓度不超过2％。通过由相对于不加抑制剂的对照孵育的sCD23的差别观察到的sCD23生成的50％抑制的浓度曲线测定IC50值。方法2：使用下述方法研究受试化合物抑制胶原酶的能力。胶原酶抑制分析：
作为胶原酶抑制剂化合物的效力由Cawston和Barrent方法测定(Anal.Biochem.99,340-345,1979，结合在此作为参考)，该方法包括试验抑制剂的1mM溶液或其稀释液与经滑液成纤维细胞克隆的由E.Coli.表达并纯化的胶原和人重组胶原酶(用150mMTris缓冲，pH7.6，含有15mM氯化钙、0.05％Brij35、200mM氯化钠及0.02％叠氮钠)于37℃孵育18小时。所述胶原为经Cawston和Murphy方法(在Enzymology 80,711,1981中的方法)制备的酰化的3H 1型牛胶原。所述样品离心沉淀出未消化胶原，并分出等份放射活性上清液在闪烁计数仪上进行水解的测定。将所述胶原酶在1mM抑制剂或其稀释液存在下的活性与无抑制剂对照的活性比较，并将所得结果以对50％胶原酶有效的浓度(IC50)给出。实施例1N-(2-(R)-苄基-4-羟胺基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺a)2-亚苄基-4-叔丁氧基琥珀酸
将2-亚苄基-4-叔丁氧基琥珀酸甲酯(2g,7.25mmol)的甲醇(20ml)的溶液用氢氧化钠溶液(2M,7.25ml,14.5mmol)处理，并将该混合物于20℃搅拌16小时。真空浓缩所述反应液并加入水(20ml)。含水溶液用乙醚萃取(2×20ml)，用2M盐酸酸化并用乙醚再萃取(3×25ml)。干燥(MgSO4)该酸化萃取物的醚层，过滤并蒸发得到白色固体酸(1.74g,92％)。mp110-115℃。dH(CDCl3)1.46(9H,s),3.47(2H,s),7.38(5H,m),7.94(1H,s),12.58,brs).b)N-(2-亚苄基-4-叔丁氧基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺于0℃将2-亚苄基-4-叔丁氧基琥珀酸(524mg,2mmol)、(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺盐酸盐(580mg,2mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(486mg,3.6mmol)及二异丙基乙胺(0.35ml,2mmol)的DMF(20ml)的溶液用1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(424mg,2.2mmol)处理，并将该反应物于0℃搅拌1小时并于20℃搅拌16小时。蒸发后，残留物在饱和碳酸氢钠(25ml)和二氯甲烷(50ml)中分配。有机层先后用饱和碳酸氢钠(2×25ml)、10％柠檬酸(2×25ml)及盐水(25ml)洗涤并干燥(MgSO4)。过滤并浓缩得到残留物，经硅胶层析(氯仿-甲醇100∶1)得到灰白色泡沫状标题化合物(850mg,85％)。dH(CDCl3)1.40 9H,s),3.25(2H,m),3.32(1H,d,J=16.5Hz),3.50(1H,d,J=16.5Hz),4.40(2H,m),4.80(1H,dd,J=6.9,7.2Hz),6.75(2H,m),7.26(16H,m).c)N-(2-(R/S)-苄基-4-叔丁氧基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺
将N-(2-亚苄基-4-叔丁氧基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺(790mg,1.58mmol)的乙醇(50ml)的溶液于大气压下氢化4.5小时。过滤所述反应物，减压蒸发并将残留物经硅胶层析(氯仿-甲醇100∶1)得到白色固体及非对映异构体的1∶1的混合物的所需物质(660mg,83％)mp95-100℃。dH(CDCl3)1.25+1.41(9H,2xs),2.3-3.5(7H,m),4.05-4.70(2H,m), 4.60-4.80(1H,m),5.33-6.02(2H,m),6.7-7.4(15H).d)N-(2-(R/S)-苄基-4-羟基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺
将N-(2-(R/S)-苄基-4-叔丁氧基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺(650mg,1.3mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液用三氟乙酸(15ml)处理，并于20℃搅拌4小时。将该反应物蒸发并用甲苯共蒸发。用乙醚研磨残留物得到白色固体及非对映异构体的1∶1的混合物的酸(470mg,81％)mp172-5℃。dH[(CD3)2SO]2.01-3.03(7H,m),[4.22(d,J=5.8Hz)+4.27(d,J=5.4Hz),total 2H],4.53(1H,m),7.02-7.31(15H,m),[8.18(t,J=5.8Hz)+8.27(t,J=5.9Hz,total 1H],[8.22(d,J=8.3Hz)+8.35(d,J=8.5Hz),total 1H],12.1(1H,brs,CO2H).e)N-(2-(R)-苄基-4-羟胺基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺
将为1∶1的非对映异构体N-(2-(R/S)-苄基-4-叔丁氧基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺(250mg,0.56mmol)、二异丙基乙胺(0.2ml,1.12mmol)及O-三甲基硅烷基羟胺(300mg,2.8mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液冷至0℃，并于氩气下用溴代-三吡咯烷(pyrrolidino)磷鎓六氟磷酸盐(PyBroP)(160mg,0.67mmol)处理。将该反应物于0℃搅拌1小时并于20℃搅拌16小时。将有机层用盐水洗涤(2×10ml)，干燥(MgSO4)并蒸发成粘稠固体。该残留物用VYDAC蛋白及多肽C18反相柱经制备性HPLC层析，用0.1％TFA的H2O∶70％乙腈的0.1％TFA-H2O的1∶1混合液，以20ml/min的流速洗脱。首先洗脱的非对映异构体(9.7min)证明为N-(2-(R)-苄基-4-羟胺基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺(50mg,19％)mp195-7℃。dH[(CD3)2SO]1.88(1H,dd,J=6.9,14.9Hz),2.09(1H,dd,J=7.5,14.9Hz),2.72-3.05(5H,m),4.21(2H,m),4.47(1H,m),7.23(15H,m),8.18(2H,m),8.70(1H,brs),10.35(1H,brs).第二洗涤的非对映异构体(12.5min)证明为N-(2-(S)-苄基-4-羟胺基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-苄基酰胺(30mg,12％)mp203-5℃。dH[(CD3)2SO]1.92(1H,dd,J=6.1,15.1Hz),2.23(1H,dd,J=8.8,15.0Hz),2.35-2.75(3H,m),2.98(2H,m),4.27(2H,m),4.45(1H,m),7.21(15H,m),8.33(1H,d,J=8.5Hz),8.45(1H,m),8.71(1H,s),10.42(1H,s).实施例2N-(2-(R)-苄基-4-羟胺基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺a)4-(S)-苄基-3-(3-苯基丙酰基)-2-噁唑烷酮
于-65℃将n-BuLi(1.6M(在己烷中)101ml,178mmol)滴加至4-(S)-苄基-3-(3-苯基丙酰基)-2-噁唑烷酮(23.9g,135mmol)的四氢呋喃(250ml)溶液中。将所得的橙色溶液搅拌30分钟，然后滴加入3-苯基丙酰氯(25g,148mmol)的四氢呋喃(40ml)溶液。1.5小时后，将该反应物倒入冰冷却的2M盐酸(200ml)中，并用乙酸乙酯萃取(3×150ml)。合并的有机萃取物用2M盐酸(150ml)、碳酸氢钠溶液(150ml)及盐水(100ml)洗涤。干燥(MgSO4)及蒸发后，将残留物由乙醚中结晶得到白色针状标题化合物。mp109-111℃.dH(CDCl3)2.75(1H,dd,J=13.5,10Hz),2.96-3.07(2H,m)；3.17-3.38(3H,m),4.14(1H,s),4.16(1H,d,J=2),4.60-4.70(1H,m),7.15-7.35(10H,m).b)4-(S)-苄基-3-(2-叔丁氧基羰基甲基]3-苯基)丙酰基-2-噁唑烷酮
于-20℃将n-BuLi(1.6M(在己烷中)28.3ml,45mmol)滴加至1,1,1-3,3,3-六甲基二硅氮烷(9.6ml,45mmol)的四氢呋喃(60ml)溶液中。45分钟后将该溶液冷至-75℃，并滴加入4-(S)-苄基-3-(3-苯基丙酰基)-2-噁唑烷酮(10g,32mmol)的四氢呋喃(60ml)溶液。搅拌该溶液1小时，并接着用1小时温热至-50℃。冷至-75℃后滴加入溴代乙酸叔丁酯(7.8ml,48mmol)的四氢呋喃(60ml)溶液，并搅拌该溶液1小时然后用2.5小时温热至-20℃。将该反应液倒入饱和氯化铵溶液(100ml)中，并用乙醚萃取(3×10ml)。合并的有机萃取物用2M盐酸(50ml)、碳酸氢钠溶液(50ml)及盐水(50ml)洗涤。干燥(MgSO4)及蒸发后用乙醚/己烷(1∶4)研磨所得黄色油得到白色固体标题化合物(12.3g,90％)。
mp111.5-112.5℃.dH(CDCl3)1.4(9H,s),2.37(1H,dd,J=17,4Hz),2.64(1H,dd,J=13,9Hz),2.72(1H,dd,J=14,10Hz),2.85(1H,dd,J=17,11Hz),3.01(1H,dd,J=13.6Hz),3.31(1H,dd,J=13.5,3Hz),3.93(1H,t,J=6Hz),4.07(1H,dd,J=9,2.5Hz),4.44-4.57(2H,m),7.18-7.37(10H,m).c)2-(R)-苄基-4-叔丁氧基琥珀酸
于0℃用27.5％过氧化氢(9.65ml,78mmol)处理4-(S)-苄基-3-(2-叔丁氧基羰基甲基]-3-苯基)丙酰基-2-噁唑烷酮(5.5g,13mmol)在3∶1 THF/水(200ml)中的溶液，并于加入氢氧化锂(1.1g,26mmol)的水(100ml)溶液之前搅拌10分钟。于0℃搅拌该反应液30分钟，并通过加入1.5M亚硫酸钠(11g,87mmol)的水(58ml)溶液破坏过量的过氧化物。该溶液用碳酸氢钠缓冲至pH9并蒸发THF。残留物在水(300ml)和二氯甲烷(300ml)中分配，并用二氯甲烷(2×200ml)洗涤水层。该水层用1MHCl酸化并用乙酸乙酯萃取(3×200ml)。干燥有机层(MgSO4)，过滤并蒸发得到所需澄清油状物的酸(3.4g,100％)。dH(CDCl3)1.42(9H,s),2.35(1H,dd,J=4.7,16.8Hz),2.56(1H,dd,J=8.7,16.8Hz),2.77(1H,dd,J=10.4,15.4Hz),3.09(2H,m),7.17-7.34(5H,m)，酸质子未见到。d)2-(R)-苄基-4-叔丁氧基琥珀酰基-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺
将2-(R)-苄基-4-叔丁氧基琥珀酸(1g,3.78mmol)、(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺盐酸盐(812mg,3.78mmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.66ml,3.78mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(919mg,6.8mmol)及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(797mg,4.16mmol)的DMF溶液如实施例1b)处理，经由乙酸乙酯-己烷重结晶得到白色固体标题化合物(1.15g,72％)。dH(CDCl3)1.43(9H,s),2.38(1H,dd,J=4.4,16.8Hz),2.57(3H,d,J=4.7Hz),2.53-2.99(5H,m)3.15(1H,dd,J=5.8,13.8Hz),4.54(1H,m),5.33(1H,br m),5.90(1H,br d,J=8Hz),7.12-7.31(10H,m).e)N-(2-(R)-苄基-4-羟基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺将2-(R)-苄基-4-叔丁氧基琥珀酰基-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺(1.02g,2.41mmol)及TFA(10ml)的二氯甲烷(10ml)溶液按照实施例1d)处理得到白色固体的所需酸(830mg,94％)。dH[(CD3)2SO]2.03(1H,dd,J=5.5,16.5Hz),2.33(1H,dd,J=8.4,16.6Hz),2.50(3H,d,J=4.6Hz),2.56(1H,m),2.75-2.99(4H,m),4.39(1H,m),7.14-7.27(10H,m),7.47(1H,m),8.17(1H,d,J=8.2Hz),12.07(1H,brs).f)N-(2-(R)-苄基-4-羟胺基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺
将N-(2-(R)-苄基-4-羟基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺(0.8g,2.17mmol)的THF(50ml)溶液冷至-20℃，并用N-甲基吗啉(0.29ml,2.61mmol)和氯代甲酸异丁酯(0.34ml,2.61mmol)处理并将该反应液于-20℃搅拌1小时。滴加入O-TMS-羟胺(2.2ml,20.9mmol)，将该反应液温热至室温并搅拌16小时。然后，该反应液蒸发并分配于乙酸乙酯和10％柠檬酸中。有机层用盐水洗涤并干燥(MgSO4)。过滤并蒸发得到固体，该固体由乙酸乙酯-甲醇重结晶得到白色固体标题化合物(300mg,36％)mp188-190℃。dH[(CD3)2SO]1.91(1H,dd,J=7.2,15.0Hz),2.06(1H,dd,J=7.2,15.0Hz),2.50(4H,m),2.75(2H,m),2.95(2H,m),4.31(1H,m),7.06-7.27(10H,m),7.38(1H,m),8.11(1H,d,J=8.2Hz),8.73(1H,s),10.4(1H,s).实施例3N-(2-(R)-苄基-4-羟胺基-3-(S)-[2-噻吩硫代甲基]琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸酰胺a)3-(R)-苯基乳酸苄酯
将3-(R)-苯基乳酸(20.381g,123mmol)的THF溶液用三乙胺(23.5ml,17.02g,168.5mmol)和溴代苄(16.2ml,23.18g,135.3mmol)处理，并将混合物回流下搅拌1小时。冷却后过滤除去沉淀并蒸发滤液。残留物溶于乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠、1M HCl、盐水洗涤，并干燥(MgSO4)。过滤并蒸发得到黄色油状标题化合物(24.086g,76％)。dH[(CD3)2SO]2.84(1H,dd,J=7.97,13.75Hz),2.97(1H,dd.J=5.5,13.75Hz),4.26-4.34(1H,m),5.09(2H,s),5.62(1H,d,J=6.32Hz),7.16-7.43(10H,m)b)2-(R)-苄基-3-叔丁氧基羰基琥珀酸二苄酯
于0℃将氢化钠(60％悬浮于矿物油中，3.37g,84.3mmol)加至苄基丙二酸叔丁酯(21.1g,84.4mmol)的DMF(165ml)溶液中。将该溶液于氩气下温热至室温并搅拌1小时。
于0℃将三氟甲磺酸酐(21.85ml,36.6g,130.2mmol)一次性加至3-(R)-苯基乳酸苄酯(24g,93.75mmol)和吡啶(7.09ml,86.8mmol)的二氯甲烷(220ml)的溶液中。该溶液于氩气下搅拌1小时。该混合物用冰冷却水、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并过滤。
于0℃将所得滤液加至丙二酸酯的DMF溶液中，并将该溶液温热至室温及搅拌16小时。蒸发后，残留物溶于乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠溶液、1M HCl、盐水洗涤并干燥(MgSO4)。过滤并蒸发得到残留物，该残留物经硅胶层析(5％乙酸乙酯-己烷)得到油状标题化合物(24.67g,60％)。dH(CDCl3)1.35(9H,d,J=11.55Hz)2.84-3.02(2H,m),3.38-3.48(1H,m),3.68(1H,dd,J=3.7,9.5Hz),4.86-5.19(4H,m),7.03-7.37(15H,m)c)2-(R)-苄基-4-叔丁氧基-3-乙烯基琥珀酸
用10％Pd/C处理2-(R)-苄基-3-叔丁氧基羰基琥珀酸二苄酯(14.64g,30mmol)的异丙醇(90ml)溶液并于常压氢化。过滤所述反应物并用哌啶(8.91ml,90mmol)和甲醛(37％,36.63ml,450mmol)处理滤液，于室温搅拌过夜。蒸发后将残留物溶于乙酸乙酯中，用1M HCl、盐水洗涤并干燥(MgSO4)。过滤并蒸发得到无色油状标题化合物(7.17g,87％)。dH(CDCl3)1.48(9H,s),2.96(1H,dd,J=8.25,14.02Hz),3.26(1H,dd,J=7.98,14.02Hz),3.75(1H,t,J=7.98Hz),5.55(1H,s),6.23(1H,s),7.14-7.30(5H,m)，酸质子未见到。d)N-(2-(R)-苄基-4-叔丁氧基-3-乙烯基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸酰胺
于0℃用1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5.35g,27.96mmol)处理2-(R)-苄基-4-叔丁氧基-3-乙烯基琥珀酸(7.083g,25.63mmol)、(S)-苯丙氨酸酰胺(4.68g,23.3mmol)、二异丙基乙胺(3.97ml,23.3mmol)及1-羟基苯并三唑水合物(7.16g,46.4mmol)的DMF(80ml)的溶液，并于0℃将该反应物搅拌1小时，于室温搅拌16小时。蒸发后，将残留物溶于二氯甲烷中，用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠洗涤并干燥(MgSO4)。过滤并蒸发得到残留物，将残留物经硅胶层析(己烷-乙酸乙酯7∶3至3∶7梯度洗脱)得到白色固体标题化合物(5.83g,60％)。dH[(CD3)2SO]1.39(9H,s),2.68-2.79(2H,m),2.92-3.05(2H,m),3.72(1H,t,J=7.42Hz),4.38-4.47(1H,m),5.44(1H,s),5.94(1H,s),7.03-7.25(12H,m),7.90(1H,d,J=8.25Hz).e)N-(2-(R)-苄基-4-羟基-3-乙烯基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸酰胺
用三氟乙酸(50ml)处理N-(2-(R)-苄基-4-叔丁氧基-3-乙烯基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸酰胺(2.11g,5mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液，于室温搅拌3小时。蒸发该反应物并用甲苯共蒸发。残留物用乙醚研磨得到白色固体标题化合物(1.59g,87％)。dH[(CD3)2SO]2.70-2.78(2H,m),2.92-3.05(2H,m),3.77(1H,t,J=7.42Hz),4.36-4.44(1H,m),5.48(1H,s),6.02(1H,s),7.04-7.24(12H,m),7.87(1H,d,J=8.53Hz),12.59(1H,br.s).f)N-(2-(R)-苄基-4-羟基-3-(S)-[2-噻吩硫代甲基]琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸酰胺
于室温用2-巯基噻吩(5.07ml)处理N-(2-(R)-苄基-4-羟基-3-乙烯基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸酰胺(1.48g,3.9mmol)的甲醇(20ml)溶液，于氩气回流下加热18小时。蒸发该反应物并用甲苯共蒸发。残留物用乙醚研磨得到白色固体标题化合物(1.63g,86％)。dH[(CD3)2SO]1.95(1H,dd,J=3.03,12.92Hz),2.28-2.75(6H,m),2.98(1H,dd,J=4,13.5Hz),4.32-4.41(1H,m),6.32(1H,s),6.91-7.27(13H,m),7.60(1H,dd,J=1.37,5.22Hz),8.19(1H,d,J=8.53Hz),12.70(1H,br,s)g)N-(2-(R)-苄基-4-羟胺基-3-(S)-[2-噻吩硫代甲基]琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸酰胺
于氩气下，在-20℃用N-甲基吗啉(0.42ml,3.6mmol)和氯代甲酸异丁酯(0.48ml,489mg,3.6mmol)处理N-(2-(R)-苄基-4-羟基-3-(S)-[2-噻吩硫代甲基]琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸酰胺(1.445g,3mmol)的THF(25ml)和DMF(10ml)的溶液。于-20℃搅拌1小时后，通过滴加O-三甲基硅烷基羟胺(2.6ml,2.53g,21mmol)处理该溶液，于室温搅拌16小时。蒸发后，将残留物溶于乙酸乙酯，用10％柠檬酸、盐水洗涤并干燥(MgSO4)。过滤后，蒸发并用乙醚研磨，在乙酸乙酯中加热固体并过滤残留物(重复此操作数次后)得到白色固体标题化合物(25mg)。dH[(CD3)2SO]1.81(1H,dd,J=2.3,12.5Hz),2.25-2.66(6H,m),2.97(1H,dd,J=3.7,13.5Hz),4.25-4.33(1H,m),5.89(1H,s),6.85(1H,s),6.96-7.24(12H,m),7.56(1H,dd,J=1.2,5.4Hz),8.13(1H,d,J=8.52Hz),8.98(1H,s),10.71(1H,s).实施例4N-(2-(R)-苄基-4-羟胺基-3-(S)-[2-噻吩硫代甲基]琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺a)N-(2-(R)-苄基-4-羟基-3-(S)-[2-噻吩硫代甲基]琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺
按照实施例3f制备,但改用N-(2-(R)-苄基-4-羟基-3-乙烯基琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺(200mg,0.53mmo1)得到白色固体标题化合物(100mg,38％)。dH[(CD3)2SO]1.94(1H,dd,J=3.2,12.8Hz),2.28-2.72(6H,m),2.44(3H,d,J=4.7Hz),2.93(1H,dd,J=4.1,13.5Hz),4.37(1H,m).6.79(1H,m),7.01-7.27(12H,m),7.60(1H,dd,J=1.5,5.1Hz),8.23(1H,d,J=8.8Hz),12.7(1H,brs).b)N-(2-(R)-苄基-4-羟胺基-3-(S)-[2-噻吩硫代甲基]琥珀酰基)-(S)-苯丙氨酸-N′-甲基酰胺
按照实施例3g制备得到白色固体标题化合物(35％)。dH[(CD3)2SO]1.83(1H,d,J=10.5Hz),2.30(1H,m),2.39(3H,d,J=4.7Hz),2.50-2.63(5H,m),2.94(1H,dd,J=4.1,13.7Hz),4.33(1H,m),6.45(1H,m),7.00(4H,m),7.17(8H,m),7.56(1H,dd,J=1.4,5.2Hz),8.20(1H,d,J=8.2Hz),8.97(1H,brs),10.70(1H,brs).
活性数据化合物 CD23蛋白酶抑制 胶原酶抑制
％(1uM) IC50 uM实施例3 105 0.93实施例4 85 0.37对照实施例* 96 0.005*对照实施例为WO 90/05719中的实施例2，下式化合物：其中R是CH2S-(2-噻吩基)，R1是甲基。