血管紧张素的口服制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月17日提交的美国临时专利申请序列No.61/701,972的优先权，本公开的全部内容在此以其整体并入。
背景
经口递送通常是一种需要的施用途径，因为其与注射、经鼻施用和其它施用途径相比更便利且给患者带来更少的不舒服。然而一般很难经口施用肽，因为肽容易降解。经口施用短肽如血管紧张素倾向于甚至更有问题，因为短肽通常缺乏二级或三级结构并因此更易受胃和肠的蛋白水解酶的影响。这些酶可以快速降解短肽，从而使得其失活之后其可被吸收至血流中。
发明概述
本发明提供了用于有效经口递送血管紧张素肽的组合物和方法。特别地，本发明提供了保持血管紧张素肽的稳定性并增强其吸收至血流中的各种口服制剂。结果，根据本发明递送的血管紧张素肽可获得延长的半衰期和治疗有效的生物利用度。
在一方面，本发明提供了经口施用的固体剂型，其包含(a)血管紧张素(1-7)肽，(b)至少一种药学上可接受的降pH剂，(c)至少一种有效促进血管紧张素(1-7)肽的生物利用度的吸收促进剂，和(d)保护性媒介物。
在一些实施方案中，合适的固体剂型是胶囊剂或片剂。
在一些实施方案中，合适的降pH剂是柠檬酸。在一些实施方案中，柠檬酸存在的量为大于约200mg(如，大于约250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg)。在一些实施方案中，柠檬酸存在的量为大于固体剂型总重的约20％(如，大于25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％)。
在一些实施方案中，合适的降pH剂是酒石酸。
在一些实施方案中，合适的吸收促进剂是酰基肉碱。在一些实施方案中，酰基肉碱是月桂酰肉碱。在一些实施方案中，月桂酰肉碱存在的量的范围是约20-200mg(如，范围为20-150mg、20-100mg、20-90mg、20-80mg、50-200mg、50-150mg、50-100mg、50-90mg、50-80mg)。在一些实施方案中，月桂酰肉碱存在的量为约20mg,30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg。在一些实施方案中，月桂酰肉碱存在的量范围为固体剂型总重的约2-20％(如，2-15％、2-10％、2-7.5％、5-20％、5-15％、5-10％、5-7.5％)。在一些实施方案中，月桂酰肉碱存在的量为或大于固体剂型总重的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，月桂酰肉碱存在的量为或小于固体剂型总重的约25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％。
在一些实施方案中，合适的保护性媒介物是肠溶包衣。在一些实施方案中，保护性媒介物组成量为或小于固体剂型总重的约25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％。
在一些实施方案中，根据本发明的固体剂型还包含一种或多种赋 形剂。在具体的实施方案中，所述一种或多种赋形剂选自填充剂(诸如![]()
)、崩解剂(诸如POLYPLASDONETM交联聚维酮)、助流剂(诸如二氧化硅)或润滑剂(诸如硬脂富马酸钠)。
在一些实施方案中，根据本发明的固体剂型还包含卡托普利。
在一些实施方案中，合适的固体剂型的总重范围为约500-1500(如，约500-1200mg、500-1000mg、600-1500mg、600-1200mg、600-1000mg、700-1500mg、700-1200mg、700-1000mg、800-1500mg、800-1200mg、800-1000mg)。在一些实施方案中，合适的固体剂型的总重范围为大于约500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg或1500mg。在一些实施方案中，合适的固体剂型的总重为或小于约2000mg、1900mg、1800mg、1700mg、1600mg、1500mg、1400mg、1300mg、1200mg、1100mg、1000mg、900mg、800mg、700mg、600mg或500mg。
在一些实施方案中，血管紧张素(1-7)肽存在的量范围为约10-1000mg(如，约10-900mg、10-800mg、10-700mg、10-600mg、10-500mg、100-1000mg、100-900mg、100-800mg、100-700mg、100-600mg、100-500mg、100-400mg、100-300mg、200-1000mg、200-900mg、200-800mg、200-700mg、200-600mg、200-500mg、200-400mg、300-1000mg、300-900mg、300-800mg、300-700mg、300-600mg、300-500mg)。在一些实施方案中，血管紧张素(1-7)肽存在的量为或大于约10mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg。在一些实施方案中，血管紧张素(1-7)肽存在的量为或小于约1000mg、950mg、900mg、850mg、800mg、750mg、700mg、650mg、600mg、550mg、500mg、450mg、400mg、350mg、300mg、250mg、200mg、150mg或100mg。
在具体的实施方案中，本发明提供了用于经口施用的固体剂型， 其包含(a)血管紧张素(1-7)肽，(b)柠檬酸，(c)月桂酰肉碱，和(d)保护性媒介物。在某些实施方案中，柠檬酸存在的量为大于500mg并且月桂酰肉碱存在的量范围为50-100mg。
在某些实施方案中，固体剂型是胶囊剂或片剂。在某些实施方案中，合适的保护性媒介物是肠溶包衣。
在各种实施方案中，血管紧张素(1-7)肽包含天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)。
在各种实施方案中，血管紧张素(1-7)肽是SEQ ID NO:1的功能等同物。在一些实施方案中，功能等同物是线性肽。在一些实施方案中，线性肽包含了包括至少4种选自天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7种氨基酸的氨基酸的序列，其中至少4种氨基酸将它们的相对位置保持在与其天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的位置处。在一些实施方案中，线性肽包含包括至少5种选自天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7种氨基酸的氨基酸的序列，其中至少5种氨基酸将它们的相对位置保持在与其天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的位置处。在一些实施方案中，线性肽包含了包括至少6种选自天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7种氨基酸的氨基酸的序列，其中至少6种氨基酸将它们的相对位置保持在与其天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的位置处。在一些实施方案中，至少4、5或6种氨基酸各自进一步将它们的相对间距保持在它们在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的位置处。
在一些实施方案中，线性肽含有4-25个氨基酸(如，4-20、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7个氨基酸)。在一些实施方案中，线性肽含有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
在一些实施方案中，线性肽是天然存在的血管紧张素(1-7)的片段。
在一些实施方案中，线性肽含有天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。
在具体的实施方案中，线性肽具有Asp1-Arg2-Nle3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
在具体的实施方案中，线性肽具有Asp1-Arg2-Val3-Ser4-Ile5-His6-Cys7的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中，功能等同物是环肽。在一些实施方案中，环肽包含了氨基酸之间的键。在一些实施方案中，所述键位于对应于天然存在的血管紧张素(1-7)中的位置Tyr4和Pro7残基处。在一些实施方案中，所述键是硫醚桥。
在具体的实施方案中，环肽包含另外与天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，环肽包含替代天然存在的血管紧张素(1-7)中的位置Val3的正亮氨酸(Nle)。
在某些实施方案中，环肽是具有下式的4,7-环化血管紧张素(1-7)：
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在各种实施方案中，血管紧张素(1-7)肽包含一个或多个化学修饰以增加蛋白酶耐受性、血清稳定性和/或生物利用度。在一些实施方 案中，一个或多个化学修饰包括聚乙二醇化。
本发明进一步提供了用于施用本文描述的口服制剂的方法。
如本申请所用，术语“约(about，approximately)”可用作等同物。本申请所用的任何具有或不具有约的数字意在涵盖相关技术领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
本发明的其它特征、目标和优势以随后的详述变得显而易见。然而，应该理解，详述在说明本发明的实施方案的同时，仅通过举例说明的方式给出而非限制的方式给出。本发明范围内的各种变化和修改将通过详述而对本领域的技术人员变得显而易见。
附图简述
附图仅用于说明目的而非限制。
图1描绘了示例性结果，说明了各种施用途径的由曲线下面积(AUC)表示的血管紧张素(1-7)的总暴露的比较。
定义
为了本发明更容易被理解，首先如下定义了某些术语。对以下术语和其它术语的另外定义在本说明书全文示出。
动物：如本文所用，术语“动物”是指任何数目的动物界。在一些实施方案中，“动物”是指任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫、和/或虫。在一些实施方案中，动物可为转基因动物、基因工程动物和/或克隆。
约(approximately,about)：如本文所用，如应用于一个或多个目标 值的术语“约(approximately,about)”是指与指出的参考值类似的值。在某些实施方案中，术语“约(approximately,about)”是指除非另外说明或另外从上下文中显而易见，否则落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围(在指明的参考值的任一方向(大于或小于))的值(除了当此类数字将超过可能值的100％时)。
生物利用度：如本文所用，术语“生物利用度”一般是指施用剂量到达受试者血流的百分比。
生物活性：如本文所用，短语“生物活性”是指任何试剂在生物系统特别是有机体中具有活性的特征。例如，当向有机体施用制剂时，所述制剂对有机体具有生物作用，那么所述制剂被认为具有生物活性。在其中肽具有生物活性的具体实施方案中，此肽中与肽共有至少一种生物活性的部分通常被称为“生物活性”部分。在某些实施方案中，肽不具有固有生物活性但抑制一种或多种天然存在的血管紧张素化合物的作用被认为具有生物活性。
载体或稀释剂：如本文所用，术语“载体”和“稀释剂”是指药学上可接受的(如，安全且无毒地施用给人)载体或稀释物质以用于制备药物制剂。示例性稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或葡萄糖溶液。
剂型：如本文所用，术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗患者的物理分散单位的治疗剂。每个单位含有预定量的活性物质，其经计算产生目标疗效。然而，应该理解，组合物的总剂量将由主治医生在可靠的医学判断范围内决定。
给药方案：如本文所用，术语“给药方案”(或“治疗方案”)是一组通常在一段间隔的时期向受试者各自施用的单位剂量(通常多于一个)。在一些实施方案中，给定的治疗剂具有推荐的可涉及一个或多 个剂量的给药方案。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，所述剂量的每一个可与另一个以相同长度的时间分开；在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量和分隔各个剂量的至少两个不同时间段。在一些实施方案中，将治疗剂在预定的使其内连续施用。在一些实施方案中，将治疗剂每天施用一次(QD)或每天施用两次(BID)施用。
赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指任何添加至药物和/或制剂以改善所述药物和/或制剂质量(即一致性)、药代动力学特性(即生物利用度)、药效学特性及其组合的惰性物质。
功能等同物或功能衍生物：如本文所用，术语“功能等同物”或“功能衍生物”表示在氨基酸序列的功能衍生物的情况下，保留与原始序列的生物活性基本上类似的生物活性的分子。功能衍生物或等同物可为天然衍生物，或者重组或合成制备。示例性功能衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，前提条件是所述蛋白的生物活性是保守的。取代氨基酸具有所需的与经取代的氨基酸的化学-物理性质类似的化学-物理性质。所需的类似的化学-物理性质包括电荷、膨松性、疏水性、亲水性等方面的类似性。
改善、增加或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等同物表明了相对于基线测量(诸如在相同个体中在开始本文所述治疗之前的测量或在缺乏本文所述治疗时在对照个体(或多个对照个体)中的测量)的值。“对照个体”是罹患与正在治疗的个体相同形式疾病的个体，所述对照个体与正在治疗的个体处于大概相同的年纪(以确保经治疗的个体和对照个体中的疾病的阶段是可比较的)。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境如在测试管或反应容器、细胞培养物而非多细胞有机物中发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞有机体诸如人和非人动物中发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，术语可用于指在活细胞中发生的事件(与之相反，例如，体外系统)。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指物质和/或实体已经(1)与至少一些在所述物质和/或实体初始产生时相联的组分中分离(无论是在天然和/或实验设定中)，和/或(2)人工产生、制备和/或制造。经分离的物质和/或实体可与与其初始相联的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本上100％或100％的其它组分分离。在一些实施方案中，分离的试剂为大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本上100％或100％纯。如本文所用，如果物质基本上不含其它组分，则物质是“纯的”。如本文所用，术语“分离的细胞”是指多细胞有机物中不含的细胞。
肽：如本文所用的术语“肽”是指经由肽键连在一起的氨基酸的顺序链(sequential链)。通常，术语用来指长度短的氨基酸链，但本领域的普通技术人员将理解所述术语不限于任何特定长度的链并且可指包含经由肽键连在一起的两个氨基酸的最小链。然而，通常，肽是指具有或小于50、45、40、35、30、25、20、15、10个氨基酸的氨基酸链。如本领域的技术人员所知，可加工和/或修饰肽。
药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指当施用给受试者时不产生非所需的过敏反应或抗原反应的任何实体或组合物。
蛋白：如本文所用的术语“蛋白”是指作为分散单位起作用的一种或多种多肽。如果单个多肽是分散功能单位且为了形成分散功能单位而不需要与其它多肽有永久性或临时性物理相关性，则术语“多肽”和“蛋白”可互换使用。如果分散功能单位由多于一种物理上彼此分散的多肽组成，则术语“蛋白”是指物理上偶联在一起并一起作为分散单位起作用的多种多肽。
稳定性：如本文所用，术语“稳定的”是治疗剂长期保持其治疗效 果(如，所有或其大部分的期望生物活性和/或物理化学完整性)的能力。治疗剂的稳定性，和药物组合物保持此类治疗剂的稳定性的能力可长期评估(如，至少1、3、6、12、18、24、30、36个月或更久)。在某些实施方案中，已经配制了本文描述的药物组合物适，使得它们能够稳定或另外地减缓或预防与其一起配制的一种或多种治疗剂的降解。在制剂的情况下，稳定的制剂是一种其中的治疗剂在贮藏和处理过程中(诸如冷冻/解冻、机械混合和冻干)基本上保持其物理和/或化学完整性和生物活性。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(如，小鼠、大鼠、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类动物)。人包括产前形式和产后形式。在许多实施方案中，受试者是人类。受试者可为患者，其是指呈现给医疗提供者以诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可罹患或易感疾病或病症但可能或不可能呈现出所述疾病或病症的症状。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现出目标特征或性质的完全或近乎完全程度或度的定质条件。生物领域的技术人员将理解生物和化学现象如果存在基本上不完全进行和/或进行至完全或者达到或避免绝对结果。术语“基本上”因此在本文中用于捕获许多生物和化学现象缺乏所固有的完整性的潜能。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”的治疗剂意为当向患有或易患疾病、病症和/或疾患的受试者施用时足以治疗、诊断、预防所述疾病、病症和/或疾患和/或延缓其症状发作的量。本领域的普通技术人员将理解，通常经由包括至少一个单位剂量的给药方案施用治疗有效量。
治疗/处理：如本文所用，术语“治疗/处理(treat，treatment，treating)”是指任何用于部分或完全减轻、改善、缓减、预防具体疾病、病症和/或疾患，延迟具体疾病、病症和/或疾患发作，降低具体疾病、 病症和/或疾患的严重性和/或降低具体疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征的发病率。可将治疗施用给未展现出疾病迹象和/或仅展现出疾病早期迹象的受试者以用于降低患有与所述疾病相关的病状的风险。
本发明的其它特征、目标和优势在以下详述中显而易见。然而，应该理解，详述在表明本发明的实施方案时，仅举例说明的方式给出而非限制的方式给出。本发明范围内的各种变化和修改将通过详述而对本领域的技术人员变得显而易见。
某些实施方案的详述
本发明尤其提供了适用于经口施用给受试者的血管紧张素(1-7)(Ang-(1-7))的制剂。此类施用可用于多种目的，包括治疗疾病、病症或疾患。
在一些实施方案中，提供了用于经口施用的固体剂型，其包含(a)血管紧张素(1-7)肽，(b)至少一种药学上可接受的降pH剂，(c)至少一种有效促进血管紧张素(1-7)肽的生物利用度的吸收促进剂，和(d)保护性媒介物。
在一些实施方案中，固体剂型是胶囊剂或片剂。各种制备口服制剂的方法和成分是本领域已知的，并且期待本领域的技术人员将能够确定这些方法中的哪种将与如本发明书所述的本发明相容。还可在本发明的范围内考虑了此类方法和成分。
本发明的各个方面详述于以下章节中。使用章节并非意在限制本发明。每个章节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外说明，否则使用“或”意为“和/或”。
血管紧张素(1-7)肽
如本文所用，术语“血管紧张素(1-7)肽”是指天然存在的血管紧张 素(1-7)和天然存在的血管紧张素(1-7)的任何功能等同物、类似物或衍生物。如本文所用，“肽”和“多肽”是可互换的术语，并是指通过肽键结合在一起的两个或多个氨基酸。如本文所用，术语“肽”和“多肽”包括线状肽和环状肽。术语“血管紧张素-(1-7)”、“血管紧张素-(1-7)”和“Ang-(1-7)”可互换使用。
天然存在的血管紧张素(1-7)
天然存在的血管紧张素(1-7)(也被称为Ang-(1-7))是如下所示的七氨基酸肽：
Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)
其是肾素-血管紧张素系统的一部分，并且由也被称为血管紧张素原的前体转化而来，所述血管紧张素原是一种组成性产生且主要通过肝释放至循环的α-2-球蛋白。血管紧张素原是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白家族的一个成员并且也被称为肾素底物。人血管紧张素原长为452个氨基酸，但另外的肿瘤具有各种大小的血管紧张素原。通常，开始的12个氨基酸对于血管紧张素活性来说是最重要的：
Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7-Phe8-His9-Leu10-Val11-Ile12(SEQ ID NO:4)
不同类型的血管紧张素可通过各种酶的作用形成。例如，血管紧张素(1-7)是通过血管紧张素-转化酶2(ACE 2)的作用产生的。
Ang-(1-7)是Mas受体的内源性配体。Mas受体是含有7个跨膜区的G-蛋白偶联的受体。如本文所用，术语“血管紧张素-(1-7)受体’涵盖了G蛋白偶联的Mas受体。
如本文所用，术语“天然存在的血管紧张素(1-7)”包括具有与天然存在的血管紧张素(1-7)的氨基酸序列相同的氨基酸序列的从天然来源纯化的和任何重组产生肽或化学合成肽的任何血管紧张素(1-7)肽。
Ang-(1-7)的功能等同物、类似物或衍生物
在一些实施方案中，适用于本发明的血管紧张素(1-7)肽是天然存在的Ang-(1-7)的功能等同物。如本文所用，天然存在的Ang-(1-7)的功能等同物是指与天然存在的Ang-(1-7)共有氨基酸序列同一性且基本上保留了与天然存在的Ang-(1-7)相同或类似活性的任何肽。例如，在一些实施方案中，本文描述的天然存在的Ang-(1-7)的功能等同物具有如使用本文所述或本领域已知的方法确定的促血管生成活性，或者具有活性诸如一氧化氮释放、血管舒张、改善的内皮功能、抑制尿分泌或本文讨论的积极影响血管生成的其它性质之一。在一些实施方案中，本文描述的天然存在的Ang-(1-7)的功能等同物可结合或活化如使用本文所述或本领域已知的各种测定确定的血管紧张素-(1-7)受体(如，G蛋白偶联的Mas受体)。在一些实施方案中，Ang-(1-7)的功能等同物也被称为血管紧张素(1-7)类似物或衍生物或功能衍生物。
通常，血管紧张素(1-7)的功能等同物与天然存在的Ang-(1-7)共有氨基酸序列类似性。在一些实施方案中，根据本发明的Ang-(1-7)的功能等同物含有包括来自天然存在的Ang-(1-7)中出现的其7种氨基酸的至少3种(如，至少4种、至少5种、至少6种、至少7种)氨基酸的序列，其中所述的至少3种(如，至少4种、至少5种、至少6种或至少7种)氨基酸如它们在天然存在的Ang-(1-7)出现的那样保持它们的位置。
在一些实施方案中，Ang-(1-7)的功能等同物还涵盖了含有与天然存在的Ang-(1-7)的氨基酸序列具有至少50％(如，至少60％、70％、80％或90％)同一性的序列的任何肽。氨基酸序列同一性的百分比可通过比对氨基酸序列来确定。氨基酸序列的比对可以本发明领域内的各种方式(例如使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、ALIGN或M egalign(DNASTAR)软件)实现。本领域技术人员可确定适当的参数以测量比对，包括任何需要获得全长比较序列的最大比对的算法。优选地，WU-BLAST-2软件用于测定氨基酸序列同一性(Altschul等,Me thods in Enzymology 266,460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blas t/README.html)。WU-BLAST-2使用多种搜索参数，大多数参数被设定为缺省值。可调整的参数按照以下值设定：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，词阈值(T)＝11。HSP得分(S)和HSP S2参数是动态值并且可由程序本身根据具体序列的组成建立，燃和最小值可被调节并如上指定的那样设定。
在一些实施方案中，Ang-(1-7)的功能等同物、类似物或衍生物是天然存在的Ang-(1-7)的片段。在一些实施方案中，Ang-(1-7)的功能等同物、类似物或衍生物含有天然存在的Ang-(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。Ang-(1-7)功能等同物、类似物或衍生物可经由取代、添加和/或缺失通过改变氨基酸序列来制备。例如，天然存在的Ang-(1-7)的序列(SEQ ID NO:1)内的一个或多个氨基酸残基可被作为功能等同物起作用的类似极性的另一种氨基酸取代，从而导致沉默变化。序列内氨基酸的取代可选自所述氨基酸所属类别的其它成员。例如，带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非极性(疏水性)氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和蛋氨酸。不带电的极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带负电(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。氨基酸甘氨酸可被纳入非极性氨基酸家族或不带电(中性)极性氨基酸家族中。氨基酸家族内进行的取代一般被理解为保守取代。例如，肽抑制剂的氨基酸序列可被修饰或取代。
Ang-(1-7)功能等同物、类似物和衍生物的实例描述于以下标题为“示例性血管紧张素(1-7)肽”的章节中。
血管紧张素-(1-7)肽可具有任何长度。在一些实施方案中，根据本发明的血管紧张素-(1-7)肽可含有例如4-25个氨基酸(如，4-20、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7个氨基酸)。在一些实施方案中，线性肽含有4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、16个、17个、18个、19个、 20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。
在一些实施方案中，血管紧张素-(1-7)肽含有增加蛋白酶耐受性、血清稳定性和/或生物利用度的一种或多种修饰。在一些实施方案中，合适的修饰选自肽的聚乙二醇化、乙酰化、糖基化、生物素化、用D-氨基酸和/或非天然氨基酸取代和/或肽的环化。
如本文所用，术语“氨基酸”就其最广泛的含义来说是指任何可掺入多肽链的化合物和/或物质。在某些实施方案中，氨基酸具有一般结构H2N–C(H)(R)–COOH。在某些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在某些实施方案中，氨基酸是合成或非天然氨基酸(如，α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸)；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在某些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中通常存在的二十种氨基酸的任何一种，包括天然掺入肽中的l-和d-氨基酸。“不标准”或“非常规氨基酸”是指除了标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是合成制备还是从天然来源获得的。如本文所用，“合成或非天然氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代。可将氨基酸，包括肽中的羧基端和/或氨基端的氨基酸，通过改变肽的循环半衰期而不不利影响其活性的甲基化、酰胺化、乙酰化和/或用其它化学基团取代来修饰。非常规或非天然氨基酸的实例包括但不限于瓜氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、4-(E)-丁烯基-4(R)-甲基-N-甲基苏氨酸(MeBmt)、N-甲基-亮氨酸(MeLeu)、氨基异丁酸、抑胃酶氨酸和N-甲基-丙氨酸(MeAla)。氨基酸可参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用术语的上下文中显而易见其时指游离氨基酸还是肽的残基。
在某些实施方案中，血管紧张素-(1-7)肽含有一种或多种L-氨基酸、D-氨基酸和/或非天然氨基酸。
除了仅含有天然存在的氨基酸的肽之外，本发明还涵盖了模拟肽 或肽类似物。肽类似物常在制药业中用作具有与模板肽的那些性质类似的性质的非肽药物。非肽化合物被定义为“肽模拟物”或模拟肽(Fauchere等,Infect.Immun.54:283-287(1986)；Evans等,J.Med.Chem.30:1229-1239(1987))。与治疗有效肽结构相关的且可用来产生等同物或者增强的治疗或预防效果的肽模拟物。通常，模拟肽与示例多肽(即，具有生物或药理学活性的多肽)诸如天然存在的受体-结合多肽在结构上类似，但具有可被诸如–CH2NH–、–CH2S–、–CH2–CH2–、–CH＝CH–(顺式和反式)、–CH2SO–、–CH(OH)CH2–、–COCH2–等的键通过本领域熟知的方法任选替换的一个或多个肽键(Spatola,Peptide Backbone Modifications,Vega Data,1(3):267(1983)；Spatola等Life Sci.38:1243-1249(1986)；Hudson等Int.J.Pept.Res.14:177-185(1979)；和Weinstein.B.,1983,Chemistry and Biochemistry,of Amino Acids,Peptides and Proteins,Weinstein编辑,Marcel Dekker,New-York,)。此类肽模拟物可较天然存在的多肽具有显著的优势，所述优势包括更经济的生产、更佳的化学稳定性、增强的药理学性质(如，半衰期、吸收、效能、效率等)、降低抗原性的及其它。
Ang-(1-7)肽还包括了含有另外的化学部分并非通常的肽的一部分的其它类型的肽衍生物，前提条件是衍生物保留了所述肽所需的功能。此类衍生物的实例包括(1)氨基端或另一氨基的N-酰基衍生物，其中酰基可为烷酰基(如，乙酰基、己酰基、辛酰基)、芳酰基(如，苯甲酰基)或阻断基团(诸如F-moc(芴基甲基–O–CO–))；(2)羧基端酯或另一种游离羧基酯或羟基酯；(3)通过与氨或合适的胺反应而产生羧基端酰胺或另一游离羧基酰胺；(4)磷酸化衍生物；(5)与抗体或其它生物配体缀合的衍生物和其它类型的衍生物；和(6)与聚乙二醇(PEG)链缀合的衍生物。
Ang-(1-7)肽可通过本领域技术人员已知的任何肽合成方法(如，专一性固体相合成、部分固体相合成、片段缩合、经典溶液合成、天然化学连接)和重组技术获得。例如，肽或肽衍生物可通过固体相肽合成获得，所述固体相肽合成简而言之由C末端氨基酸的羧基与树 脂(如，二苯甲胺树脂、氯甲基化树脂、羟甲基树脂)偶联并连续添加N-α保护的氨基酸组成。保护基团可以是本领域已知的任何此类基团。在向生长链添加每个新氨基酸之前，之前向所述链添加的氨基酸的保护基团被去除。此类固体相合成已经公开在例如美国专利号4,305,872和4,316,891中的Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1964)；Vale等,Science 213:1394-1397(1981)，及Lubell等“Peptides”Science of Synthesis 21.11,Chemistry of Amides.Thieme,Stuttgart,713-809(2005)中综述的技术Bodonsky等Chem.Ind.(London),38:1597(1966)；与Pietta和Marshall,Chem.Comm.650(1970)中。氨基酸与适当的树脂的偶联也是本领域所熟知的并且已经公开在美国专利号4,244,946中(综述于Houver-Weyl,Methods of Organic Chemistry.第E22a卷.Synthesis of Peptides and Peptidomimetics,Murray Goodman,主编,Thieme.Stuttgart.New York 2002中)。
除非另外定义，否则本文所用的科学术语和技术术语及命名法具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，细胞培养、感染、分子生物学方法等的程序是本领域使用的一般方法。此类标准技术可见于参考手册诸如,例如Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001；和Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.,2001中。
在制备Ang-(1-7)肽的任何过程中，需要保护考虑的任何分子上的敏感反应基团。这可通过常规保护基团的方式实现，诸如Protective Groups In Organic Synthesis by T.W.Greene&P.G.M.Wuts,1991,John Wiley and Sons,New-York；和Peptides:chemistry and Biology by Sewald和Jakubke,2002,Wiley-VCH,Wheinheim第142页中描述的那些方式。例如，α氨基保护基团包括酰基型保护基团(如，三氟乙酰基、甲酰基、乙酰基)、脂肪族氨基甲酸乙酯保护基团(如，叔丁基氧基羰基(BOC)、环己基氧基羰基)、芳香族氨基甲酸乙酯型保护基团(如，芴基-9-甲氧基-羰基(Fmoc)、苄氧基羰基(Cbz)、Cbz衍生物) 和烷基型保护基团(如，三苯基甲基、苄基)。氨基酸侧链保护基团包括苄基(用于Thr和Ser)、Cbz(Tyr、Thr、Ser、Arg、Lys)、甲基乙基、环己基(Asp、His)、Boc(Arg、His、Cys)等。保护基团可在方便的随后阶段使用本领域已知的方法去除。
此外，Ang-(1-7)肽可根据FMOC方案在有机相中用保护基团合成。期望地，可将肽以70％的产率用高压液相色谱(HPLC)在C18色谱柱上纯化并用10-60％的乙腈梯度洗脱。肽的分子量可通过质谱验证(综述于Fields,G.B.“Solid-Phase Peptide Synthesis”Methods in Enzymology.第289卷,Academic Press,1997中)。
可替代地，Ang-(1-7)肽可在重组系统中使用例如编码多肽的多核苷酸序列来制备。应理解，多肽可含有相同多肽中多于一种的所述修饰。
当肽可有效地引发体外生物活性时，它们的体内效果可由于蛋白酶的存在而减少。血清蛋白酶具有特定的底物要求。所述底物必需具有用于清除的L-氨基酸和肽键。此外，代表了血清终蛋白酶活性的最主要组分的外肽酶通常作用于所述肽的第一个肽键上，并且需要游离的N-末端(Powell等,Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。鉴于此，使用修饰型的肽通常是有利的。经修饰的肽保持了赋予Ang-(1-7)生物活性但有利地不容易受到蛋白酶和/或外肽酶裂解影响的原始L-氨基酸肽的结构特征。
用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列的一种或多种氨基酸(如，D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用于产生更稳定的肽。因此，本发明的肽衍生物或拟肽物可以都是L、都是D或者以正向或反向混合的D、L肽。N末端或C末端D-氨基酸的存在增加了肽的体内稳定性因为肽酶不能使用D-氨基酸作为底物(Powell等,Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。反向-D肽是以相对于含有L-氨基酸的肽以相反序列排列的含有D-氨基酸的肽。因此，L-氨基酸肽的C末端残基 变成D-氨基酸肽的N末端等。反向D-肽保留了与L-氨基酸肽相同的二级构象并因此具有类似的活性，但是对体外和体内酶降解更耐受，并因此可具有比原始肽更佳的治疗效果(Brady和Dodson,Nature368:692-693(1994)；Jameson等,Nature 368:744-746(1994))。类似地，反向-L肽可使用标准方法产生，其中母体肽的C末端替代了反向-L肽的N末端。应考虑到不具有显著二级结构的L-氨基酸肽的反向L-肽(如，短肽)保留了L-氨基酸肽侧链的相同的间距和构象并因此通常具有与原始L-氨基酸肽类似的活性。此外，反向肽可含有L-和D-氨基酸的组合。可维持氨基酸之间的间距和侧链的构象，从而产生与原始L-氨基酸肽类似的活性。
另一种有效赋予作用于肽的N末端或C末端残基的肽酶耐受性的方式是在肽末端添加化学基团，是的经修饰的肽不再是肽酶的底物。一种此类化学修饰是在任一端或两端对肽进行糖基化。某些化学修饰，特别是N末端糖基化，已经显示可增加人血清中肽的稳定性(Powell等,Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。其它增强血清稳定性的化学修饰包括但不限于添加由1至20个碳的低级烷基组成的N末端烷基(诸如乙酰基)，和/或添加C末端酰胺或取代的酰胺基团。特别地，本发明包括经修饰的肽，所述肽由带有N末端乙酰基和/或C末端酰胺基的肽组成。
在肽的子序列中用非天然存在的氨基酸替代天然氨基酸还可赋予对蛋白水解的耐受性。此类取代可例如赋予对作用于N末端的外肽酶蛋白水解的耐受性而不影响生物活性。非天然存在的氨基酸的实例包括α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、C-α-甲基氨基酸、β-氨基酸和β-甲基氨基酸。用于本发明的氨基酸类似物可包括但不限于β-丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、4-氨基丁酸、鸟氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、环己基丙氨酸、2-氨基异丁酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、o-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基蛋氨酸、3-甲基组氨酸和其它非常规氨基酸。此外，非天然存在的氨基酸合成肽在本领域是常规做法。
此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列变体的限制性肽可通过本领域熟知的方法产生(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.61:387-418(1992))。例如，限制性肽可通过添加能够形成二硫桥从而产生环肽的半胱氨酸残基来产生。环肽可被限定为不具有游离的N末端或C末端。因此，它们不易受外肽酶蛋白水解的影响，尽管它们易受不在肽末端理解的内肽酶的影响。具有N末端或C末端D-氨基酸的肽的氨基酸序列与环肽的氨基酸序列通常与它们所对应的肽的序列相同，除了在分别存在N末端或C末端D-氨基酸残基或它们的环状结构的情况下。
环肽
在一些实施方案中，天然存在的Ang-(1-7)的功能等同物、类似物或衍生物是环肽。如本文所用，环肽具有两个不相邻的残基之间的分子内的共价键。分子内的键可为主链与主链之间的键、侧链与主链之间的键或侧链与侧链之间的键(即，线性肽的末端官能团和/或末端或内部残基的侧链官能团可连接以实现环化)。典型的分子内的键包括二硫键、酰胺键和硫醚键。多种环化多肽的方式是本领域所熟知的，可对此类肽进行的许多其它修饰也是如此。对于一般讨论，参见国际专利公布号WO 01/53331和WO 98/02452，其内容通过引用并入本文。此类环键和其它修饰还可应用于本发明的环肽和衍生物化合物。
如本文所述的环肽可包含L-氨基酸、D-氨基酸的残基或其任何组合。氨基酸可来自于天然或非天然来源，前提条件是至少一个氨基和至少一个羧基存在于所述分子中；α-和β-氨基酸通常是优选的。环肽还可含有一种或多种罕见氨基酸(诸如4-羟基脯氨酸或羟基赖氨酸)、有机酸或酰胺和/或常见氨基酸的衍生物，诸如C末端羧酸根酯化(如，苄基酯、甲基酯或乙基酯)或酰胺化的氨基酸和/或N末端氨基修饰的氨基酸(如，乙酰化或烷氧基羰基化)、具有或不具有各种侧链修饰和/或取代的任何一种的氨基酸(如，甲基化、苄基化、叔丁基化、甲苯磺酰化、烷氧基羰基化等)。合适的衍生物包括具有N-乙酰 基的氨基酸(使得代表环化前线性N末端的肽氨基被乙酰基化)和/或C末端酰胺基(即，环化前线性肽的羧基端酰胺化)。除了可与环肽一同呈现的常见氨基酸之外的残基包括但不限于青霉胺、β,β-环戊烷半胱氨酸、β,β-环戊烷半胱氨酸、β-巯基丙酸、β,β-环戊烷-β-巯基丙酸、2-巯基苯、2-巯基苯胺、2-巯基脯氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、α-氨基己二酸、间氨甲基苯甲酸和α,β-二氨基丙酸。
在合成具有或不具有N-乙酰化和/或C-酰胺化的线性肽之后，环化可以本领域熟知的多种技术的任何一种来实现。在一个实施方案中，可在反应性氨基酸侧链之间产生键。例如，二硫桥可通过使用多种方法的任何一种氧化所述肽从而从包含两个含硫醇残基的线性肽形成。在一种此类方法中，硫醇的空气氧化可使用碱性或中性水性介质经数天的时间产生二硫键。所述肽以高稀释度使用以将聚集和分子内副反应最小化。可替代地，强氧化剂诸如I2和K3Fe(CN)6可用于形成二硫键。本领域的普通技术人员将认识到必需小心不能氧化Met、Tyr、Trp或His的敏感侧链。在另外的实施方案中，环化可通过酰胺键形成来实现。例如，肽键可在末端官能团之间形成(即，环化前线性肽的氨基端和羧基端)。在另一个此类实施方案中，线性肽包括D-氨基酸。可替代地，环化可通过连接一个末端与残基侧链或者使用两条具有或不具有N末端乙酰基和/或C末端酰胺的侧链来实现。能够形成内酰胺键的残基包括赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、α-氨基己二酸、间氨基甲基苯甲酸、α,β-二氨基丙酸、谷氨酸或天冬氨酸。用于形成酰胺键的方法一般为本领域所熟知的。在一个此类方法中，碳二亚胺介导的内酰胺形成羧酸与DCC、DIC、ED AC或DCCI反应，从而形成可与游离氨基立即反应完成环化的O-酰基脲来实现。可替代地，环化可使用叠氮化物法进行，其中反应性叠氮化物中间体是从烷基酯经由酰肼形成的。可替代地，环化可使用活化的酯来实现。在酯的烷氧基碳上存在吸电子取代基增加了它们对氨解的易感性。对硝基酚、N-羟基化合物和多卤化酚的酯的高反应性已经使得这些"活性酯"用于合成酰胺键。在另外的实施方案中，硫醚键可在含硫醇残基的侧链和 适当衍化的α-氨基酸之间形成。举例来说，赖氨酸侧链可与溴乙酸通过碳二亚胺偶联方法(DCC、EDAC)偶联，然后与以上提及的含硫醇残基的任何一个的侧链反应形成硫醚键。为了形成二硫醚，任何两条含硫醇侧链可与二溴乙烷和二异丙胺于DMF中反应。
示例性血管紧张素-(1-7)肽
在某些方面，本发明提供了线性血管紧张素-(1-7)肽。如上所讨论，天然存在的Ang-(1-7)的结构如下：
Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)
本发明的肽和肽类似物可一般由以下序列表示：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7(SEQ ID NO:5),
或其药学上可接受的盐。
Xaa1是任何氨基酸或二羧酸。在某些实施方案中，Xaa1是Asp、Glu、Asn、Acpc(1-氨基环戊烷羧酸)、Ala、Me2Gly(N,N-二甲基甘氨酸)、Pro、Bet(甜菜碱、1-羧基-N,N,N-三甲基甲铵氢氧化物)、Glu、Gly、Asp、Sar(肌氨酸)或Suc(琥珀酸)。在某些此类实施方案中，Xaa1是带负电的氨基酸，诸如Asp或Glu，通常是Asp。
Xaa2是Arg、Lys、Ala、Cit(瓜氨酸)、Orn(鸟氨酸)、乙酰基化Ser、Sar、D-Arg和D-Lys。在某些实施方案中，Xaa2是带正电的氨基酸，诸如Arg或Lys，通常是Arg。
Xaa3是Val、Ala、Leu、Nle(正亮氨酸)、Ile、Gly、Lys、Pro、羟基Pro(羟基脯氨酸)、Aib(2-氨基异丁酸)、Acpc或Tyr。在某些实施方案中，Xaa3是脂肪族氨基酸诸如Val、Leu、Ile或Nle，通常是Val或Nle。
Xaa4是Tyr、Tyr(PO3)、Thr、Ser、homoSer(高丝氨酸)、azaTyr(氮 杂-α1-高-L-酪氨酸)或Ala。在某些实施方案中，Xaa4是羟基取代的氨基酸，诸如Tyr、Ser或Thr，通常是Tyr。
Xaa5是Ile、Ala、Leu、norLeu、Val或Gly。在某些实施方案中，Xaa5是脂肪族氨基酸，诸如Val，Leu，Ile或Nle，通常是Ile。
Xaa6是His、Arg或6-NH2-Phe(6-氨基苯基丙氨酸)。在某些实施方案中，Xaa6是完全或部分带正电的氨基酸诸如Arg或His。
Xaa7是Cys、Pro或Ala。
在某些实施方案中，Xaa1-Xaa7的一个或多个与天然存在的Ang-(1-7)中相应的氨基酸相同。在某些此类实施方案中，所有而非Xaa1-Xaa7的一个或两个与天然存在的Ang-(1-7)中相应的氨基酸相同。在其它实施方案中，所有Xaa1-Xaa6与天然存在的Ang-(1-7)中相应的氨基酸相同。
在某些实施方案中，Xaa3是Nle。当Xaa3是Nle时，Xaa1-Xaa2和Xaa4-7的一个或多个可任选地与天然存在的Ang-(1-7)中相应的氨基酸相同。在某些此类实施方案中，所有而非Xaa1-Xaa2和Xaa4-7的一个或两个与天然存在的Ang-(1-7)中相应的氨基酸相同。在其它实施方案中，所有Xaa1-Xaa2和Xaa4-7与天然存在的Ang-(1-7)中相应的氨基酸相同，从而产生氨基酸序列：Asp-Arg-Nle-Tyr-Ile-His-Pro(SEQ ID NO:2)。
在某些实施方案中，所述肽具有氨基酸序列Asp-Arg-Nle-Tyr-Ile-His-Pro(SEQ ID NO:2)。
在某些实施方案中，所述肽具有氨基酸序列Asp-Arg-Val-Ser-Ile-His-Cys(SEQ ID NO:6)或Asp-Arg-Val-ser-Ile-His-Cys(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，如本文所用的线性血管紧张素(1-7)肽是具有 Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7-Phe8-His9(SEQ ID NO:23)序列的肽，所述序列与Ang(1-9)的序列相同。在一些实施方案中，血管紧张素(1-7)肽是Ang(1-9)的衍生物。对于示例性Ang(1-9)肽，包括Ang(1-9)衍生物，参见美国专利公布2012/0172301中，其公开内容在此通过引用并入。
在一些实施方案中，线性血管紧张素(1-7)肽是具有氨基酸序列of Ala1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:24)的肽。另外来自于SEQ ID NO:24的序列可参见欧洲专利申请2,264,048，其公开的内容在此通过引用并入。
另外考虑了本文所述的线性肽的变型，其中所述变型保持了比较肽的一种或多种功能性质。变型可与本文所述的示例性线性肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
示例性环状血管紧张素(1-7)肽
在某些方面，本发明提供了环状血管紧张素-(1-7)(包含键(诸如对应于Ang中的位置Tyr4和Pro7的氨基酸侧链之间的键)的Ang-(1-7))肽类似物。这些肽类似物通常包含了7种氨基酸残基，但还可包含可裂解的序列。如下详细讨论的那样，本发明包括了其中一种或多种氨基酸被另一种氨基酸(包括片段)取代的片段和类似物。
尽管以下章节根据连接4-和7-位置处的残基的硫醚键描述了本发明的各方面，但应理解其它键(如上所述)可替代硫醚桥兵器其它残基可被环化。硫醚桥也被称为一硫化物桥或在Ala-S-Ala的情况下被称为羊毛硫氨酸。含肽硫醚桥可通过两种具有以下各式之一的氨基酸形成：
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在这些式中，R1、R2、R3、R4、R5和R6独立为-H、烷基(如，C1-C6烷基、C1-C4烷基)或芳烷基，其中烷基和芳烷基被一个或多个卤素、-OH或–NRR’基团任选地取代(其中R和R’独立为–H或C1-C4烷基)。在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立为-H或-CH3， 其中所有都为–H的基团。
在某些实施方案中，本发明提供了根据式(I)的包含硫醚桥的Ang类似物或衍生物。通常，R1、R2、R3和R4独立选自-H和-CH3。根据式(I)的包含硫醚桥的肽可通过例如羊毛硫氨酸抗生素酶(lantibiotic enzyme)或通过二硫化物的硫挤出产生。在一个实例中，挤出硫的二硫化物可通过位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-半胱氨酸或者位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-青霉胺形成(参见，如，Galande,Trent和Spatola(2003)Biopolymers 71,534-551)。
在其它实施方案中，两个氨基酸的键可为式(II)或式(III)中所述的桥。根据式(II)的包含硫醚桥的肽可例如通过经由D-高半胱氨酸在位置4和L-半胱氨酸在位置7形成的二硫化物的硫挤出制备。类似地，根据式(III)的包含硫醚桥的肽可通过例如经由D-半胱氨酸在位置4和L-高半胱氨酸在位置7形成的二硫化物的硫挤出制备。
如上所讨论，本发明的Ang类似物和衍生物的长度和氨基酸组成有差异。本发明的Ang类似物和衍生物优选地具有生物活性或为可蛋白水解活化的非活性前体分子(诸如具有10个氨基酸的血管紧张素(I)如何通过2个氨基酸的切割转化为活性片段)。Ang类似物或衍生物的大小可变化，但通常为约5至10个氨基酸，只要涵盖了包含3-7个Nle-硫醚-环结构的"核心"五聚物片段。本发明的类似物或衍生物的氨基酸序列可变化，通常只要其具有生物活性或可被蛋白水解活化。类似物或衍生物的生物活性可使用本领域已知的方法确定，所述方法包括放射性配体结合研究、体外细胞活化测定和体内实验。参见，例如，Godeny和Sayeski,(2006)Am.J.Physiol.Cell.Physiol.291:C1297-1307；Sarr等,Cardiovasc.Res.(2006)71:794-802；和Koziarz等,(1933)Gen.Pharmacol.24:705-713。
其中仅肽的长度变化的Ang类似物和衍生物包括以下：
命名的4,7-环化类似物[Cyc4-7]Ang-(1-7)，其源自天然Ang-(1-7) (Asp1-Arg2-Val3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7，SEQ ID NO:7)。
命名的4,7-环化类似物[Nle3,Cyc4-7]Ang-(1-10)，其源自天然血管紧张素I(Ang-(1-10))(Asp1-Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8-His9-L eu10，SEQ ID NO:8)；
命名的4,7-环化类似物[Nle3,Cyc4-7]Ang-(1-8)，其源自天然血管紧张素II(Ang-(1-8))(Asp1-Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8，SEQ ID NO:9)；
命名的4,7-环化类似物[Nle3,Cyc4-7]Ang-(2-8)，其源自天然血管紧张素III(Ang-(2-8))(Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8，SEQ ID NO:10)；
命名的4,7-环化类似物[Nle3,Cyc4-7]Ang-(3-8)，其源自天然血管紧张素IV(Ang-(3-8))(Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8，SEQ ID NO:11)；
命名的4,7-环化类似物[Nle3,Cyc4-7]Ang-(1-7)，其源自天然Ang-(1-7)(Asp1-Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7，SEQ ID NO:12)；和
命名的4,7-环化类似物[Nle3,Cyc4-7]Ang-(1-9)，其源自天然Ang-(1-9)(Asp1-Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8-His9，SEQ ID NO:13)。
这些类似物可具有式(I)-(III)所示的硫醚桥的一种作为Cyc4-7部分，例如其中Cyc4和Cyc7由式(I)表示，诸如其中R1-R4各自为–H或–CH3，通常为-H。
与天然血管紧张素肽的氨基酸序列相比，Cyc4-7类似物的位置4和7处的氨基酸被修饰以使得能够引入上示的硫醚环。除了Ang类似物的长度之外，除了位置3、4和7处之外的氨基酸可与天然存在的肽相同或不同，一般只要类似物保留生物功能。对于非活性前体的类似物，如[Cyc4-7]Ang-(l-10)，生物功能是指一种或两种类似物对可 将其裂解为生物活性片段(如Ang-(l-8)或Ang-(l-7))的血管紧张素转化酶的易感性，或者其片段的生物活性。在某些实施方案中，本发明的Ang类似物或衍生物不具有固有功能但抑制一种或多种天然存在的血管紧张素化合物的作用。
在某些实施方案中，本发明的Ang类似物由式(IV)表示：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cyc4-Xaa5-Xaa6-Cyc7(IV,SEQ ID NO:14)
Xaa1是任何氨基酸，但通常为带负电的氨基酸，诸如Glu或Asp，更通常为Asp。
Xaa2是带正电的氨基酸，诸如Arg或Lys，通常为Arg。
Xaa3是脂肪族氨基酸，诸如Leu、Ile或Val，通常为Val。
Cyc4连同Cyc7形成了硫醚桥。Cyc4可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为D-立体异构体。Cyc4(连同Cyc7)的实例显示于式(I)、(II)和(III)中。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基团为–H或–CH3，特别为–H。
Xaa5是脂肪族氨基酸，诸如Leu、Ile或Val，通常为Ile。
Xaa6是His。
Cyc7连同Cyc4诸如在式(I)、(II)或(III)中形成硫醚桥。Cyc7可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为L-立体异构体。Cyc7(连同Cyc4)的实例显示于式(I)、(II)、(III)和(IVIII)中。通常，式(I)、(II),)和(III)及(IV)中的R基团为–H或–CH3，特别为–H。
在某些实施方案中，Xaa1-Xaa6(排除Cyc4和Cyc7)的一个或多个与天然存在的Ang-(1-7)中的相应的氨基酸相同。在某些此类实施方案中，Xaa1-Xaa6的所有并非一个或两个与天然存在的Ang-(1-7)中相应的氨基酸相同。在其它实施方案中，所有Xaa1-Xaa6与天然存在的 Ang-(1-7)中相应的氨基酸相同。
在某些实施方案中，Cyc4和Cyc7独立选自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸)，其中Ala存在于至少一个位置处。因此，环状类似物可具有通过-Ala4-S-Ala7-形成的硫醚键(式(I)，其中R1-R4各自为-H)；-Ala4-S-Abu7-(式(I)：R1-R3为-H且R4为-CH3)或-Abu4-S-Ala7-(式(I)：R1、R3和R4为–H且R2为–CH3)。环状类似物的特定实例包括-Abu4-S-Ala7-或-Ala4-S-Ala7-键。
在某些实施方案中，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥的Ang-(1-7)类似物，其具有氨基酸序列Asp-Arg-Val-Abu-Ile-His-Ala(SEQ ID NO:15)或氨基酸序列Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Ala(SEQ ID NO:16)，其由以下结构图表示：
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在某些实施方案中，本发明的Ang类似物或衍生物由式(IV)表示：
Xaa1-Xaa2-Nle3-Cyc4-Xaa5-Xaa6-Cyc7-Xaa8-Xaa9-Xaa10(IV，SEQ ID NO:17)
如上所讨论，Xaa1、Xaa2、Xaa8、Xaa9和Xaa10的一个或多个在某些实施方案中不存在。例如，(1)Xaa10不存在，(2)Xaa9和Xaa10不存在，(3)Xaa8、Xaa9和Xaa10不存在，(4)Xaa1不存在，(5)Xaa1和Xaa10不存在，(6)Xaa1、Xaa9和Xaa10不存在，(7)Xaa1、Xaa8、Xaa9和Xaa10不存在，(8)Xaa1和Xaa2不存在，(9)Xaa1、Xaa2和Xaa10不存在，(10)Xaa1、Xaa2、Xaa9和Xaa10不存在，或(11)Xaa1、Xaa2、Xaa8、Xaa9和Xaa10不存在。对于这些实施方案的每一个，剩下的氨基酸具有下述值。
Xaa1当存在时是任何氨基酸，但通常是带负电的氨基酸，诸如Glu或Asp，更通常为Asp。
Xaa2当存在时是带正电的氨基酸，诸如Arg或Lys，通常是Arg。
Nle3是正亮氨酸。
Cyc4连同Cyc7形成硫醚桥。Cyc4可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为D-立体异构体。Cyc4(连同Cyc7)的实例示于式(I)、(II)和(III)中。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基团是–H或–CH3，特别是–H。
Xaa5是脂肪族氨基酸，诸如Leu、Nle、Ile或Val，通常为Ile。
Xaa6是His。
Cyc7连同Cyc4在式(I)、(II)或(III)中形成了硫醚桥。Cyc7可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为L-立体异构体。Cyc7(连同Cyc4)的实例示于式(I)、(II)和(III)中。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基团为–H或–CH3，特别为–H。
Xaa8当存在时为除了Pro之外的氨基酸，通常是Phe或Ile。在 某些实施方案中，Ile产生了Ang(1-8)的抑制剂。在某些实施方案中，Phe保持了Ang(1-8)或Ang(1-10)的生物活性。
Xaa9当存在时为His。
Xaa10当存在时为脂肪族残基，例如Ile、Val或Leu，通常为Leu。
在某些实施方案中，Xaa1-Xaa10的一个或多个(排除了Nle3、Cyc4和Cyc7)与天然存在的Ang中(包括Ang-(1-7)、Ang(1-8)、Ang(1-9)、Ang(1-10)、Ang(2-7)、Ang(2-8)、Ang(2-9)、Ang(2-10)、Ang(3-8)、Ang(3-9)和Ang(3-10)相应的氨基酸相同。在某些此类实施方案中，Xaa1-Xaa10的所有而非一个或两个(对于存在的那些)与天然存在的Ang中相应的氨基酸相同。在其它实施方案中，所有的Xaa1-Xaa10(对于存在的那些)与天然存在的Ang中相应的氨基酸相同。
在某些实施方案中，Cyc4和Cyc7独立选自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸)，其中Ala存在于至少一个位置处。因此，涵盖了包含由-Ala4-S-Ala7-形成的硫醚键的环状类似物(式(I)，其中R1-R4各自为-H)；由-Ala4-S-Abu7-形成的硫醚键的环状类似物(式(I)：R1-R3为-H且R4为-CH3)或由-Abu4-S-Ala7-形成的硫醚键的环状类似物(式(I)：R1、R3和R4为–H且R2为–CH3)。特定的环状类似物包含-Abu4-S-Ala7-或-Ala4-S-Ala7-键。
特别地，本方面提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥的An g-(l-7)类似物或衍生物，其具有氨基酸序列Asp-Arg-Nle-Abu-Ile-His-Ala(SEQ ID NO:18)或氨基酸序列Asp-Arg-Nle-Ala-Ile-His-Ala(SE Q ID NO:19)。
在另一方面，本发明提供了具有Ang-(l-8)拮抗活性的在位置4和位置7之间具有硫醚桥的Ang-(l-8)类似物或衍生物，特别是具有氨基酸序列Asp-Arg-Nle-Abu-Ile-His-Ala-Ile(SEQ ID NO:20)、氨基酸序列Asp-Arg-Nle-Ala-Ile-His-Ala-Ile(SEQ ID NO:21)或氨基酸序列 Asp-Arg-Nle-Abu-Ile-His-Ala-Ile(SEQ ID NO:22)的Ang(l-8)类似物或衍生物。
烷基是完全饱和的直链或支链非芳族烃。通常，直链或支链烷基具有1至约20个碳原子，优选1至约10个。直链和支链烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。C1-C4直链或支链烷基也被称为"低级烷基"基团。
芳烷基是被芳基取代的烷基。芳族(芳基)基团包括碳环芳族基团(诸如苯基、萘基和蒽基)和杂芳基(诸如噻唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基和四唑基)。芳族基团还包括其中碳环芳族环或杂芳基环与一种或多种其他芳基环稠合的稠合多环芳族环系统。实例包括苯丙噻吩基、苯丙呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯丙噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。
血管紧张素(1-7)肽(包括衍生物和类似物)可以各种量存在于各种实施方案中。例如，血管紧张素(1-7)肽存在的量范围为约10-1000mg(如，约20mg–1,000mg、30mg–1,000mg、40mg–1,000mg、50mg–1,000mg、60mg–1,000mg、70mg–1,000mg、80mg–1,000mg、90mg–1,000mg、约10-900mg、10-800mg、10-700mg、10-600mg、10-500mg、100-1000mg、100-900mg、100-800mg、100-700mg、100-600mg、100-500mg、100-400mg、100-300mg、200-1000mg、200-900mg、200-800mg、200-700mg、200-600mg、200-500mg、200-400mg、300-1000mg、300-900mg、300-800mg,300-700mg、300-600mg、300-500mg、400mg–1,000mg、500mg–1,000mg、100mg-900mg、200mg–800mg、300mg–700mg、400mg–700mg和500mg–600mg)。在一些实施方案中，血管紧张素(1-7)肽存在的量为或大于约10mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg。在一些实施方案中，血管紧张素(1-7) 肽存在的量为或小于约1000mg、950mg、900mg、850mg、800mg、750mg、700mg、650mg、600mg、550mg、500mg、450mg、400mg、350mg、300mg、250mg、200mg、150mg或100mg。
在一些实施方案中，环状血管紧张素(1-7)肽是环化Ang(1-9)肽或包含SEQ ID NO:24的环化肽。
另外还考虑了本文描述的环肽的变型，其中所述变型保持了比较肽的一种或多种功能性质。环化变型的序列可与本文描述的示例性环肽的任何序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性。
降pH剂
考虑了适用于本发明的降pH剂包括任何药学上可接受的降pH剂或降pH剂的组合，它们a)对胃肠道无毒性，b)能够递送氢离子或能够从环境中诱导更高含量的氢离子，和/或c)能够以足以降低局部肠道pH低于对于那里发现的蛋白酶是最佳的pH的量经口施用。各种测试可用于确定降pH剂是否适用于本发明和多少量是适当的。例如，降pH剂或降pH剂的组合适用于本发明，如果当特定量添加至10毫升0.1M碳酸氢钠溶液时其将溶液的pH降低至不超过5.5、4.7或3.5。在一些实施方案中，可添加一定量的降pH剂或试剂以降低于10毫升0.1M碳酸氢钠溶液中的pH至不超过3.4、3.2、3.0或2.8。
在一些实施方案中，合适的降pH剂或药剂包括至少一种pKa不超过4.2(如，不超过4.0、3.8、3.6、3.4、3.2、3.0或2.8)的降pH剂。适用于本发明的示例性降pH剂包括但不限于羧酸，诸如乙酰水杨酸、乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、富马酸、葡萄糖醛酸、戊二酸、甘油酸、甘氨胆酸(glycocolic)、乙醛酸、异柠檬酸、异戊酸、乳酸、顺丁烯二酸、草酰乙酸、草酰琥珀酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸和缬草酸；氯化铝；氯化锌；氨基酸(或其衍生物)的酸性盐，包括乙酰基谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甜菜碱、肉毒碱、肌 肽、瓜氨酸、肌酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、亚牛磺酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲基组氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、肌氨酸、丝氨酸、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的酸性盐；某些磷酸盐，包括果糖1,6二磷酸盐和葡萄糖1,6二磷酸盐，在某些实施方案中也可为适当的降pH剂。在具体的实施方案中，柠檬酸或酒石酸可用作降pH剂。
任何特定降pH剂或降pH剂的组合所需的量可变化。通常，合适的量可使用本领域已知和本文描述的各种测试测定(例如，于上述的10毫升0.1M碳酸氢钠的溶液中使用pH降低测试)。作为非限制性实例，根据本发明的制剂中所用的降pH剂的合适的量可为或大于约100mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675,mg、700mg、725mg、750mg、775mg、800mg、825mg、850mg、875mg、900mg、925mg、950mg、975mg或1,000mg的量。在其它实施方案中，所用的柠檬酸的量可超过1,000mg。
在一些实施方案中，所用的降pH剂(如，柠檬酸或酒石酸)的合适的量可测量为特定剂型的总重的百分比。作为非限制性实例，降pH剂的合适的量可为或大于固体剂型总重的约10％(如，或大于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)的量。
吸收促进剂
在各种实施方案中，本发明的制剂具有一种或多种吸收促进剂。如本文所用，吸收促进剂是指增加其它组分在被释放其中的水性或亲脂性环境中的溶解度和/或增强活性肽(如，血管紧张素(1-7)肽)经肠壁吸收的试剂。在一些实施方案中，吸收促进剂被称为增溶剂和/或吸收增强剂。
在一些实施方案中，可能具有吸收促进剂的混合物，其中一些提 供增强的溶解度，一些提供增强的吸收及一些提供两者。在给定的环境中可能具有个各种数量的吸收促进剂，包括但不限于一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种吸收促进剂。
表面活性剂是具有增溶剂和吸收增强剂性质的有用的吸收促进剂的实例。在一些实施方案中，当表面活性剂用作吸收促进剂时，它们可为用于在制造过程中促进混合和装载胶囊的游离流动的粉末。在其它实施方案中，当表面活性剂用于增加血管紧张素(1-7)肽的生物利用度时，表面活性剂可选自(a)阴离子表面活性剂，诸如胆固醇衍生物(如胆酸)，(b)阳离子表面剂(如酰基肉毒碱、磷脂等)，(c)非离子表面活性剂，和(d)阴离子表面活性剂和带负电的中和剂的混合物，及其组合。带负电的中和剂包括但不限于酰基肉毒碱、氯化十六烷吡啶等。
在一些实施方案中，酸可溶性胆酸和阳离子表面活性剂将一起用作吸收促进剂。酰基肉毒碱(诸如月桂酰肉碱)、磷脂和胆酸在一些实施方案中可为特别有效的吸收促进剂。
当各种吸收促进剂适用于各种实施方案中时，以下示例性列表意在说明本发明的一些实施发难。在不受限制的情况下，一些合适的吸收促进剂包括：(a)水杨酸盐，诸如水杨酸钠、3-甲氧基水杨酸盐、5-甲氧基水杨酸盐和高香草酸盐；(b)胆酸，诸如牛磺胆酸、牛去氧胆酸、去氧胆酸、胆酸、甘氨胆酸(glycholic)、石胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、熊胆酸、去氢胆酸、夫西地酸等；(c)非离子表面活性剂，诸如聚氧乙烯醚(如Brij 36T、Brij 52、Brij 56、Brij 76、Brij 96、Texaphor A6、Texaphor A14、Texaphor A60等)、p-t-辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X-45、Triton X-100、Triton X-114、Triton X-305等)壬基酚氧基聚氧乙烯(如Igepal CO系列)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如Tween-20、Tween-80等)；(d)阴离子表面活性剂，诸如磺基琥珀酸二辛酯钠；(e)溶血磷脂，诸如溶血卵磷脂和溶血磷脂酰乙醇胺；(f)酰基肉碱、乙酰胆碱和酰基氨基酸，诸如月桂酰基肉毒碱、肉豆蔻酰肉毒碱、棕榈酰肉毒碱、月桂酰基胆碱、肉豆蔻酰胆碱、棕榈酰胆碱、十六烷基赖氨 酸、N-酰基苯丙氨酸、N-酰基甘氨酸等；g)水溶性磷脂，诸如二庚酰磷脂酰胆碱、二辛基磷脂酰胆碱等；(h)中链甘油酯，其为甘油一酯、甘油二脂和甘油三酯的混合物，含有中链长的脂肪酸(辛酸、癸酸和月桂酸)；(i)乙二胺四乙酸；(j)阳离子表面活性剂，诸如氯化十六烷基吡啶；(k)聚乙二醇的脂肪酸衍生物，诸如Labrasol、Labrafac等；和(l)烷基糖，诸如月桂酰基麦芽糖苷、月桂酰基蔗糖、肉豆蔻酰蔗糖、棕榈酰蔗糖等。
在一些实施方案中，一种或多种吸收促进剂将以如以按重量计相对于药物组合物总重(通常不包括肠溶包衣)的百分比测量的量存在。举另外非限制实例的来说，环境中存在的吸收促进剂的量的范围可为0.1至20重量％；0.5至20重量％；1.0至20重量％、2.0至20重量％、3.0至20重量％、4.0至20重量％、5.0至20重量％、5.0至15重量％、5.0至14重量％、5.0至13重量％、5.0至12重量％、5.0至12重量％、5.0至11重量％、5.0至10重量％、6.0至10重量％、7.0至10重量％、8.0至10重量％、9.0至10重量％、5.0至9.0重量％、5.0至8.0重量％、5.0至7.0重量％和5.0至6.0重量％。
在一些实施方案中，一种或多种降pH剂与一种或多种吸收促进剂的比率可为约3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1或前述示例性比率的任何两者之间。给定药物组合物中的所有降pH剂的总重和所有吸收促进剂的总重被包括在前述的示例性比率中。例如，如果药物组合物包括两种降pH剂和三种吸收促进剂，则前述比率将按照两种降pH剂的总组合重量和所有三种吸收促进剂的总组合重量计算。
在一些实施方案中，一种或多种吸收促进剂将在酸性pH(诸如小于pH 5.5)下并且特别在pH 3.0与pH 5.0之间可溶。
保护性媒介物
如本文所用，保护性媒介物是指任何保护性组分和/或结构，诸 如载体、层、包衣或保护活性肽(如，血管紧张素(1-7)肽)免受胃蛋白酶的其它媒介物。通常，保护性媒介物最终溶解，使得特定剂型中的活性和其它成分可释放。常见形式的保护性媒介物是肠溶包衣。在一些实施方案中，合适的肠溶包衣可预防本发明的药物组合物在0.1N HCl中分解至少两小时，然后能够使得药物组合物的所有组分在溶解浴中的pH增加至6.3之后在三十分钟内完全释放，其中所述组合物以每分钟100转旋转。
许多肠溶包衣是本领域已知的，并且在一个或多个实施方案中使用。肠溶包衣的非限制性实例包括邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基甲基乙基纤维素丁二酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素和甲基丙烯酸-甲基甲基丙烯酸酯共聚物。在一些实施方案中，将血管紧张素(1-7)肽、吸收促进剂(诸如增溶剂和/或一种或多种吸收增强剂及一种或多种降pH剂)包含在足够粘的保护性浆料中使得本实施方案的组分的保护的通道通过胃。
在将本发明的活性和其它组分装载在胶囊中之后，可将合适的肠溶包衣例如应用给胶囊。在其它实施方案中，将肠溶包衣涂覆在片剂的外部或涂覆在活性组分的颗粒的外表面，然后将其压制为片剂形式或装载在胶囊中。
在一些实施方案中，可能希望本发明的所有组分可从载体或媒介物中释放，并尽可能同时溶解于肠道环境中。在一些实施方案中，媒介物或载体还优选在小肠中释放活性组分，其中相较于相同的吸收增强剂随后在结肠中释放增加跨细胞或细胞旁路运输的吸收增强剂更不可能引起不希望的副作用。然而，应该理解，本发明据信在结肠以及在小肠中都有效。除了以上讨论的那些媒介物或载体之外的多种媒介物或载体为本领域已知的。
在一些实施方案中，可能希望(特别是在优化本发明的组分如何同时释放时)保持较少量的肠溶包衣。在一些实施方案中，肠溶包衣 增加了不超过30％的药物组合物剩余物的重量(诸如固体剂型)("剩余物"为除了肠溶包衣本身之外的药物组合物)。在其它实施方案中，肠溶包衣增加了小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％或小于10％。在一些实施方案中，保护性媒介物诸如肠溶包衣的组成量为或小于药物组合物(如，固体剂型)总重的约25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％。
剂型
如本文所用，剂型是指活性药物组分和非药物组分的混合物。各种剂型可根据本发明使用，包括但不限于液体剂型、固体剂型和半固体剂型。常见剂型包括丸剂、片剂、胶囊剂、饮剂或糖浆剂。在一些实施方案中，使用诸如丸剂、片剂或胶囊剂的固体剂型。
通常，特别需要的剂型提供了同时释放血管紧张素-(1-7)肽、降pH剂和吸收促进剂。这是极其需要的，因为当酸在与释放肽相近的时间释放时，所述酸最能够降低不需要的对肽的蛋白水解攻击。通过施用为单一丸剂、片剂或胶囊剂的本发明的所有组分可最容易实现近乎同时释放。
各种实施方案可任选地包括具有常见已知尺寸和量的常见的药物赋形剂，诸如稀释剂、聚糖(glycant)、润滑剂、明胶胶囊剂、防腐剂、着色剂等。示例性非限制性赋形剂包括pro-盐、polyplastum和硬脂富马酸钠。在一些实施方案中，包含另一种肽(诸如白蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、其它动物或植物蛋白等)以减少非特异性吸附(如，血管紧张素(1-7)肽与肠粘膜屏障的结合)，从而降低昂贵肽活性剂的必需浓度。当添加时，另外的肽通常为相对于总药物组合物(排除保护性媒介物)的重量1.0至10.0重量％。通常，这种另外的肽并不具有生理活性，并且最优选为食物肽诸如大豆肽等。不希望被理论所束缚， 该第二肽还可通过作为期望与用于蛋白酶相互作用的肽活性剂竞争的蛋白酶清除剂来增加生物利用度。第二肽还有助于通过肺的活性化合物通道。
在一些实施方案中，一种或多种降pH剂、血管紧张素(1-7)肽、一种或多种吸收促进剂及其它赋形剂(在每个类别中无论是单一化合物还是多种化合物)应该均匀地分散于剂型中。在其它实施方案中，剂型可包括颗粒，所述颗粒包含了均匀分散于所述粘合剂中的血管紧张素(1-7)肽、降pH剂和吸收促进剂的药物粘合剂。在其它实施方案中，颗粒还可由有机酸的均一层、增强剂层和肽层围绕的酸性核心组成，所述肽层被有机酸的外层所围绕。颗粒可从由本发明的药物粘合剂诸如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素连同降pH剂、吸收促进剂和肽活性剂组成的水性混合物制备。
如所述，各种实施方案可具有不同量的成分以及不同成分。不考虑具体实施方案的配方，此实施方案中存在的所有成分的总重可落入某些重量范围中，诸如约500-1500(如，约500-1200mg、500-1000mg、600-1500mg、600-1200mg、600-1000mg、700-1500mg、700-1200mg、700-1000mg、800-1500mg、800-1200mg、800-1000mg)。在一些实施方案中，合适的固体剂型的总重为或大于约500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg或1500mg。在一些实施方案中，合适的固体剂型的总重为或小于约2000mg、1900mg、1800mg、1700mg、1600mg、1500mg、1400mg、1300mg、1200mg、1100mg、1000mg、900mg、800mg、700mg、600mg或500mg。
实施例
实施例1.血管紧张素(1-7)肽的经口递送
该实施例说明了血管紧张素(1-7)可使用根据本发明的示例性制剂有效经口递送。特别地，经口递送血管紧张素(1-7)肽的可行性通过 将其在液体制剂中经由十二指肠内注射(ID)施用给麻醉大鼠得以说明。该模型模拟了从经口递送的肠溶包衣的固体剂型(诸如胶囊剂或片剂)期望的释放和吸收。
首先，雌性Sprague-Dawley大鼠中的基线药代动力学曲线通过皮下(SC)施用于磷酸盐缓存盐水(PBS)中的血管紧张素(1-7)来获得。血样(0.6ml)从植入右颈动脉的套管在注射肽之前和之后5、10、20、30、60和90分钟获得，并用等体积的肝素化盐水替代。
提取后，然后将样品转移至含有蛋白酶抑制剂混合物的冰冷却的管中。将样品保持在冰上直至将它们在4℃下离心以获得血浆。然后将血浆上清液在-70℃下冷冻直至使用LC-MS测定分析。
表1总结了在指定的时间点和非隔室(non-compartmental)PK值下获得的示例性各基线A(1-7)水平。向三只大鼠施用0.3mL的10mg/mL A(1-7)皮下注射剂。A(1-7)的药代动力学使用非隔室模型确定，其中确定各自的药代动力学。计算每个时间点的平均浓度，并且估计这些平均值的PK值。在施用后约10至90分钟达到Tmax。对于这一治疗组来说，半衰期为约15分钟。观察期间的总平均A(1-7)暴露为614ng*min/mL，范围为585至656ng*min/mL。
表1：
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然后在模拟肽通过肠溶胶囊释放至肠的大鼠模型中评估血管紧张素(1-7)肽(如，TXA127)的经口递送。简而言之，可通过手术暴露麻醉大鼠的十二指肠，并且血管紧张素(1-7)肽通过27规格针头递送至十二指肠内。通过ID施用于PBS中的血管紧张素(1-7)来获得基线。将血样在肽施用后的5、10、20、40、60和90分钟从颈动脉去除。随后，将血管紧张素(1-7)肽于400mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)和月桂酰基-L-肉毒碱(LLC)(10mg/ml)(一种模拟肠溶胶囊内含物的制剂)中ID施用。为了将大鼠循环中的TXA127的稳定性最大化，可将卡托普利(如，0.5mg/ml或5mg/ml)添加至制剂。在与基线研究相同的时间点取血样，并入上所述处理以用于分析。示例性结果总结于表 2-5中。
表2总结了用于PBS中配制的0.3mL的10mg/mL血管紧张素(1-7)(A(1-7))处理的总共6只大鼠的示例性结果。使用非隔室模型测定A(1-7)的药代动力学。计算每个时间点的平均浓度并估计这些平均值的PK值。将这些值与从各PK参数的均值计算而来的平均PK值相比较。在施用之后的约10至60分钟达到。对于该治疗组来说，半衰期的范围为7至140分钟。观察期间的总平均A(1-7)暴露为403ng*min/mL，其范围为123至881ng*min/mL。
表2：
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表3总结了用于含有10mg/mL LLC、400mM柠檬酸盐、150mM NaCl pH 3.5的制剂中的0.3mL的10mg/mL A(1-7)处理的大鼠中出现的示例性A(1-7)浓度。使用非隔室模型测定A(1-7)的药代动力学。此外，计算每个时间点的平均浓度并估计这些平均值的PK值。将这些平均浓度值与从所有各个PK参数的均值计算而来的平均PK值相比较。在施用之后约5至10分钟达到Tmax。对于该处理组来说，半衰期的范围为9.3至173.3分钟。观察期间的总平均A(1-7)暴露为4,274ng*min/mL，其范围为422至19,502ng*min/mL。
表3：
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**-该大鼠的数据未包括在均值或分析中
表4总结了用于含有0.5mg/mL卡托普利、10mg/mL LLC、400mM柠檬酸盐、150mM NaCl(pH 3.5)中的0.3mL的10mg/mL A(1-7)施用的七只大鼠的示例性药代动力学结果。使用非隔式模型测定A(1-7)的药代动力学。计算每个时间点的平均浓度并估计这些平均值的PK值。将这些平均浓度值与从所有各个PK参数的均值计算而来的平均PK值相比较。使用值>1,000ng/mL测定AUC以提供就暴露范围的考量。此外，计算每个时间点的平均浓度之外并估计这些平均值的PK值。在施用之后约5至10分钟达到Tmax。对于该处理组来说，半衰期的范围为11.9至29.1分钟。观察期间的总平均A(1-7)暴露为7,152ng*min/mL，其范围为1,969至9,257ng*min/mL。
表4：
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**-该大鼠的数据未包括在均值或分析中
表5总结了在给予0.3mL于含有0.5mg/mL卡托普利、10mg/mL LLC、400mM柠檬酸盐、150mM NaCl(pH 3.5)的制剂中的10mg/mL A(1-7)的六只大鼠中获得的示例性A(1-7)水平。再次，使用非隔室模型测定A(1-7)的药代动力学参数，其中还测定了各代动力学参数。在该分析中，使用>1,000ng/mL的值测定AUC，以提供就暴露范围的考量。计算每个时间点的平均浓度并估计这些平均值的PK值。在施用之后约5至10分钟达到Tmax。对于该处理组来说，半衰期的范围为7.97至25.6分钟。观察期间的总平均A(1-7)暴露为9,399ng*min/mL，其范围为1,008至26,654ng*min/mL。
表5：
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此外，图1说明了各种施用途径和制剂间AUC值的比较。
如表1-5和图1中所示，与于PBS中递送的血管紧张素(1-7)的基线特征相比，根据本发明的制剂中递送(使用大鼠模型模拟经口递送) 的血管紧张素(1-7)在观察期内具有显著改善的半衰期和总暴露。这些结果说明血管紧张素(1-7)可根据本发明经口递送并在循环中获得治疗有效的生物利用度。
等同形式和范围
本领域技术人员将认识到或能够确定仅使用常规实验、对本文描述的本发明的特定实施方案特异的许多等同物。本发明的范围并非意在限于以上描述，而是如以下权利要求所示出：