除虫菊组培快速繁殖和种质保存技术 本发明涉及植物组织培养技术，具体地，涉及除虫菊组培快速繁殖和种质保存技术。
除虫菊(Pyrethrum cinerariifolium Trev.)，是一种多年生草本植物，它的干花中含有几种很有效的成份--除虫菊酯、瓜叶除虫菊酯和茉莉酮。因其具有高效、安全、残留期短等优点，是一种很有前途的天然杀虫植物。除虫菊的繁殖主要通过两种途径：一是有性繁殖，即通过种子繁衍下一代种苗，如果原有种子的品质优良，可以在一段时期内保持高产。然而除虫菊是自花不孕的，长期利用单一品种的种子，就会引起品种退化；如果是多个品种同时种植，那末原有品种的纯度不右能保持，就会失去原有品种的优势，例如中国江苏省种植除虫菊的情况就是如此。另一种繁殖途径是无性繁殖，即通过分根或扦插的方法，这类繁殖方法受季节性及自然条件的限制，同时一旦母株已感染了根腐病、线虫等，通过无性繁殖很快地造成病菌蔓延，例如东非长期进行无性繁殖，现已造成线虫严重蔓延，品种退化，除虫菊的产量和质量均受到很大影响，正如J.E.Parlevliet and J.G.Brewer在1971年4月的综述和C.W.Warai and all在Pyrethrum Post 1991，18(3)：104中所报导的。因此，很有必要利用组织培养技术来解决除虫菊良种的快速繁殖和种质保存问题。但迄今未有除虫菊良种快速繁殖和种质保存技术成功的报道。
本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提供一种除虫菊良种快速繁殖和种质保存技术，该技术不受自然条件或地区差异的限制，繁殖系数高速度快，有利于品种的复壮、纯化，有利于种质的长期保存。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：
除虫菊良种快速繁殖和种质保存技术，包括选用优良无性系地芽条为外植体，在附加不同种类和浓度激素的MS培养基上直接诱导出芽，然后
A、经增殖、增壮、生根、试管苗出瓶过渡的室内培养到定植、栽培的室外培养；
B、应用组培技术在室内连续培养形成良种种质保存。
上述技术可优选用营养生长期植株的芽条为外植体。
上述技术芽条的取材时期可优选营养生长后期进入生殖生长初期、植株开始抽花枝的季节。
上述技术外植体可优选长度0.5-1.5厘米的芽条。
上述技术中培养基选用MS为基础，蔗糖3％，琼脂0.8-1.0％；芽诱导培养基优选用6-BA1.0或6-BA1.0+NAA0.40；增殖培养基选用MS+6-BA1.0+NAA0.25-0.40mg/l或MS+6-BA0.1-2.0+NAA0.25；增壮培养基选用MS或MS+6-BA0.1+NAA0.25或MS+6-BA0.5+NAA0.25；生根培养基MS或MS+NAA0.2-2.0，PH5.4-5.6，常规高压灭菌；试管苗培养条件优选白天22-28℃，夜间20-25℃；光照12h/d，光照强度1500-1800Lux。
上述技术种质保存时把经过初代培养诱导出的芽单个转入培养基，培养基选用MS为基础，蔗糖3％，琼脂0.8-1.0％，芽诱导培养基优选用6-BA1.0或6-BA1.0+NAA0.40，增殖培养基选用MS+6-BA1.0+NAA0.25-0.40mg/l或MS+6-BA0.1-2.0+NAA0.25。
试管苗出瓶过渡应在生根培养9-12天后，小苗茎叶长4-6厘米时，在出苗前2-3天先打开瓶盖，待叶色加深，移入装有2.5-3.0厘米的无菌珍珠岩的有盖塑料盒中，喷水，移入温室，定期喷0.1％的多菌灵，开始一周使湿度保持在90％以上，其后逐渐打开盒盖，10-15天后移栽到土袋中；在温室生长7-10天后移到室外荫棚内，逐渐增加光照，再经14-20天就可下地，一月左右即可定植田间。
本发明技术措施中关键的原理基于：
利用组织培养技术对良种进行快速繁育所耗时间短，繁殖系数高，每个无性系每代的有效芽的增殖数平均为3.6倍，一年中每个无性系至少可繁殖8代，整个过渡阶段成活率平均为94％计，可以推算出一个芽一年内的有效繁殖为3.68×0.94＝26518株。
本发明通过实际试验表明，组培苗(子代)具有良好遗传稳定性，通过系列的调查研究组培子代苗(一年生植株)与亲代的多项遗传性状进行比较，结果证实了组培子代苗显示了与亲代保持了极大的一致性，子代所表现的多项生物学性状的统计值与亲代十分接近，充分说明组培技术是一种对种质保存理想的技术措施。本发明关键的技术措施在于：
1、取材时间：除虫菊是多年生草本，自8月至下年4月上旬都可取材，例昆明地区冬季无严寒，除虫菊在冬季能继续生长的有利条件，一年中可取材时间长达9个月；
2、培养基配方的选择：培养基的MS为基础，同时根据培养目标和各不同培养阶段的特点及需要附加6-BA和NAA等不同种类；
3、培养时间：从单一的无性系而言，每一代(从取材-试管苗出瓶)的培养周期平均为45天；
4、培养过程：A、室内培养：每一代试管苗阶段必需经过取材、芽诱导、增殖(复壮)、生根至出瓶，平均为45天；
B、室外培养：需通过出瓶过渡、露地过渡、大田定植阶段，平均为60-75天。
5、组培苗的定植：移栽定植要求选择非重质粘土或生红砖土，非低洼地或雨季积水地，要求土地肥国中等有一定灌溉条件；
6、组培苗定植的方法和定植后的田间管理措施与本发明申请者的另一项专利申请“除虫菊丰产栽培技术”相同；
7、本发明技术稳定可靠，可重复性强，经过连续对几十种除虫菊无性系品种培养了6000多株组培苗，这些组培苗生长健壮，抗性强、生长势胜于一般种子培育的苗，获得高产。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、不受自然条件或地区差异的限制：常规繁殖方法受所在地区的气候及地理条件的限制，如在昆明地区培育籽苗，播种时间应在4月-6月底前，过早或过晚播种将直接影响幼苗的成活或籽苗的定植，而本发明是通过组织培养技术繁育的苗，不受气候条件的限制，同时组培苗可以通过转接而长期保存，一旦需要时可以再次进入新一轮的培育。
2、繁殖系数高，速度快，特别是对新引进品种或珍稀品种的繁衍极为有利，例如从国外引进一新品种，用现有技术繁殖，存活率仅为5％，而经过150天的组织培养，从原有的1株发展为300多株组培苗，这是现有技术在短期内无法办到的。
3、有利于品种的复壮、纯化，有益于种质的保存：常规已有技术如无性繁殖方法只能进行繁殖，而无法达到复壮、纯化和种质的长期保存；利用本发明技术，可以对生长过弱、严重感染病毒、病害的品种在配置的培养基上进行脱毒培养，使无性系复壮、纯化，达到种质常期保存的目的。
4、本发明对防止品种退化，进行长期良种种质资源保存是十分有效的技术之一。
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：
选用优良除虫菊优良无性系的芽条为外植体，芽条的取材时期选在营养生长后期进行生殖生长期、植株开始抽花枝的季节，外植体优选长度0.5-1.5厘米的芽条。在附加不同种类和浓度激素的MS培养基上直接诱导出芽，然后通过增殖、增壮、生根、试管苗出瓶过渡、定植、栽培形成快速繁殖；
上述繁殖的培养基选用MS为基础，蔗糖3％，琼脂0.8-1.0％；芽诱导培养基优选用6-BA1.0或6-BA1.0+NAA0.40；增殖培养基选用MS+6-BA1.0+NAA0.25-0.40mg/l或MS+6-BA0.1-2.0+NAA0.25；增壮培养基选用MS或MS+6-BA0.1+NAA0.25或MS+6-BA0.5+NAA0.25；生根培养基MS或MS+NAA0.2-2.0，PH5.4-5.6，常规高压灭菌；试管苗培养条件白天22-28℃，夜间20-25℃；光照12h/d，光照强度1500-1800Lux。
试管苗出瓶过渡选择在生根培养9-12天后，小苗茎叶长4-6厘米时，在出苗前2-3天选打开瓶盖，待叶色加深，移栽入装有2.5-3.0厘米的无菌珍珠岩的有盖塑料盒中，喷水，移入温室，定期喷0.1％的多菌灵，开始一周使湿度保持在90％以上，其后逐渐打开盒盖，10-15天后移栽到土袋中；在温室生长14-20天后移到室外荫棚内，逐渐增加光照，再经7-19天就可下地，一月左右即可定植田间。
进行第一轮的繁育，通过芽诱导、增殖、复壮、生根等培育过程，培育组培苗近6000株，出瓶成活率达95％以上，出瓶后顺利过渡，8月下旬移至露地栽培。定植后的组培苗生长健壮整齐，通过一系列生物学性状调查及统计，组培小苗表现出与上代母株极大的一致性，同一品种的子苗生长势整齐，各无性系之间仍保持原有品系的明显特征。
实施例二：
取用材料：实施例一繁育后保存的组培苗，这批苗通过400多天保存后仍保持良好的生活力，通过转接、增殖等系列培植，已出瓶的顺利通过过渡期，同时可以充分证实，本发明对除虫菊良种种质的保存表现出明显的优益效果。