胰高血糖素类似物.pdf

本发明提供了用于治疗肥胖和体重过重、糖尿病以及其他相关代谢疾病的材料和方法。特别地，本发明提供了在这样的方法中有效的新的胰高血糖素类似物肽。所述肽可通过具有与人胰高血糖素相比提高的对GLP-1受体的选择性来介导其作用。

1.  具有下式的化合物或者其可药用盐或溶剂合物：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是具有下式的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLS(SEQ ID NO：1)
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLSA(SEQ ID NO：2)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFiEWLLSA(SEQ ID NO：4)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLESA(SEQ ID NO：5)
HSQGTFTSDYSRYLDSKAAEDFVEWLLRA(SEQ ID NO：6)
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLLRA(SEQ ID NO：7)
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLS(SEQ ID NO：8)
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLR(SEQ ID NO：9)
HSQGTFTSDYSKYLDEKAAHEFVEWLESA(SEQ I D NO：10)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLS(SEQ ID NO：11)或
HSQGTFTSDYSRYLDSKAAHDFVEWLLSA(SEQ ID NO：12)
H-Aib-HGTFTSDYSKYLESKAAEEFIEWLESA(SEQ ID NO：17)
HSHGTFTSDYSKYLEEKAAHEFIEWLESA(SEQ ID NO：18)
H-Aib-HGTFTSDYSKYLEEKAAHEFVEWLESA(SEQ ID NO：19)；
并且Z不存在或者是具有1至20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自：Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn。

2.  具有下式的化合物或者其可药用盐或溶剂合物：
R¹-X-OH
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
并且X是具有下式的肽：
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA(SEQ ID NO：3)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLSA(SEQ ID NO：13)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA(SEQ ID NO：14)。

3.  具有下式的化合物或者其可药用盐或溶剂合物：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是SEQ ID NO：15的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：15)，
或者如果与SEQ ID NO：15不同，则其在至多3个如下位置处与SEQ ID NO：15不同：
第2位残基选自Ser和D-Ser
第3位残基选自His和Hse
第12位残基是Arg
第15位残基是Glu
第16位残基是Ser
第18位残基是Arg
第20位残基选自His和Glu
第21位残基是Glu
第23位残基是Val
第28位残基选自Arg和Glu
第29位残基不存在；
并且Z不存在或者是具有1至20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自：Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn。

4.  根据权利要求3所述的化合物，其中第20位残基是His。

5.  根据权利要求3所述具有下式的化合物或者其可药用盐或溶剂合物：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是SEQ ID NO：15的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：15)，
或者如果与SEQ ID NO：15不同，则其在以下一个或两个位置处与SEQ ID NO：15不同：
第21位残基是Glu
第23位残基是Val
并且Z不存在或者是具有1至20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自：Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn。

6.  具有下式的化合物或者其可药用盐或溶剂合物：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是SEQ ID NO：16的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLESA(SEQ ID NO：16)
或者如果与SEQ ID NO：16不同，则其在至多3个如下位置处与SEQ ID NO：16不同：
第2位残基选自Ser和D-Ser
第3位残基选自His和Hse
第12位残基是Arg
第15位残基是Glu
第16位残基是Glu
第18位残基是Arg
第20位残基选自Lys和His
第21位残基是Glu
第23位残基是Ile
第28位残基选自Arg和Glu
第29位残基不存在
并且Z不存在或者是具有1至20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自：Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn。

7.  根据权利要求6所述具有下式的化合物或者其可药用盐或溶剂合物：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是SEQ ID NO：16的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLESA(SEQ ID NO：16)
或者如果与SEQ ID NO：16不同，则其在以下一个或两个位置处与SEQ ID NO：16不同：
第21位残基是Glu
第23位残基是Ile
并且Z不存在或者是具有1至20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自：Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn。

8.  根据权利要求3至7中任一项所述的化合物，其中X是具有以下序列的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：15)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLESA(SEQ ID NO：16)
H-Aib一QGTFTSDYSKYLEEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：20)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAEDFIEWLESA(SEQ ID N0：21)
HSQGTFTSDYSKYLEEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID N0：22)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAHDFVEWLESA(SEQ ID NO：23)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAEDFVEWLESA(SEQ ID NO：24)或
H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：25)。

9.  根据权利要求1至8中任一项所述的化合物或者其可药用盐或溶剂合物，所述化合物具有下式：
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLS-OH
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLSA-OH
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLLSA-NN₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLESA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSRYLDSKAAEDFVEWLLRA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLLRA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLS-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLR-OH
H-HSQGTFTSDYSKYLDEKAAHEFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLS-OH
H-HSQGTFTSDYSRYLDSKAAHDFVEWLLSA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLESKAAEEFIEWLESA-OH
H-HSHGTFTSDYSKYLEEKAAHEFIEWLESA-OH
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLEEKAAHEFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLEEKAAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAEDFIEWLESA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLEEKAAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAHDFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAEDFVEWLESA-NH₂
H-H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA-NH₂。

10.  根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中所述肽X或Z中的一个或更多个氨基酸侧链与亲脂性取代基缀合。

11.  根据权利要求1至8或权利要求10中任一项所述的化合物，其中所述肽X或Z中的一个或更多个氨基酸侧链与聚合物取代基缀合。

12.  根据权利要求10或11所述的化合物，其中肽X具有下式：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLS
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLESA
HSQGTFTSDYSRYLDSK＊AAEDFVEWLLRA
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAEDFVEWLLRA
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLS
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLR
HSQGTFTSDYSKYLDEK＊AAHEFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊RAKDFIEWLLS
HSQGTFTSDYSRYLDSK＊AAHDFVEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLRA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊RAKDFIEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAEDFVEWLESA
H-Aib-HGTFTSDYSKYLESKAAEEFIEWLESA
HSHGTFTSDYSKYLEEKAAHEFIEWLESA
H-Aib-HGTFTSDYSKYLEEKAAHEFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLEEK＊AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAEDFIEWLESA
HSQGTFTSDYSKYLEEK＊AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAHDFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAEDFVEWLESA
H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLESA
其中“＊”指示亲脂性取代基或聚合物取代基的位置。

13.  根据权利要求12所述的化合物或者其可药用盐或溶剂合物，所述化合物具有下式：
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLS-OH
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLLSA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLESA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSRYLDSK＊AAEDFVEWLLRA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAEDFVEWLLRA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLS-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLR-OH
H-HSQGTFTSDYSKYLDEK＊AAHEFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊RAKDFIEWLLS-OH
H-HSQGTFTSDYSRYLDSK＊AAHDFVEWLLSA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLRA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊RAKDFIEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAEDFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLESK＊AAEEFIEWLESA-OH
H-HSHGTFTSDYSKYLEEK＊AAHEFIEWLESA-OH
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLEEK＊AAHEFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLEEK＊AAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAEDFIEWLESA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLEEK＊AAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAHDFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAEDFVEWLESA-NH₂
H-H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLESA-NH₂
其中“＊”指示亲脂性取代基或聚合物取代基的位置。

14.  根据权利要求12所述的化合物，其中肽X具有下式：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA
HSQGTFTSDYSRYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLR
HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLS
HSQGTFTSDYSRYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLRA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA
H-Aib-HGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEEFIEWLESA
HSHGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFIEWLESA
H-Aib-HGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLEEK-(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFIEWLESA
HSQGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA
H-DSer-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA。

15.  根据权利要求14所述的化合物或者其可药用盐或溶剂合物，所述化合物具有下式：
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS-OH(化合物1)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA-OH(化合物2)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K)十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLLSA-NH₂(化合物4)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA-NH₂(化合物5)
H-HSQGTFTSDYSRYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA-NH₂(化合物6)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA-NH₂(化合物7)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS-NH₂(化合物8)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLR-OH(化合物9)
H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA-NH₂(化合物10)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLS-OH(化合物11)
H-HSQGTFTSDYSRYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA-NH₂(化合物12)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLRA-OH(化合物3)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA-OH(化合物13)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-OH(化合物14)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物15)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA-NH₂(化合物16)
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEEFIEWLESA-OH(化合物17)
H-HSHGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFIEWLESA-OH(化合物18)
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA-NH₂(化合物19)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物20)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFIEWLESA-NH₂(化合物21)
H-HSQGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物22)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA-NH₂(化合物23)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA-NH₂(化合物24)
H-H-DSer-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物25)。

16.  组合物，其包含与载体混合的根据权利要求1至15中任一项所述的化合物。

17.  根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物，并且所述载体是可药用载体。

18.  根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其用于医学治疗方法。

19.  根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其用于在有此需要的个体中预防体重增长或促进体重减轻的方法。

20.  根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其用于在有此需要的个体中降低循环LDL水平和/或提高HDL/LDL比值的方法。

21.  根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其用于治疗由体重过重引起或以体重过重为特征之病症的方法。

22.  根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其用于预防或治疗以下疾病的方法：肥胖、病态肥胖、术前病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病、肥胖诱发的睡眠呼吸暂停、糖尿病、代谢综合征、高血压、致动脉粥样硬化性血脂异常、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、卒中或微血管疾病。

23.  根据权利要求18至22中任一项所述应用的化合物，其中所述化合物作为组合治疗的一部分与用于治疗糖尿病、肥胖、血脂异常或高血压的药剂一起施用。

24.  根据权利要求23所述应用的化合物，其中所述用于治疗糖尿病的药剂是双胍类(例如，二甲双胍)、磺酰脲类、美格列奈类或格列奈类(例如，那格列奈)、DPP-IV抑制剂、格列酮类、不同的GLP-1激动剂、胰岛素或胰岛素类似物。

25.  根据权利要求23所述应用的化合物，其中所述用于治疗肥胖的药剂是胰高血糖素样肽受体1激动剂、肽YY受体激动剂或其类似物、大麻素受体1拮抗剂、脂肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素浓集激素受体1拮抗剂。

26.  根据权利要求23所述应用的化合物，其中所述用于治疗高血压的药剂是血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、利尿剂、β-阻断剂或钙通道阻断剂。

27.  根据权利要求23所述应用的化合物，其中所述用于治疗血脂异常的药剂是他汀类、贝特类、烟酸类和/或胆固醇吸收抑制剂。

28.  核酸，其编码根据权利要求1至15中任一项所述的化合物的氨基酸序列X或X-Z。

29.  表达载体，其包含权利要求28所述的核酸序列。

30.  宿主细胞，其包含权利要求28所述的核酸或权利要求29所述的表达载体，并且能够表达和任选地分泌具有氨基酸序列X或X-Z的化合物。

31.  治疗用药盒，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的化合物或根据权利要求14或15所述的组合物。

32.  合成根据权利要求1至15中任一项所述的化合物的方法。

33.  产生根据权利要求1至15中任一项所述的化合物的方法，所述方法包括在适于表达所述肽序列X或X-Z的条件下培养根据权利要求30所述的宿主细胞并纯化由此产生的化合物。

34.  产生根据权利要求1至15中任一项所述的化合物的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达包含与所述序列X或X-Z具有一个或更多个差异的肽序列，任选地纯化由此产生的化合物，以及添加或修饰一个或更多个氨基酸以产生所述化合物。

35.  根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其包括对所述序列X或X-Z进行修饰以引入一个或更多个亲脂性部分和/或聚合物部分。

胰高血糖素类似物
技术领域
本发明涉及胰高血糖素类似物及其例如在治疗肥胖和体重过重、糖尿病及其他代谢疾病中的医疗用途。
背景技术
前胰高血糖素原(pre-proglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在组织中被差异性加工而形成多种结构上相关的胰高血糖素原衍生肽，包括胰高血糖素(Glu)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(oxyntomodulin，OXM)。这些分子参与很多种生理功能，包括葡萄糖内稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠生长，以及食物摄取调节。
胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的53至81位氨基酸。胃泌酸调节素(OXM)是37个氨基酸的肽，其包含胰高血糖素的全部29个氨基酸序列和八肽羧基端延伸(前胰高血糖素原的82至89位氨基酸，被称为“间插肽1(intervening peptide 1)”或IP-1)。GLP-1的主要生物学活性片段作为30个氨基酸、对应于前胰高血糖素原之98至127位氨基酸的C端酰胺化肽而产生。
胰高血糖素帮助维持血液中的葡萄糖水平，这通过与肝细胞上的胰高血糖素受体结合并经由糖原分解而使肝释放以糖原形式储存的葡萄糖来实现。随着这些储存的消耗，胰高血糖素刺激肝脏通过糖异生作用合成额外的葡萄糖。这些葡萄糖释放到血流中，从而防止发生低血糖。
GLP-1通过提高葡萄糖刺激的胰岛素分泌来降低升高的血糖水平，并且主要通过降低食物摄取来促进体重减轻。
OXM响应于食物摄入而释放到血液中，并与膳食的卡路里含量成比例。已显示OXM在人中抑制食欲并抑制食物摄取(Cohen等，Journal of Endocrinology and Metabolism，88，4696-4701，2003；WO 2003/022304)。除了与GLP-1类似的那些食欲抑制作用以外，OXM一定还通过其他机制影响体重，因为用胃泌酸调节素处理的大鼠与对饲(pair-fed)大鼠相 比显示更少的体重增长(Bloom，Endocrinology 2004，145，2687)。用OXM处理肥胖啮齿类动物还改善了它们的葡萄糖耐量(Parlevliet等，Am J Physiol Endocrinol Metab，294，E142-7，2008)并抑制了体重增长(WO 2003/022304)。
OXM活化胰高血糖素受体和GLP-1受体二者，其对胰高血糖素受体的效力是GLP-1受体的2倍，但是比天然胰高血糖素和GLP-1对于其各自受体的效力低。人胰高血糖素也能够活化这两种受体，但相对于GLP-1受体而言对胰高血糖素受体有强偏好性。另一方面，GLP-1不能活化胰高血糖素受体。胃泌酸调节素的作用机制还不是很清楚。尤其是，不了解该激素的一些肝外作用是通过GLP-1受体和胰高血糖素受体介导，还是通过一种或更多种尚未鉴定出的受体介导。
已显示另一些肽结合并活化胰高血糖素受体和GLP-1受体二者(Hjort等，Journal of Biological Chemistry，269，30121-30124，1994)，而且抑制体重增长并降低食物摄取(参见，例如WO 2006/134340、WO 2007/100535、WO 2008/10101、WO 2008/152403、WO 2009/155257、WO 2009/155258、WO2010/070252、WO2010/070253、WO2010/070255、WO2010/070251、WO2011/006497、WO2011/160630、WO2011/160633)。
肥胖是日益增多的全球性健康问题，其与多种疾病有关，特别是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、某些类型的癌症和骨关节炎。因此，已发现肥胖降低预期寿命。根据世界卫生组织所作的2005预测，全世界有4亿成人(年龄＞15)被划归为肥胖。在美国，目前认为肥胖是仅次于吸烟的可预防性死亡(preventable death)之第二大原因。
肥胖的增多驱使糖尿病的增多，约90％患2型糖尿病的人可划归为肥胖。全世界有2.46亿人患有糖尿病，预计到2025年将会有3.8亿人患糖尿病。许多人还有另外的心血管风险因素，包括高/异常LDL和甘油三酸酯以及低HDL。
发明概述
在第一方面，本发明提供了具有下式的化合物或者其可药用盐或溶剂合物：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是具有下式的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLS(SEQ ID NO：1)
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLSA(SEQ ID NO：2)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLLSA(SEQ ID NO：4)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLESA(SEQ ID NO：5)
HSQGTFTSDYSRYLDSKAAEDFVEWLLRA(SEQ ID NO：6)
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLLRA(SEQ ID NO：7)
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLS(SEQ ID NO：8)
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLR(SEQ ID NO：9)
HSQGTFTSDYSKYLDEKAAHEFVEWLESA(SEQ ID NO：10)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLS(SEQ ID NO：11)
HSQGTFTSDYSRYLDSKAAHDFVEWLLSA(SEQ ID NO：12)
H-Aib-HGTFTSDYSKYLESKAAEEFIEWLESA(SEQ ID NO：17)
HSHGTFTSDYSKYLEEKAAHEFIEWLESA(SEQ ID NO：18)
H-Aib-HGTFTSDYSKYLEEKAAHEFVEWLESA(SEQ ID NO：19)；
并且Z不存在或者是具有1-20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn。
在第二方面，本发明提供了具有下式的化合物或者其可药用盐或溶剂合物：
R¹-X-OH
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
并且X是SEQ ID NO：3、13或14的肽：
HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA(SEQ ID NO：3)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLSA(SEQ ID NO：13)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA(SEQ ID NO：14)
在第三方面，本发明提供了具有下式的化合物或者其可药用盐或溶 剂合物：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是SEQ ID NO：15的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：15)，
或者如果与SEQ ID NO：15不同，则在至多3个如下位置处与SEQ ID NO：15不同：
第2位残基选自Ser和D-Ser
第3位残基选自His和Hse
第12位残基是Arg
第15位残基是Glu
第16位残基是Ser
第18位残基是Arg
第20位残基选自His和Glu
第21位残基是Glu
第23位残基是Val
第28位残基选自Arg和Glu
第29位残基不存在；
并且Z不存在或者是具有1-20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn。
在某些实施方案中，第20位残基不可变并且是His。
所述化合物可具有下式：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是SEQ ID NO：15的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：15)，
或者如果与SEQ ID NO：15不同，则其在以下一个或两个位置处与SEQ ID NO：15不同：
第21位残基是Glu
第23位残基是Val
并且Z不存在或者是具有1-20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn；
或者其可药用盐或溶剂合物。
在第四方面，本发明提供了具有下式的化合物或者其可药用盐或溶剂合物：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是SEQ ID NO：16的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLESA(SEQ iD NO：16)
或者如果与SEQ ID NO：16不同，则其在至多3个如下位置处与SEQ ID NO：16不同：
第2位残基选自Ser和D-Ser
第3位残基选自His和Hse
第12位残基是Arg
第15位残基是Glu
第16位残基是Glu
第18位残基是Arg
第20位残基选自Lys和His
第21位残基是Glu
第23位残基是Ile
第28位残基选自Arg和Glu
第29位残基不存在
并且Z不存在或者是具有1-20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn。
所述化合物可具有下式：
R¹-X-Z-R²
其中
R¹是H、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R²是OH或NH₂；
X是SEQ ID NO：16的肽：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLESA(SEQ iD NO：16)
或者如果与SEQ ID NO：16不同，则其在以下一个或两个位置处与SEQ ID NO：16不同：
第21位残基是Glu
第23位残基是Ile
并且Z不存在或者是具有1-20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn；
或者其可药用盐或溶剂合物。
本发明第三方面或第四方面的化合物可包含具有以下序列的肽X：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：15)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLESA(SEQ ID NO：16)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLEEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：20)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAEDFIEWLESA(SEQ ID NO：21)
HSQGTFTSDYSKYLEEKAAKDFIEWLESA(SEQ iD NO：22)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAHDFVEWLESA(SEQ ID NO：23)
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAEDFVEWLESA(SEQ ID NO：24)或
H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：25)。
在任意方面，本发明化合物可具有下式：
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLS-OH
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLLSA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLESA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSRYLDSKAAEDFVEWLLRA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLLRA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLS-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLR-OH
H-HSQGTFTSDYSKYLDEKAAHEFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLS-OH
H-HSQGTFTSDYSRYLDSKAAHDFVEWLLSA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAEDFVEWLESA-NH₂
H-Aib-HGTFTSDYSKYLESKAAEEFIEWLESA-OH
H-HSHGTFTSDYSKYLEEKAAHEFIEWLESA-OH
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLEEKAAHEFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLEEKAAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAEDFIEWLESA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLEEKAAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAHDFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAEDFVEWLESA-NH₂
H-H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEKAAKDFIEWLESA-NH₂
或者可以是其可药用盐或溶剂合物。
为避免疑义，在本发明第三方面和第四方面的化合物中，未明确指明允许可变性的那些位置意在为固定的，因此在那些位置仅包含指明的残基。
在本发明的所有方面，肽X或Z(如果存在的话)中的一个或更多个氨基酸侧链可以与亲脂性取代基缀合。
优选地，肽X中一个或更多个氨基酸侧链与亲脂性取代基缀合。
亲脂性取代基可以具有式Z¹，其中Z¹是与X或Z的相关残基的侧链直接缀合(共价连接)的亲脂性部分，或Z¹Z²，其中Z¹是亲脂性部分，Z²是间隔物，并且Z¹通过Z²与X或Z的残基的侧链缀合。
作为替代或补充，肽X或Z(如果存在的话)中的一个或更多个氨 基酸侧链与聚合物取代基缀合。
在某些实施方案中，肽X或X-Z携带仅一个亲脂性取代基和/或仅一个聚合物取代基。
下文对亲脂性取代基和聚合物取代基进行了更详细描述。
亲脂性部分和/或聚合物取代基可与任何合适的残基的侧链缀合。赖氨酸残基可能特别适合，例如12位(如果存在的话)或17位的赖氨酸残基。
因此，肽X可具有下式：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLS
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLESA
HSQGTFTSDYSRYLDSK＊AAEDFVEWLLRA
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAEDFVEWLLRA
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLS
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLR
HSQGTFTSDYSKYLDEK＊AAHEFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊RAKDFIEWLLS
HSQGTFTSDYSRYLDSK＊AAHDFVEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLRA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊RAKDFIEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAEDFVEWLESA
H-Aib-HGTFTSDYSKYLESK＊AAEEFIEWLESA
HSHGTFTSDYSKYLEEK＊AAHEFIEWLESA
H-Aib-HGTFTSDYSKYLEEK＊AAHEFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLEEK＊AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAEDFIEWLESA
HSQGTFTSDYSKYLEEK＊AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAHDFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAEDFVEWLESA
H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLESA
其中“＊”指示亲脂性取代基或聚合物取代基的位置，尤其是亲脂性取代基的位置。
本发明化合物可具有下式：
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLS-OH
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLLSA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLESA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSRYLDSK＊AAEDFVEWLLRA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAEDFVEWLLRA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLS-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLR-OH
H-HSQGTFTSDYSKYLDEK＊AAHEFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊RAKDFIEWLLS-OH
H-HSQGTFTSDYSRYLDSK＊AAHDFVEWLLSA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLRA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAHDFVEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊RAKDFIEWLLSA-OH
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSK＊AAEDFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLESK＊AAEEFIEWLESA-OH
H-HSHGTFTSDYSKYLEEK＊AAHEFIEWLESA-OH
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLEEK＊AAHEFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLEEK＊AAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAEDFIEWLESA-NH₂
H-HSQGTFTSDYSKYLEEK＊AAKDFIEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAHDFVEWLESA-NH₂
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLESK＊AAEDFVEWLESA-NH₂
H-H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEK＊AAKDFIEWLESA-NH₂
或者可以是其可药用盐或溶剂合物。
在某些实施方案中，X具有下式：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFiEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA
HSQGTFTSDYSRYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLR
HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLS
HSQGTFTSDYSRYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLRA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA
H-Aib-HGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEEFIEWLESA
HSHGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFIEWLESA
H-Aib-HGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLEEK-(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFIEWLESA
HSQGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA
H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA
H-DSer-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFiEVVLESA
本发明化合物可以是：
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS-OH(化合物1)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA-OH(化合物2)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFiEWLLSA-NH₂(化合物4)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA-NH₂(化合物5)
H-HSQGTFTSDYSRYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA-NH₂(化合物6)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA-NH₂(化合物7)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS-NH₂(化合物8)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLR-OH(化合物9)
H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA-NH₂(化合物10)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLS-OH(化合物11)
H-HSQGTFTSDYSRYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA-NH₂(化合物12)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLRA-OH(化合物3)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA-OH(化合物13)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-OH(化合物14)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物15)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA-NH₂(化合物16)
H-Aib-HGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEEFIEWLESA-OH(化合物17)
H-HSHGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFIEWLESA-OH(化合物18)
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA-NH₂(化合物19)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物20)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFIEWLESA-NH₂(化合物21)
H-HSQGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物22)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA-NH₂(化合物23)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA-NH₂(化合物24)
H-H-DSer-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物25)
或者可以是其可药用盐或溶剂合物。
对于仅由天然氨基酸构成的那些肽序列X或X-Z，本发明还提供了编码本文限定的肽X或X-Z的核酸(其可以是DNA或RNA)。还提供了包含这种核酸的表达载体，以及包含这种核酸或表达载体的宿主细胞。宿主细胞通常能够表达并任选地分泌所编码的肽X或X-Z。
本发明化合物是胰高血糖素类似物肽。本文中提及胰高血糖素类似物时应根据语境需要解释为提及本发明化合物或者肽X或X-Z。提及本发明化合物时应认为包括其任何可药用盐(例如，乙酸盐或氯化物盐)或溶剂合物，除非上下文另有说明或被排除。
本发明提供了包含与载体混合的本文限定的化合物(包括其可药用盐或溶剂合物，如已经描述的)的组合物、编码肽X或X-Z的核酸、包含所述核酸的表达载体，或者包含所述核酸或表达载体的宿主细胞。在一些优选实施方案中，所述组合物是药物组合物，所述载体是可药用载体。胰高血糖素类似物肽可以是胰高血糖素类似物的可药用盐的形式。
本文描述的化合物尤其可用于预防体重增长或促进体重减轻。“预防”意指在与不进行治疗比较时抑制或降低体重增长，但未必意味着体重 增长完全停止。所述肽可引起食物摄取降低和/或能量消耗提高，导致观察到的对体重的影响。独立于其对体重的影响，本发明化合物可对血糖控制和/或循环胆固醇水平具有有益影响，能够降低循环LDL水平和提高HDL/LDL比值。因此，本发明化合物可用于直接或间接治疗由体重过重导致或以其为特征的任何病症，例如治疗和/或预防肥胖、病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病、肥胖诱发的睡眠呼吸暂停。其还可用于预防由不适当的葡萄糖控制或血脂异常(例如，提高的LDL水平或降低的HDL/LDL比值)引起或以其为特征的病症、糖尿病(尤其是2型糖尿病)、代谢综合征、高血压、致动脉粥样硬化性血脂异常、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、卒中或微血管疾病。它们对于这些病症的作用可由其对于体重的作用所致或与其相关，或者与该作用无关。
本发明还提供了本发明化合物，其用于医学治疗方法，特别是用于治疗上述病症的方法。
本发明还提供了本发明化合物在制备用于治疗上述病症的药物中的用途。
本发明化合物可作为组合治疗的一部分与用于治疗糖尿病、肥胖、血脂异常或高血压的药剂一起施用。
在这种情况下，两种活性剂可一起或分开给予，以及作为同一药物制剂的一部分或作为不同制剂来施用。
因此，本发明化合物可与抗糖尿病剂组合使用，所述抗糖尿病剂包括但不限于双胍类(例如，二甲双胍)、磺酰脲类、美格列奈类(meglitinide)或格列奈类(例如，那格列奈)、DPP-IV抑制剂、格列酮类、胰岛素或胰岛素类似物。胰岛素类似物的实例包括但不限于Lantus^TM、Novorapid^TM、Humalog^TM、Novomix^TM、Actraphane HM^TM、Levemir^TM和Apidra^TM。
本发明化合物还可与抗肥胖剂组合使用，所述抗肥胖剂包括但不限于胰高血糖素样肽受体1激动剂、肽YY或其类似物、大麻素受体1拮抗剂、脂肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素浓集激素受体1拮抗剂。
所述化合物还可与抗高血压剂组合使用，所述抗高血压剂包括但不限于：血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、利尿剂、β-阻断剂或钙通道阻断剂。
所述化合物可与抗血脂异常剂组合使用，所述抗血脂异常剂包括但不限于：他汀类、贝特类、烟酸类或胆固醇吸收抑制剂。
因此，本发明还提供了包含本发明化合物和例如上述抗糖尿病剂、抗肥胖剂、抗高血压剂或抗血脂异常剂的组合物或治疗用药盒(therapeutic kit)。还提供了这样的组合物或治疗用药盒，其用于医学治疗方法，尤其是用于治疗上述病症。
本发明化合物还可通过合成化学制备。因此，本发明提供了合成本发明化合物的方法。
如已经描述的，本发明延伸至编码肽序列X或X-Z的核酸，以及包含上述核酸序列(任选地与指导其表达的序列可操作地连接)的表达载体，以及包含所述核酸或表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞能够表达并任选地分泌本发明化合物。
本发明提供了制备本发明化合物的方法，所述方法包括在适于表达肽序列X或X-Z的条件下培养所述宿主细胞并纯化由此产生的化合物。这在肽仅包含天然氨基酸时特别有用。
当本发明化合物包含一个或更多个非天然氨基酸时，所述方法可包括表达包含与序列X或X-Z具有一个或更多个差异的肽序列，任选地纯化由此产生的化合物，以及添加或修饰一个或更多个氨基酸以产生本发明化合物或者包含氨基酸序列X或X-Z的化合物。
无论使用哪一种方法来制备本发明化合物，其均可包括对序列X或X-Z进行修饰(尤其是引入在本说明书其他地方限定的一个或更多个亲脂性和/或聚合物部分)的一个或更多个另外的步骤。
本发明还提供了本发明的核酸、本发明的表达载体或能够表达并任选地分泌本发明化合物的宿主细胞，其用于医学治疗方法。应理解，所述核酸、表达载体和宿主细胞可用于治疗本文描述的任何可用本发明化合物本身治疗的疾病。因此，提及包含本发明化合物的治疗组合物、施用本发明化合物或本发明化合物的任何治疗用途时，应解释为包括等效使用本发明的核酸、表达载体或宿主细胞，除非上下文另有要求。
发明详述
在本说明书通篇中，使用天然氨基酸的常规单字母和三字母代码以 及其他氨基酸的被普遍接受的三字母代码，例如Aib(α-氨基异丁酸)、Hse(高丝氨酸)、Orn(鸟氨酸)、Dbu(2，4-二氨基丁酸)、Dpr(2，3-二氨基丙酸)。
胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的53至81位氨基酸，并具有如下序列：His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO：26)。胃泌酸调节素(OXM)是37个氨基酸的肽，其包含胰高血糖素的全部29个氨基酸序列和八肽羧基端延伸(前胰高血糖素原的82至89位氨基酸，具有序列Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(SEQ ID NO：27)，并且被称为“间插肽1”或IP-1)，因此人胃泌酸调节素的全长序列是His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala)(SEQ ID NO：28)。GLP-1的主要生物学活性片段作为30个氨基酸、对应于前胰高血糖素原的98至127位氨基酸的C端酰胺化肽而产生。
因此，术语“天然胰高血糖素”是指具有序列Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO：26)的天然人胰高血糖素。
本发明化合物的序列X内的氨基酸可认为在常规N端到C端的方向上从1到29连续编号。因此提及X内的“位置”时应解释为提及天然人胰高血糖素和其他分子内的位置。
本发明化合物可包含1至20个氨基酸的C端肽序列Z，例如以稳定胰高血糖素类似物肽的构象和/或二级结构，和/或使胰高血糖素类似物肽对酶促水解更具抗性，例如WO99/46283中描述的。
如果存在的话，Z表示具有1至20个氨基酸残基的肽序列，例如1至15个，更优选地1至10个，尤其是1至7个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基。在肽序列Z中的每一个氨基酸残基可独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu(2，4-二氨基丁酸)、Dpr(2，3-二氨基丙酸)和Orn(鸟氨酸)。优选地，所述氨基酸残基选自Ser、Thr、Tyr、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn，更优选地仅选自Glu、Lys和Cys。上述氨基酸可具有D-或L-构型，在某些实施方案中，其具有L-构型。特别优选的序列Z是4、5、6或7个连续赖氨酸残基序列(即，Lys₃、Lys₄、Lys₅、Lys₆或Lys₇)，尤其是5或6个连续赖氨酸残基。Z的另一些示例性序列示出在 WO 01/04156中。或者，序列Z的C端残基可以是Cys残基。这可有助于对化合物进行修饰(例如，聚乙二醇化，或与白蛋白缀合)。在这些实施方案中，序列Z可以例如是仅1个氨基酸长(即，Z＝Cys)，或者可以是2、3、4、5、6或甚至更多个氨基酸长。因此，另一些氨基酸在肽X和末端Cys残基间作为间隔物。
肽序列Z与人OXM的IP-1部分的相应序列(其具有序列Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala)具有不超过25％的序列同一性。
给定肽或多肽序列相对于另一多肽序列(例如IP-1)的“氨基酸序列同一性百分比(％)”计算为：当将两者彼此比对时(适当时可引入空位以进行最佳比对)，给定肽序列中与另一种多肽对应序列中相应氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。同一性百分比的值可使用WU-BLAST-2确定(Altschul等，Methods in Enzymology，266：460-480(1996))。WU-BLAST-2采用若干检索参数，其中大部分设置为缺省值。可调整参数设置为如下值：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字阈值(word threshold)(T)＝11。氨基酸序列同一性百分比的值通过WU-BLAST-2确定的匹配的一致残基数除以参照序列的残基总数(忽略通过WU-BLAST-2引入参照序列以使比对计分最大化的空位)再乘以100来确定。
因此，当将Z与IP-1的8个氨基酸进行最佳比对时，其具有不超过2个与IP-1的对应氨基酸一致的氨基酸。
在某些实施方案中，Z不存在。
本发明化合物中的一个或更多个氨基酸侧链可与亲脂性取代基缀合。所述亲脂性取代基可与氨基酸侧链中的原子共价键合，或者可通过间隔物与氨基酸侧链缀合。亲脂性取代基可以与作为肽X的一部分的氨基酸的侧链和/或与作为肽Z的一部分的氨基酸的侧链缀合。
不希望受任何特定理论约束，认为亲脂性取代基与血流中的白蛋白结合，从而保护本发明化合物免受酶降解，从而提高本发明化合物的半衰期。其还可调节化合物例如相对于胰高血糖素受体和/或GLP-1受体的效力。
在某些实施方案中，仅一个氨基酸侧链与亲脂性取代基缀合。在另一些实施方案中，两个氨基酸侧链分别与亲脂性取代基缀合。在另一些实施方案中，三个或甚至更多个氨基酸侧链各自与亲脂性取代基缀合。当化 合物包含两个或更多个亲脂性取代基时，这些亲脂性取代基可以是相同的或不同的。
亲脂性取代基可包含亲脂性部分Z¹或由其组成，所述亲脂性部分可与氨基酸侧链中的原子直接共价结合，或者可通过间隔物Z²与氨基酸侧链缀合。
在此使用术语“缀合”来描述一个可辨别的化学部分与另一个可辨别的化学部分的物理连接，以及这样的部分之间的结构关系。其不应理解为任何具体的合成方法。
亲脂性部分可通过酯、磺酰基酯、硫酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲或磺酰胺与氨基酸侧链或间隔物连接。因此，应理解，优选地亲脂性取代基包含形成所述酯、磺酰基酯、硫酯、酰胺或磺酰胺的一部分的酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子。优选地，亲脂性取代基中的酰基与氨基酸侧链或间隔物形成酰胺或酯的一部分。
亲脂性取代基可包含具有4至30个C原子的烃链。优选地，其具有至少8或12个C原子，优选地具有24个或更少的C原子或20个或更少的C原子。所述烃链可以是直链或支链，并且可以是饱和的或不饱和的。应理解，烃链优选地被这样的部分所取代，所述部分形成与氨基酸侧链或间隔物的连接，例如酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子。最优选地，所述烃链被酰基取代，并因此所述烃链可以是烷酰基(例如十六酰基、己酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或硬脂酰基)的一部分。
因此，所述亲脂性部分可具有下式：
            
A可以是例如酰基、磺酰基、NH、N-烷基、O原子或S原子，优选酰基。n是3至29、优选7至25、更优选11至21、甚至更优选15至19的整数。
所述烃链可被进一步取代。例如，其可被选自NH₂、OH和COOH的至多3个取代基取代，尤其是在分子的远离间隔物或肽的游离端取代。例如，其可包含游离羧基。
如果烃链被进一步取代，优选地其被仅一个取代基进一步取代。作 为替代或补充，烃链可包括环烷烃或杂环烷烃，例如以下所示：
            
优选地，所述环烷烃或杂环烷烃为六元环。最优选地，其为哌啶。
或者，亲脂性取代基可基于环戊烷并菲骨架，其可以是部分不饱和的或完全不饱和的，或者是饱和的。骨架中的每个碳原子可被Me或OH取代。例如，所述亲脂性取代基可以是胆酰基(cholyl)、脱氧胆酰基(deoxycholyl)或石胆酰基(Iithocholyl)。
如上所述，亲脂性部分可通过间隔物与氨基酸侧链缀合。如果存在的话，间隔物与亲脂性部分和氨基酸侧链连接。间隔物可独立地通过酯、磺酰酯、硫酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲或磺酰胺与亲脂性取代基和氨基酸侧链连接。因此，其可包含两个独立地选自酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子的部分。所述间隔物可具有下式：
            
其中B和D各自独立地选自酰基、磺酰基、NH、N-烷基、O原子和S原子，优选地选自酰基和NH。优选地，n是1至10的整数，优选1至5的整数。间隔物可进一步被一个或更多个选自C_0-6烷基、C_0-6烷基胺、C_0-6烷基羟基和C_0-6烷基羧基的取代基取代。
或者，间隔物可具有上式的2个或更多个重复单元。每个重复单元的B、D和n各自独立地选择。相邻重复单元可通过其各自的B和D部分彼此共价连接。例如，相邻重复单元的B和D部分可一起形成酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺酰胺。间隔物各端的游离B和D单元如上所述地与氨基酸侧链和亲脂性部分连接。
优选地，间隔物具有5个或更少的、4个或更少的或者3个或更少的重复单元。最优选地，所述间隔物具有2个重复单元，或者是单个单元。
所述间隔物(或者间隔物的一个或更多个重复单元，如果其具有重复单元的话)可以是例如天然或非天然氨基酸。应理解，对于具有官能化侧链的氨基酸，B和/或D可以是氨基酸的侧链中的一部分。所述间隔物可以是任何天然氨基酸或非天然氨基酸。例如，间隔物(或者间隔物的一 个或更多个重复单元，如果其具有重复单元的话)可以是Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、α-Glu、γ-Glu、Asp、Ser Thr、Gaba、Aib、β-Ala、5-氨基戊酰基、6-氨基己酰基、7-氨基庚酰基、8-氨基辛酰基、9-氨基壬酰基或10-氨基癸酰基。
例如，所述间隔物可以是选自γ-Glu、Gaba、β-Ala和α-Glu的单个氨基酸。
亲脂性取代基可以与本发明化合物中的任何氨基酸侧链缀合。优选地，所述氨基酸侧链包含羧基、羟基、巯基、酰胺基或胺基，用以与所述间隔物或亲脂性取代基形成酯、磺酰基酯、硫酯、酰胺或磺酰胺。例如，所述亲脂性取代基可与Asn、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Ser、Thr、Tyr、Trp、Cys或Dbu、Dpr或Orn缀合。优选地，所述亲脂性取代基与Lys缀合。在本文提供的式中表示为Lys的氨基酸可在加入亲脂取代基处被例如Dbu、Dpr或Orn替换。
包含亲脂性部分和间隔物的亲脂性取代基的实例如下式所示：
            
在本文中，本发明化合物中的Lys残基通过酰胺部分与γ-Glu(间隔物)共价连接。棕榈酰基(即，十六烷酰基)通过酰胺部分与γ-Glu间隔物共价连接，从而产生十六烷酰基-异Glu基团。
作为替代或补充，本发明化合物中的一个或更多个氨基酸侧链可与聚合物部分缀合，例如用以提高溶解性和/或体内(例如，血浆中)半衰期和/或生物利用度。还已知这样的修饰降低治疗性蛋白质和肽的清除率(例如，肾清除率)。
本领域技术人员知晓可用于使用例如"Comprehensive Organic  Transformations，A Guide to Functional Group Preparations″，第2版，Larock，R.C；Wiley-VCH：New York，1999中列举的一般合成方法进行间隔物和亲脂性部分的偶联反应的合适技术。这种转化可在合成过程中的任何合适阶段进行。
所述聚合物部分优选为水溶性(两亲性或亲水性)、无毒以及药学惰性的。合适的聚合物部分包括聚乙二醇(PEG)、PEG的均聚物或共聚物、PEG的单甲基取代聚合物(mPEG)和聚氧乙烯甘油(POG)。参见例如Int.J.Hematology 68：1(1998)；Bioconjugate Chem.6：150(1995)；和Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Sus.9：249(1992)。
另一些合适的聚合物部分包括聚氨基酸，例如聚赖氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸(参见例如，Gombotz，等.(1995)，Bioconjugate Chem.，vol6：332-351；Hudecz，等.(1992)，Bioconjugate Chem.，vol 3，49-57；Tsukada，等.(1984)，J.Natl.Cancer Inst.，vol 73，：721-729；以及Pratesi，等.(1985)，Br.J.Cancer，vol 52：841-848)。
聚合物部分可以是直链或支链的。其分子量可以是500至40,000Da，例如500至10,000Da、1000至5000Da、10,000至20,000Da或20,000至40,000Da。
本发明化合物可包含两个或更多个这样的部分，在这种情况下，所有这些部分的总分子量通常落入上述范围内。
聚合物部分可与氨基酸侧链的氨基、羧基或巯基偶联(通过共价键)。优选的实例是Cys残基的巯基和Lys残基的ε氨基。也可使用Asp和Glu残基的羧基。
本领域技术人员知晓可用于进行偶联反应的合适技术。例如，可使用来自Nektar Therapeutics的市售试剂通过马来酰亚胺基连接将具有甲氧基的PEG部分与Cys巯基偶联。另参见WO 2008/101017以及上述参考文献来获得合适化学过程的细节。
      肽合成      
本发明化合物可通过标准合成方法、重组表达系统或任何其他现有技术方法来制备。因此，胰高血糖素类似物可以通过多种方法合成，包括例如包括以下步骤的方法：
(a)采用固相法或液相法逐步地或通过片段组装来合成肽，并分离和纯化最终肽产物；或
(b)在宿主细胞中表达编码所述肽的核酸构建体，并从宿主细胞或培养基中回收表达产物；或
(c)对编码所述肽的核酸构建体实施无细胞体外表达，并回收表达产物；
或利用方法(a)、(b)和(c)的任意组合来获得肽片段，随后连接所述片段以获得肽，并且回收所述肽。
优选地，通过固相或液相肽合成来合成本发明的类似物。关于此点，参见WO 98/11125，以及Fields，GB等，2002，"Principles and practice of solid-phase peptide synthesis".In：Synthetic Peptides(第二版)和本文的实施例等。
对于重组表达而言，通常将本发明的核酸片段插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆或表达载体。这些新载体也是本发明的一部分。根据应用目的和类型，所述载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、小染色体或病毒的形式，同时仅在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也是重要的载体。本发明优选的克隆和表达载体(质粒载体)能够自主复制，从而能产生高拷贝数以实现高水平表达或高水平复制用于随后的克隆。
一般而言，表达载体包含5’→3’方向并可操作地连接的以下特征：驱动本发明核酸片段表达的启动子，任选地编码能进行分泌(分泌到细胞外相或适当时分泌到周质(periplasma))的前导肽的核酸序列，编码本发明肽的核酸片段和任选地编码终止子的核酸序列。其可包含另外的特征，例如选择标记和复制起点。当对生产菌株或细胞系中的表达载体进行操作时，优选地所述载体能够插入到宿主细胞基因组中。本领域技术人员将非常熟悉适合的载体，并且能够根据其特定需求而设计载体。
本发明的载体用于转化宿主细胞以产生本发明的化合物。这些转化细胞(其也为本发明的一部分)可以是用于扩增本发明核酸片段和载体或者用于重组产生本发明肽的培养细胞或细胞系。
本发明优选的转化细胞是微生物，例如细菌(例如以下属的物种：埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、沙门氏菌属(Salmonella)或分枝杆菌属(Mycobacterium)(优选非致病性的，例如牛分枝杆菌(M.bovis)BCG))、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))和原生动物。或者，所述转化细胞可 来源于多细胞生物，即，其可以是真菌细胞、昆虫细胞、藻类细胞、植物细胞或动物细胞(例如，哺乳动物细胞)。为了克隆和/或优化表达，优选地所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。表达所述核酸片段的细胞可用于本发明的实施方案。其可用于小规模或大规模制备本发明的肽。
当利用转化细胞来生产本发明的肽时，方便但并非必需的是，将表达产物分泌到培养基中。
      效力      
相关化合物与GLP-1受体或胰高血糖素(Glu)受体的结合可用作激动剂活性的指示，但是通常优选使用生物测定，其测量由化合物与相关受体的结合所产生的细胞内信号传导。例如，胰高血糖素激动剂对胰高血糖素受体的活化会刺激细胞环AMP(cAMP)的形成。类似地，GLP-1激动剂对GLP-1受体的活化会刺激细胞cAMP形成。因此，cAMP在表达这两种受体之一的合适细胞中的产生可用于监测相关受体的活性。因此，可以使用一对合适的细胞类型(每种细胞类型表达一种受体而不表达另一种受体)测定激动剂对这两种类型受体的活性。
本领域技术人员知晓合适的测定方式，并且下文提供了实例。GLP-1受体和/或胰高血糖素受体可具有实例中所述的受体序列。例如，测定中可使用具有原始登录号GI：4503947的人胰高血糖素受体(胰高血糖素-R)和/或具有原始登录号GI：166795283的人胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)(在涉及前体蛋白质的序列时，显然应当理解的是可使用不含信号序列的成熟蛋白质进行测定)。
可使用EC₅₀值作为激动剂对给定受体效力的数值量度。EC₅₀值是在特定测定中实现化合物最大活性一半时所需的化合物浓度的测量值。因此，例如在特定测定中，EC₅₀[GLP-1]比胰高血糖素之EC₅₀[GLP-1]更低的化合物可以被认为与胰高血糖素相比具有更高的针对GLP-1受体激动剂的效力。
本说明书中所述的化合物通常是GluGLP-1双效激动剂(dual agonist)，如其针对胰高血糖素受体和GLP-1受体二者均能刺激cAMP形成的观察结果确定的。可在独立测定中测量每种受体的激活，然后彼此进行比较。
通过将给定化合物针对GLP-1受体的EC₅₀值(EC₅₀[GLP-1-R])与针对胰高血糖素受体的EC₅₀值(EC₅₀[胰高血糖素R])相比较，可如下 计算相对GLP-1R选择性：
相对GLP-1R选择性[化合物]＝(EC₅₀[GLP-1R])/(EC₅₀[胰高血糖素-R])
术语“EC₅₀”代表通常针对特定受体或用于受体功能的特定生物标记的水平的半数最大有效浓度，根据具体的生物化学背景，也可以指抑制或拮抗活性。
不希望受到任何特定理论的约束，化合物的相对选择性可允许直接比较其对于GLP-1受体或胰高血糖素受体的效应与其对于其他受体的效应。例如，化合物的相对GLP-1选择性越高，与胰高血糖素受体相比化合物对GLP-1受体可能越有效。通常结果是比较来自同一物种的胰高血糖素和GLP-1受体，例如人胰高血糖素和GLP-1受体，或鼠胰高血糖素和GLP-1受体。
本发明化合物可具有比人胰高血糖素更高的相对GLP-1R选择性，因为对于特定的胰高血糖素-R激动剂活性水平，所述化合物可表现出比胰高血糖素更高水平的GLP-1R激动剂活性(即，对GLP-1受体更具效力)。应理解，特定化合物对于胰高血糖素受体和GLP-1受体的绝对效力可能高于、低于或约等于人本源胰高血糖素，只要实现适当的相对GLP-1R选择性即可。
然而，本发明化合物可具有比人胰高血糖素低的EC₅₀[GLP-1R]。所述化合物可具有比胰高血糖素低的EC₅₀[GLP-1R]，同时保持其EC₅₀[胰高血糖素-R]与人胰高血糖素的EC₅₀[胰高血糖素-R]相比高出小于10倍、高出小于人5倍，或高出小于2倍。
本发明化合物的EC₅₀[胰高血糖素-R]可小于人胰高血糖素的EC₅₀[胰高血糖素-R]的2倍。所述化合物的EC₅₀[胰高血糖素-R]可小于人胰高血糖素的EC₅₀[胰高血糖素-R]的2倍，并且其EC₅₀[GLP-1R]小于人胰高血糖素EC₅₀[GLP-1R]的一半、小于人胰高血糖素的EC₅₀[GLP-1R]的五分之一或小于人胰高血糖素的EC₅₀[GLP-1R]的十分之一。
化合物的相对GLP-1R选择性可以为0.05至20。例如，所述化合物的相对选择性可以是0.05-0.20、0.1-0.30、0.2-0.5、0.3-0.7或0.5-1.0；1.0-2.0、1.5-3.0、2.0-4.0或2.5-5.0；或者0.05-20、0.075-15、0.1-10、0.15-5、0.75-2.5或0.9-1.1。
在某些实施方案中，可能期望任何给定化合物对胰高血糖素-R和 GLP-1R二者(例如，对于人胰高血糖素和GLP-1受体)的EC₅₀都小于1nM。
      治疗用途      
如下文将讨论的，本发明化合物可为肥胖和代谢疾病(包括糖尿病)等提供有吸引力的治疗和/或预防选择。
糖尿病包括一类代谢疾病，其特征为由胰岛素分泌、胰岛素作用的缺陷或这二者引起的高血糖。糖尿病的急性特征包括尿产生过多、所导致的补偿性口渴和流体摄入增多、视力模糊、原因不明的体重减轻、嗜睡和能量代谢改变。糖尿病的长期高血糖与多种器官(特别是眼、肾、神经、心脏和血管)的长期损伤、功能紊乱和衰竭相关。糖尿病根据致病特征分为1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病。
1型糖尿病占所有糖尿病病例的5～10％，其由分泌胰岛素的胰腺β细胞的自身免疫性破坏造成。
2型糖尿病占糖尿病病例的90～95％，其由一系列复杂代谢紊乱引起。2型糖尿病是内源胰岛素产生不足以保持血糖水平低于诊断阈值的结果。
妊娠期糖尿病是指在妊娠期间鉴定出的任何程度的葡萄糖不耐受。
前驱糖尿病包括空腹葡萄糖受损和葡萄糖耐量受损，它是指在血糖水平升高但仍低于确立的糖尿病临床诊断水平时出现的那些状态。
由于另一些代谢风险因素的高度流行，一大部分2型糖尿病和前驱糖尿病患者的发病和死亡风险升高，所述代谢风险因素包括腹部肥胖(腹部内脏周围过多的脂肪组织)、致动脉粥样硬化的血脂异常(血脂紊乱，包括高甘油三酯、低HDL胆固醇和/或高LDL胆固醇，其促使斑块在动脉壁中积聚)、血压升高(高血压)、血栓前状态(例如，血液中高纤维蛋白原或纤溶酶原活化剂抑制因子-1)和促炎症状态(例如，血液中C反应蛋白水平升高)。
反过来，肥胖导致前驱糖尿病、2型糖尿病以及例如某些类型的癌症、阻塞性睡眠呼吸暂停和胆囊疾病的发病风险升高。
血脂异常与心血管疾病的风险升高相关。高密度脂蛋白(HDL)具有临床重要性，这是因为血浆HDL浓度与动脉粥样硬化疾病的风险之间存在负相关性。贮藏在动脉粥样硬化斑块中的大多数胆固醇来源于LDL，因此高浓度的低密度脂蛋白(LDL)与动脉粥样硬化密切相关。HDL/LDL 比值是动脉粥样硬化(特别是冠状动脉粥样硬化)的临床风险指标。
代谢综合征以个体中的一组代谢风险因素为特征。其包括腹部肥胖(腹部内脏周围过多的脂肪组织)、致动脉粥样硬化血脂异常(血脂紊乱，包括高甘油三酯、低HDL胆固醇和/或高LDL胆固醇，其促使斑块在动脉壁中积聚)、血压升高(高血压)、胰岛素抗性和葡萄糖不耐受、血栓前状态(例如，血液中存在高纤维蛋白原或纤溶酶原活化剂抑制因子-1)、高甘油三酯血症、高胆固醇血症和促炎症状态(例如，血液中C反应蛋白升高)。
患有代谢综合征的个体患冠心病以及与动脉硬化的其他临床表现相关的其他疾病(例如，卒中和周围血管病变)的风险提高。该综合征的主要潜在风险因素看来是腹部肥胖。
不希望受任何特定理论的约束，认为本发明化合物作为人胰高血糖素受体和人GLP1受体二者的双效激动剂，在此简写为GluGLP-1双效激动剂。所述双效激动剂可将胰高血糖素对例如脂质代谢的作用与GLP-1对例如血糖水平和摄食量的作用相组合。因此，其可加速清除过多的脂肪组织、引起可持续的体重减轻以及改善血糖控制。GluGLP-1双效激动剂还可降低心血管风险因素，例如高胆固醇、高LDL胆固醇或低HDL/LDL胆固醇比值。
因此，本发明化合物可在有此需要的对象中用作药剂，用于防止体重增长、促进体重减轻、降低过重体重或治疗肥胖(例如，通过控制食欲、进食、食物摄取、卡路里摄入和/或能量消耗)，包括病态肥胖以及相关的疾病和健康状况，包括但不限于肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病和肥胖诱导的睡眠呼吸暂停。本发明化合物还可用于治疗有此需要的对象中由血糖控制受损引起或与之相关的病症，包括代谢综合征、胰岛素抗性、葡萄糖不耐受、前驱糖尿病、空腹血糖升高、2型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病和卒中。这些病症中的一些与肥胖有关。但是，本发明化合物对这些病症的作用可全部或部分地通过对体重的作用来介导，或可不依赖于对体重的作用。
GluGLP-1双效激动剂的协同作用还可导致心血管风险因素(例如高胆固醇和LDL)降低，其可能完全不依赖于对体重的作用。
因此，本发明提供了本发明化合物在有此需要的个体中治疗上述病症的用途。
本发明还提供了本发明化合物，其用于医学治疗方法，特别是用于治疗上述病症的方法。
在一个优选方面，所述化合物可用于治疗糖尿病，尤其是2型糖尿病。
在一个具体实施方案中，本发明包括化合物在有此需要的个体中治疗糖尿病、尤其是2型糖尿病的用途。
在一个次优选方面，所述化合物可用于防止体重增长或促进体重减轻。
在一个特定实施方案中，本发明包括化合物用于在有此需要的个体中防止体重增长或促进体重减轻的用途。
在一个特定实施方案中，本发明包括化合物在治疗由体重过重引起或以体重过重为特征的病症的方法中的用途，例如在有此需要的个体中治疗和/或预防肥胖、病态肥胖、术前病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病、肥胖诱发的睡眠呼吸暂停、前驱糖尿病、糖尿病(尤其是2型糖尿病)、高血压、致动脉粥样硬化性血脂异常、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、卒中或微血管疾病。
在另一方面，所述化合物可用于降低循环LDL水平和/或提高HDL/LDL比值的方法中。
在一个特定实施方案中，本发明包括化合物在有此需要的个体中降低循环LDL水平和/或提高HDL/LDL比值的方法中的用途。
在另一方面，所述化合物可用于降低循环甘油三酯水平的方法。
      药物组合物      
本发明化合物可配制成药物组合物用于保存或施用。这样的组合物通常在可药用载体中以合适的形式包含治疗有效量的本发明的化合物。
本发明化合物的治疗有效量取决于施用途径、接受治疗的哺乳动物的类型和所考虑的具体哺乳动物的身体特征。决定该量的这些因素及其关系是医药领域技术人员公知的。可调整该量和施用方法以实现最佳效力，并且可取决于医药领域技术人员公知的因素，例如体重、饮食、同时用药情况(concurrent medication)等。人用最适剂量大小和给药方案可参考本发明得到的结果，并且可在适当设计的临床试验中加以验证。本发明化合物特别可用于治疗人。
可通过常规方法确定有效剂量和治疗方案，在实验动物中从低剂量开始，然后提高剂量的同时监测效果，并且还系统地改变给药方案。在决定针对给定对象的最佳剂量时，临床医生可考虑多种因素。这样的考虑是本领域技术人员已知的。
术语“可药用载体”包括任何标准药用载体。用于治疗用途的可药用载体是药物领域中公知的，并描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编著.1985)中。例如，可使用弱酸性或生理pH的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。pH缓冲剂可以是磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(其经常是优选的缓冲剂)、精氨酸、赖氨酸和醋酸盐，或其混合物。该术语还涵盖在美国药典中所列的任何用于动物(包括人)的试剂。
术语“可药用盐”是指本发明任一种化合物的盐。盐包括可药用盐，例如酸加成盐和碱式盐。酸加成盐的实例包括盐酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐。碱式盐的实例包括阳离子选自碱金属离子(例如钠离子和钾离子)、碱土金属离子(例如钙离子)和铵离子⁺N(R³)₃(R⁴)的盐，其中R³和R⁴独立地表示任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_2-6烯基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。其他可药用盐的实例描述于″Remington′s Pharmaceutical Sciences"，第17版.Alfonso R.Gennaro(编著)，Mark Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985及更新的版本中，以及Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology中。
“治疗”是指用于获得有益的或期望的临床结果的方法。为本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延后或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病状态以及(部分地或全部地)消除(remission)，无论是可检出还是不可检出的。“治疗”还可指与未接受治疗时的预期存活相比延长存活期。“治疗”是以防止疾病发生或改变疾病的病理状况为目的而进行的介入。因此，在某些实施方案中，“治疗”指治疗性治疗以预防或防护性手段二者。需要治疗的对象包括已患病的对象和待预防疾病发生的对象。“治疗”是指与未治疗相比抑制或减轻病理状况或症状(例如，体重增长、高血糖)的提高，并不一定提示相关病症的完全终止。
所述药物组合物可以是单位剂型。在这样的形式中，组合物被分成包含合适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，所述包装 包括独立量的制剂，例如盒装片剂、胶囊剂以及小瓶或安瓿中的粉末。单位剂型本身还可以是胶囊剂、扁囊剂(cachet)或片剂，或可以是合适数量的任意这些包装的形式。其可以单剂量注射形式提供，例如采用注射笔(pen)的形式。可将组合物配制成适于任何合适的施用途径和方式。可药用载体或稀释剂包括适用于经口、经直肠、经鼻、局部(包括口腔(buccal)和舌下)、经阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内和经皮)施用的制剂中使用的那些。可方便地将所述制剂以单位剂型提供，并且可通过药学领域中公知的任何方法来制备。
皮下或经皮施用方式可特别适合于本文中描述的化合物。
本发明组合物还可通过例如共价、疏水和静电相互作用混合或附接在药物载体、药物递送系统和高级药物递送系统中，以便进一步提高化合物的稳定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低副作用、实现本领域技术人员公知的时间疗法(chronotherapy)，以及提高患者顺从性，或者它们的任意组合。载体、药物递送系统和高级药物递送系统的实例包括但不限于聚合物，例如纤维素和衍生物；多糖，例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物；聚乙烯醇、丙烯酸和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物，聚乙二醇；载体蛋白质，例如白蛋白、凝胶，如热凝胶系统(thermogelling system)，例如本领域技术人员公知的嵌段共聚物体系、胶束(micelle)、脂质体、微球、纳米颗粒、液晶及其分散体、脂质-水系统中的相行为(phase behavior)领域技术人员公知的L2相及其分散体、聚合物胶束、复合乳剂(multiple emulsion)、自乳化乳剂、自微乳化乳剂、环糊精及其衍生物，以及树状聚合物。
      组合治疗      
本发明的化合物或组合物可作为组合治疗的一部分与治疗肥胖、高血糖、血脂异常和糖尿病的其他药剂一起施用。
在这种情况下，两种活性剂可同时施用或分开施用，作为同一药物制剂的一部分或作为分别的制剂。
因此，本发明的化合物或组合物还可与抗肥胖药组合使用，所述抗肥胖药包括但不限于胰高血糖素样肽受体1激动剂、肽YY或其类似物、大麻素受体1拮抗剂、脂肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素浓集激素受体1拮抗剂。
本发明的化合物或组合物还可与抗高血压剂组合使用，所述抗高血 压剂包括但不限于血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、利尿剂、β阻断剂或钙通道阻断剂。
本发明的化合物或组合物还可与抗血脂异常剂组合使用，所述抗血脂异常剂包括但不限于他汀类、贝特类、烟酸类或胆固醇吸收抑制剂。
另外，本发明的化合物或组合物还可与抗糖尿病药组合使用，所述抗糖尿病药包括但不限于双胍类(例如，二甲双胍)、磺酰脲类、美格列奈类或列奈类(例如，那格列奈)、DPP-IV抑制剂、格列酮类、不同GLP-1激动剂、胰岛素或胰岛素类似物。在一个优选实施方案中，本发明的化合物或其盐与胰岛素或胰岛素类似物、DPP-IV抑制剂、磺酰脲类或二甲双胍组合使用，特别是磺酰脲类或二甲双胍组合使用，以实现充分的血糖控制。胰岛素类似物的实例包括但不限于Lantus、Novorapid、Humalog、Novomix和Actraphane HM、Levemir和Apidra。
实施例
      实施例1：胰高血糖素类似物的一般合成      
应用微波辅助合成仪，采用标准的Fmoc策略、利用聚苯乙烯树脂(TentaGel S Ram)在NMP中进行固相肽合成(SPPS)。用HATU作为偶联剂，DIPEA作为基质(base)。使用哌啶(20％，在NMP中)进行去保护。适当时，使用假脯氨酸：Fmoc-Phe-Thr(psiMe，Mepro)-OH和Fmoc-Asp-Ser(psiMe，Mepro)-OH(购自NovaBiochem)。
所用缩写如下：
Boc：    叔丁氧羰基
ivDde：  1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己亚基)3-甲基-丁基
Dde：    1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己亚基)-乙基
DCM：    二氯甲烷
DMF：    N，N-二甲基甲酰胺
DIPEA：  二异丙基乙胺
EDT：    1，2-乙二硫醇
EtOH：   乙醇
Et₂O：    乙醚
HATU：    N-[(二甲氨基)-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物
MeCN：   乙腈
NMP：    N-甲基吡咯烷酮
TFA：    三氟乙酸
TIS：    三异丙基硅烷
切割：
通过在室温(r.t.)下用95/2.5/2.5％(v/v)TFA/TIS/水处理2小时，将粗制肽从树脂上切下来。对于序列中具有甲硫氨酸的肽，使用95/5(v/v)TFA/EDT混合物。在减压下除去大部分TFA，使粗制肽沉淀并用乙醚洗涤，在环境温度下干燥至恒重。
合成以下化合物：
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS-OH(化合物1)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K《十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA-OH(化合物2)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLRA-OH(化合物3)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLLSA-NH₂《化合物4)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA-NH₂(化合物5)
H-HSQGTFTSDYSRYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA-NH₂(化合物6)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLLRA-NH2(化合物7)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLS-NH₂(化合物8)
H-HSQGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLR-OH(化合物9)
H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA-NH₂(化合物10)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLS-OH(化合物11)
H-HSQGTFTSDYSRYLDS-K《十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA-NH₂(化合物12)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLLSA-OH(化合物13)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-OH(化合物14)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物15)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA-NH₂(化合物16)
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEEFIEWLESA-OH(化合物17)
H-HSHGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFIEWLESA-OH(化合物18)
H-H-Aib-HGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHEFVEWLESA-NH₂(化合物19)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物20)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFIEWLESA-NH₂(化合物21)
H-HSQGTFTSDYSKYLEE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物22)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAHDFVEWLESA-NH₂(化合物23)
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLES-K(十六烷酰基-异Glu)-AAEDFVEWLESA-NH₂(化合物24)
H-H-DSer-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-AAKDFIEWLESA-NH₂(化合物25)
      实施例2：酰化胰高血糖素类似物的一般合成            
按照上述针对胰高血糖素类似物的一般合成的描述来合成肽骨架，不同之处在于肽骨架在赖氨酸残基的侧链上被酰化而肽仍与树脂相连并且侧链基团(除了待酰化赖氨酸上的ε-氨基外)得到完全保护。使用Fmoc-Lys(ivDde)-OH或Fmoc-Lys(Dde)-OH掺入待酰化的赖氨酸。使用NMP中的Boc₂O以Boc基团保护肽的N端。在肽仍与树脂相连时，用NMP中的5％水合肼选择性切割ivDde保护基团。而后未经保护的赖氨酸侧链首先与间隔氨基酸(如Fmoc-Glu-OtBu)偶联，其随后使用上述标准肽偶联方法用哌啶去保护并且用脂肪酸酰化。或者，可以一开始以Boc-His(Boc)-OH掺入N端的组氨酸。如上所述从树脂上切割和纯化。
      实施例3：胰高血糖素受体和GLP-1受体效力测定      
合成编码人胰高血糖素受体(胰高血糖素-R)(原始登录号P47871)或人胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)(原始登录号P43220)的cDNA并克隆到含有博来霉素(Zeocin)抗性标记的哺乳动物表达载体中。
采用Attractene法将编码胰高血糖素-R或GLP-1-R的哺乳动物表达载体转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。在通过博来霉素选择(250μg/mL)对抗选择压力的细胞有限稀释之后，获得稳定表达克隆。挑取表达的胰高血糖素-R和GLP-1-R细胞克隆、使其增殖并且在下述胰高血糖素-R和GLP-1-R效力测定中进行测定。选择一个表达胰高血糖素-R的克隆和一个表达GLP-1-R的克隆用于化合物分析(profiling)。
在测定前24小时，将表达人高血糖素-R或人GLP-1-R的CHO细胞以30,000个细胞/孔接种到96孔微量滴定板中，并培养在100μl生长培养基中。在分析当天，除去培养基并将细胞用200μl测定缓冲液(Krebs-Ringer缓冲液，KRBH)洗涤一次。除去缓冲液，将细胞在含有浓度递增的受试肽、10μl KRBH(KRBH+10mM HEPES，5mM NaHCO3，0.1％(V/V)BSA)和0.1mM IBMX的去离子水中于室温孵育15分钟。通过加入裂解缓冲液(0.1％w/v BSA，5mM HEPES，0.3％v/v Tween-20)使反应终止。在细胞于室温裂解10分钟后，将裂解物转移到384孔板中，加入包含在AlphaScreen^TM cA P Functional Assay Kit中的10μl受体/供体珠混合物。在暗处于室温孵育1小时后，使用来自Perkin-Elmer的AlphaScreen^TM cAMP Functional Assay Kit根据制造商说明书测定cAMP含量。使用计算机辅助曲线拟合计算EC₅₀以及与参考化合物(胰高血糖素和GLP-1)相比的相对效力。参见表1A和1B。
表1A.
            
表1B.
            
      在不同实验室使用相同方案进行的实验中对两组化合物进行测试。      
      实施例4：对内源GLP-1受体的激动剂活性      
使用鼠胰岛瘤细胞系测定受试化合物对内源GLP-1受体的激动剂活性。使用细胞内cAMP作为受体活性的指标。
将细胞以10,000个细胞/孔的密度在384孔板中培养24小时。除去培养基，在26℃经过15分钟向每个孔中加入含有受试化合物或GLP-1(从0.1pM至100nM的浓度递增)或者溶剂对照(0.1％(v/v)DMSO)的10μL KRBH缓冲液(NaCl 130mM、KCl 3.6mM、NaH₂PO₄0.5mM、MgSO₄0.5mM、CaCl₂1.5mM)。
使用AlphaScreen cAMP Functional Assay Kit(Perkin Elmer)测量细胞内cAMP含量。使用Envision(PerkinElmer)根据制造商的推荐进行测量。
所有测量一式四份地进行。
使用在含有0.1％(v/v)DMSO的KRBH缓冲溶液中制作的cAMP标准曲线将结果转化成cAMP浓度。所得cAMP曲线绘制成相对于log(受试化合物浓度)的绝对cAMP浓度(nM)，并使用曲线拟合程序XLfit进行分析。
描述每一种受试化合物对内源GLP-1受体的效力和激动剂活性二者的所计算参数为：
pEC50(EC50的负对数值，导致cAMP水平半数最大升高的浓度，反映了受试化合物的效力)；
百分比对照(CTL％)(每一种受试化合物浓度的_cAMP提高％，基于GLP-1诱导的最大cAMP应答(100％CTL)归一化)。参见表2。
表2.
            
      实施例5：对内源胰高血糖素受体的激动剂活性：      
通过测量受试化合物对原代大鼠肝细胞中的糖原合成速率的影响来确定其对内源胰高血糖素受体的激动剂活性。在胰高血糖素受体活化之后，预期糖原合成速率将被抑制。通过对限定时间段内并入细胞糖原储备物中的放射性标记的葡萄糖的量进行计数来确定糖原合成速率。
在37℃和5％CO₂下，将原代大鼠肝细胞以40,000个细胞/孔的密度在24孔板中培养24小时。
弃去培养基并用PBS洗涤细胞。然后向孔中加入含0.1％BSA和浓度为22.5mM葡萄糖的180μL基于KRBH的缓冲液，接着加入受试化合物和40μCi/ml D-[U14C]葡萄糖(分别为20μL)。持续孵育3小时。
在孵育期结束时，抽出孵育缓冲液并将细胞用冰冷PBS洗涤一次，之后通过在室温下用100μL 1mol/l NaOH孵育30分钟来裂解。
将细胞裂解物转移到96孔滤板上并通过将滤板在4℃孵育120分钟然后用冰冷乙醇(70％)洗涤滤板4次来使糖原沉淀。将所得沉淀物过滤至干，并使用Topcount闪烁计数器根据制造商推荐确定并入的¹⁴C-葡萄糖的量。
包括具有载剂对照(KRBH缓冲液中0.1％(v/v)DMSO)的孔作为未抑制糖原合成(100％CTL)以供参考。包括未添加D-[U¹⁴C]葡萄糖的孔作为非特异性背景信号(从所有值中减去)的对照。使用内源胰高血糖素肽作为阳性对照。
所有处理至少一式三份地进行。
描述每一种受试化合物对内源胰高血糖素受体的效力和激动剂活性二者的所计算参数是pEC50和CTL％。
通过计算减去背景CPM/孔后在受试化合物存在下的CPM/孔相比于载剂对照的CPM/孔相比的百分比来确定CTL％：
[CPM/孔(基线)-CPM/孔(样品)]^＊100/[CPM/孔(基线)-CPM/孔(基线)]
胰高血糖素受体的活化剂将导致糖原合成速率被抑制，并且给出了0％CTL(完全抑制)和100％CTL(没有明显抑制)之间的CTL％值。
所得活性曲线绘制为相对于log(受试化合物浓度)的绝对计数(单位：cpm/样品)，并使用曲线拟合程序XLfit进行分析。
pEC50(EC50的负对数值)反映了受试化合物的效力。
表3.
            
关于GLP-1R活性引用的术语EC₅₀和pEC₅₀可同等地视为关于糖原合成的IC₅₀和pIC₅₀。
      实施例6：药物代谢动力学参数的评估            
在向C57BI/6J小鼠皮下和静脉施用后确定受试化合物的药物代谢动力学参数。
8周龄的雄性C57BI/6J小鼠获自Taconic(Denmark)，在抵达测试设施时重约20-25g。将小鼠饲养在III型欧洲标准笼中，所用光周期为12小时暗和12小时光照(06.00时光照)。在整个实验期间，饲料Altromin1324(Altromin，Germany)和水二者均可随意享用。在开始实验程序之前，使8-11周动物在实验室待至少7天以确保完全适应。在采样后，通过颈椎脱臼法处死小鼠。
首先在0.096％氨水中将化合物溶解至2mg/ml的标称浓度，然后在含有25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的无菌PBS中稀释至期望剂量强度(4μM)。进行对应于20nmol/kg的皮下和静脉内注射。在颈部区域皮下给药以及通过侧面尾巴静脉进行静脉内给药来施用GLP-1-胰高血糖素双效激动剂。
对于皮下施用在0.5、2、4、6、12、16、20、24小时以及对于静脉内施用在10分钟、30分钟、3小时、6小时、12小时、18小时、24小时从眶周血管丛将血液样品(250μl)收集到冰冻的K₃EDTA管中并在取样的20分钟内于4℃离心5分钟。将血浆(＞100μl)分离到冰冻Micronic管中，立即冰冻，并且保持在-70℃直到使用LC-MS/MS分析各GLP-1-胰高血糖素化合物的血浆浓度。通过WinNonLin v6.3(Pharsight inc，Mountain View，Calif.，USA)中的未划区方法分析各个血浆浓度-时间曲线，并确定所得药物代谢动力学参数。参见表4。
表4.
            
      实施例7：C57BL/6J小鼠的口服葡萄糖耐量测定      
将雄性C57BL/6J小鼠禁食10h，之后接受2g/kg体重的经口葡萄糖浓注。将肽溶解在用25mM磷酸盐缓冲的盐水中，以10nmol/kg体重的剂量在葡萄糖浓注前4小时通过皮下注射施用。对照动物仅接受载剂注射。组大小为7只动物/组。通过尾巴采血获得给药前和葡萄糖前(0分钟)的血样并用血糖仪测量血糖。在葡萄糖攻击之后15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟时获得用于测量血糖的另外的尾巴血液样品。通过计算0分钟至120分钟之间血糖-时间曲线(AUC)下方的总面积量化血糖波动。通过梯形法则进行AUC的计算，而无需基线校准。数据表示为平均值±S.E.M.。通过单因素ANOVA然后通过Tukey事后检验进行统计学比较。仅载剂用作对照。参见表5.
表5.