棉花GHEDR2基因及其编码蛋白与应用.pdf

本发明涉及植物基因克隆和功能分析，属于植物基因工程领域，具体是一种棉花GhEDR2基因及其编码蛋白与应用，本发明根据同源基因序列的相对保守性，查找与拟南芥抗病基因cDNA同源的棉花EST片段，将部分重叠且高度同源的棉花EST进行序列拼装，组合成完整ORF的cDNA序列，根据这些序列设计特异性的PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得GhEDR2基因。利用qPCR 分析发现该基因在棉花植株中的表达呈现了组织特异性的特点。而且转基因植物黄萎病的发病率明显低于非转基因植物。因此利用本发明所述的GhEDR2基因来培育抗黄萎病植物，在植物抗病育种中将会有广阔的前景。

1.  棉花GhEDR2基因，其特征在于，是如SEQ ID NO.1所示的碱基序列；或在SEQ ID NO.1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺失或/和插入的碱基序列变体，且该碱基序列变体所编码的蛋白仍具有GhEDR2编码蛋白的功能或活性。

2.  棉花GhEDR2基因编码蛋白，其特征在于，是如（a）或（b）所示的蛋白：
（a）SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
（b）将SEQ ID NO.2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GhEDR2基因功能或活性的蛋白变体。

3.  权利要求1所述基因在提高植物对黄萎病抗性中的应用。

4.  含有权利要求3所述基因的重组载体或重组菌或转基因细胞系。

5.  根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是在pIP101的多克隆位点插入权利要求1所述的编码基因得到的重组载体。

6.  一种培育对黄萎病抗性的转基因植物的方法，其特征在于，将权利要求5得到的重组载体导入到植物中，培育筛选得到对黄萎病抗性提高的转基因植物。

7.  根据权利要求6所述的培育黄萎病抗性转基因植物的方法，其特征在于，所述的植物为双子叶植物和单子叶植物。

8.  根据权利要求7所述的培育黄萎病抗性的转基因植物的方法，其特征在于，所述的植物为拟南芥、棉花和玉米。

棉花GhEDR2基因及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明涉及植物基因克隆和功能分析，属于植物基因工程领域，具体是一种棉花GhEDR2基因及其编码蛋白与应用，其用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性。
背景技术
棉花是在我国国民经济中占有重要地位的经济作物。棉花黄萎病是世界范围内的病害之一，严重制约着棉花产业的稳步发展。近年来，棉花黄萎病的发生面积呈加重的趋势，发病面积占棉花总面积的50％左右。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌侵染引起的真菌性维管束系统病害，属于土传病害。棉花黄萎病菌的寄主范围非常广泛，包括棉花、番茄、亚麻、马铃薯和茄子等两百多种植物，就是在没有合适寄主存在的恶劣条件下黄萎病菌也可以以微菌核在土壤中存活十年以上。目前各种棉花黄萎病防治措施，因此包括物理防治、化学防治、生物防治等方法很难对棉花起到防治效果，所以选育和利用抗黄萎病品种是解决这一难题最经济有效的途径。虽然我国在抗枯萎病育种方面已取得显著成效，然而由于缺乏黄萎病抗源，棉花抗黄萎病育种的进展缓慢。
EDR(Enhanced Disease Resistance)2是从拟南芥edr突变体中克隆出的具有抗病性的基因。拟南芥EDR2包括一个PH区，一个START区和一个DUF1336区。其中，pH区由主要负责与脂结合协助膜定位，START区在脂运输和代谢以及细胞信号中起作用；DUF1336区是植物特有的结构域。EDR2的同源蛋白EDR1和EDR3在拟南芥中非常保守，它们介导的抗性都需要水杨酸(SA)的信号通路，而不需要茉莉酸(JA)和乙烯(ET)，其介导的抗性具有广谱性，在农业生产上具有重要的应用价值。
随着生物技术的发展，利用基因工程方法，将抗病基因直接导入棉花，创制抗黄萎病的种质材料，为我们提供了解决这一难题的有效方法。因此当今棉花抗病育种中，了解棉花的抗病机制和挖掘抗逆优异基因资源，创制育种新材料已经成为当下棉花分子育种的主要任务。克隆、分离和研究抗黄萎病相关的基因，分析不同基因的表达、调控机制为改良棉花品种提供物质基础和理论依据。
发明内容
本发明为了弥补目前棉花品种在抗黄萎病方面存在的缺陷，提供了一种棉花GhEDR2基因及其编码蛋白与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：棉花GhEDR2基因，是如SEQ ID NO.1所示的碱基序列；或在SEQ ID NO.1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺失或/和插入的碱基序列变体，且该碱基序列变体所编码的蛋白仍具有GhEDR2编码蛋白的功能或活性。
SEQ ID NO.1所示的碱基序列或者在严格条件下与其杂交且编码得到的仍具有GhEDR2编码蛋白的功能或活性的DNA分子也属于本发明的保护范围。所述SEQ ID NO.1所示的碱基序列是利用NCBI数据库中的基因序列，查找与拟南芥抗病基因cDNA同源的棉花EST片段，将部分重叠且高度同源的棉花EST进行序列拼装，组合成完整ORF的cDNA序列，根据这些序列设计特异性的PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得GhEDR2基因。
本发明的目的之二是提供一种棉花GhEDR2基因编码蛋白，是如(a)或(b)所示的蛋白：
(a)SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
(b)将SEQ ID NO.2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GhEDR2基因功能或活性的蛋白变体。
SEQ ID NO.1是从棉花叶片中克隆出的棉花基因，命名为GhEDR2，开放阅读框2449bp，编码由816个氨基酸组成的蛋白质，如SEQ ID NO.2所示。
另外，本发明提供了棉花GhEDR2基因在提高植物对黄萎病抗性中的应用。
含有棉花GhEDR2基因的重组载体或重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
进一步，含有棉花GhEDR2基因的重组载体是在pIP101的多克隆位点插入权利要求1所述的编码基因得到的重组载体。
本发明还提供了一种培育对黄萎病抗性的转基因植物的方法，将含有棉花GhEDR2基因的导入到植物中，培育筛选得到对黄萎病抗性提高的转基因植物。所述的植物为双子叶植物和单子叶植物，如拟南芥、棉花和玉米。
本发明根据同源基因序列的相对保守性，查找与拟南芥抗病基因cDNA同源的棉花EST片段，将部分重叠且高度同源的棉花EST进行序列拼装，组合成完整ORF的cDNA序列，根据这些序列设计特异性的PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得GhEDR2基因。利用qPCR分析发现该基因在棉花植株中的表达呈现了组织特异性的特点。而且转基因植物黄萎病的发病率明显低于非转基因植物。因此利用本发明所述的GhEDR2基因来培育抗黄萎病植物，在植物抗病育种中将会有广阔的前景。
附图说明
图1为GhEDR2基因在棉花不同器官中的表达量分析。
图2为黄萎病病原菌处理棉花后不同时间GhEDR2基因表达。
图3为GhEDR2基因过量表达载体的构建。
图4为GhEDR2蛋白的亚细胞定位。
图5为转GhEDR2基因拟南芥的PCR电泳图。
图6为接种15天后转GhEDR2基因拟南芥株系的病指调查，WT为野生型植株；PX1-PX5为的转基因株系。
图7为接种20天后转GhEDR2基因拟南芥株系的病指调查，WT为野生型植株；PX1-PX5为的转基因株系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述所有基因操作方法均参照《分子克隆》(Sambrook J等人，1989)所述进行；有关试剂盒使用参照所购试剂盒的应用说明；所用限制性内切酶和其它工具酶均购自NEB公司。
棉花材料为抗病棉花品种豫棉21，由山西省农业科学院棉花研究所品种资源室提供。拟南芥为哥伦比亚生态型、烟草品种为SR1，由中国科学院微生物所吴家和研究员提供，根瘤农杆菌菌株GV3103本实验室保存。克隆载体pMDl8-T Simple Vector、中间载体pDNOR、大肠杆菌DH5α、反转录试剂盒、Real time RT-PCR试剂盒、以及SYBR Premix Ex Taq均购自TaKaRa公司，DNA纯化试剂盒、质粒DNA快速抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工有限公司。所用引物合成及测序均由上海生工生物技术服务有限公司完成。
一、棉花GhEDR2基因的克隆及序列分析
1.总RNA的提取
将棉花抗病品种豫棉21种植在花盆中，待棉花幼苗子叶完全伸展时，取棉花叶片按照TaKaRa公司RNA提取试剂盒说明提取总RNA。使用TaKaRa公司的PrimerScript^TM反转录酶进行cDNA合成。
2.GhEDR2基因的分离
根据同源基因序列的相对保守性，用拟南芥EDR2基因的碱基序列，用tblastn程序在GenBank的棉花ESTs数据库中进行比对，将比对后的ESTs按照同源性高低进行排序，并选择匹配分值高、E值低的序列。根据获得的具有完整编码区的同源基因序列，采用Prier Premier 5.0设计引物进行PCR扩增。
GhEDR2 F GCTCACAATCAAAATCATAATCAA
GhEDR2 R CAGGGAAGATGTGAAAAACG
PCR扩增体系：反应总体积为40(μL)的体系，模板2，P1/P2 2/2，DNTP3，BUFFER 4，TAQ 0.4，水26.6。PCR反应条件为：95℃预变性7min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸180s，变性、退火、延伸35个循环后，72℃再延伸10min，4℃保温。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR产物的目的DNA条带用干净解剖刀从琼脂糖胶中切下放在1.5mL的离心管中，然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段。纯化回收完成后，取5μL进行电泳检测。
3.PCR产物的连接
根据Takara pMD18-T Vector的说明书，将回收的GhEDR2片段和pMD18-T Vector于冰上融化后短暂离心，在1.5mL的离心管中建立如下反应体系：回收产物(GhEDR2片段)5μL，连接Mix 4.5μL，pMD18-T Vector 0.5μL，总体积10μL。所有产物加好后，用移液器轻轻混匀，16℃过夜连接。
4.连接产物的转化
-70℃冰箱中取出一管感受态细胞置于冰浴中，向感受态细胞悬液中加入目的DNA 5μL，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30分钟，将离心管置于42℃水浴中放置90秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。向每个离心管中加入900μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床震荡培养45分钟(150转/分钟)，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将离心管内容物混匀，吸取100μL已转化的感受态细胞加到75μMAmp⁺的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。再将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。
5.重组质粒的PCR鉴定
分别挑选8个白斑接种到8个含有Amp⁺抗性的LB液体培养基的1.5mL的离心管中，置于37℃摇床震荡培养5小时后，以这些菌液为模板进行PCR检测，然后电泳检测PCR产物，分别选取与目的片段大小一致的克隆测序，DNA测序由上海生工生物技术服务有限公司完成。
二、棉花GhEDR2基因在不同组织及黄萎病诱导下基因的表达分析
1.样品的采集和处理设置
将抗病棉花品种豫棉21种子脱绒后种植在花盆中，供试土壤为蛭石。子叶长出后定苗，每盆留苗3棵。培养条件为昼夜温度分别为28℃、20℃，每天光照16h，黑暗8h，培养至两周出现2片真叶完全展开时，进行黄萎病病原菌接种。采用蘸根法接种大丽轮枝菌V991，孢子浓度为1.0×10⁷mL^－1，分别于接种后12、24、36、48、72和96h取棉株幼根，同时取未接种黄萎病菌的棉株幼根作为对照，经液氮冷冻后，保存于－80℃冰箱。
2.Quantitative Real-time RT-PCR方法
利用Quantitative Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法，检测GhEDR2在棉花根、茎、叶中的表达情况及其黄萎病诱导后的不同时段的表达情况，GhEDR2扩增的一对引物为GhEDR2-F：5’-ATGGTTTCAAGGGCAGGAT-3’；GhEDR2-R：5’-AATGCCAGGGAGGAAGGT-3’。以棉花ubiquitin基因(登录号：AY189972)作为内标基因，扩增一对引物为Ubi-F：5’-AAGACCTACACCAAGCCCAAG-3’；Ubi-R：5’-ACACTCCGCATTAGGACACTC-3’。ubiquitin与目的基因同机分管扩增。
qRT-PCR所用的反应体系为25μl，其中模板是定量稀释后的0.5μl cDNA。扩增条件为：95℃，1min；95℃，5s；59℃，30s；72℃，30s；78℃，82℃，85℃各读板一次，设置40个循环，绘制溶解曲线。以ubiquitin基因为内参，生物学实验重复3次。运用比较Ct法求得GhEDR2基因在根、茎、叶中的相对表达量，其中计算公式Y＝10^△Ct/3×100％(△Ct是内标基因Ct和目的基因Ct的差值，即△Ct＝Ct_Ghubi–Ct_Gh EDR2)；运用Opticon Monitor 2软件计算样品的Ct值，并采用2^-△△Ct计算方法求得不同处理下样品的相对表达量。
3.组织特异表达分析
棉花的根、茎、叶等器官的总RNA被抽取，反转录成cDNA，利用该cDNA作为模板进行定量qRT-PCR分析，结果表明GhEDR2基因在这些组织器官中均有表达，GhEDR2基因在棉花植株中的表达呈现了组织特异性的特点(如图1所示)，GhEDR2在根的表达量最高、其次为茎，而在叶中的表达量较低，说明这个基因是一个组成型表达基因，暗示该基因的功能可能存在组织特异性。
4.黄萎病诱导下基因的表达
如图2所示，在接种黄萎病强致病力落叶型菌株V991之后根部基因瞬时上调表达，表现为接种12h后基因表达量升高10倍以上，24～36h表达量大幅降低，48h之后表达量便与0h表达量已没有显著的差异，96h之后表达量恢复到接种前的水平。
三、GhEDR2基因植物表达载体的构建
1.带有ATTB位点的基因序列的扩增
以扩增得到的目地基因GhEDR2全长产物为模板，设计attB引物，
attB1
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGGGATCAGGCGATGG
attB2
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCCATCCAGTGGTACAGCAG
通过PCR反应在全长基因的两端分别引入接头attBl与attB2，用于载体重组。PCR反应体系为：反应条件：95℃10min、35个循环包括95℃30S、55℃30S、72℃3MIN、最后72℃10MIN。琼脂糖电泳后用DNA纯化试剂盒回收PCR产物。
2.入门载体的构建
首先，进行入门载体的构建，如图3所示。通过BP反应将上述得到的带有attB接头的目的基因GhEDR2与入门载体pDONER/Zeo进行重组。配置如下BP反应体系：基因3μL，载体(PDONR)1μL，BP酶1μL，过夜连接。将所得产物进行大肠杆菌DH5α感受态转化，并均匀涂布到带有终浓度为25μL/mlZeocin抗性的低盐LB固体培养基上，37℃培养12～18小时，筛选阳性克隆，进行测序 检测。将测序验证正确的克隆菌液接种于2mL带有Zeocin抗性的液体LB培养基中进行扩大培养。在37℃摇床中培养6～8小时至OD值达到1.0，采用质粒提取(小量)试剂盒进行质粒抽提。
3.表达载体的构建
本发明中所使用的终载体为pEARLEGATE101载体，通过改造pEARLEGATE101载体，在其平末端限制性内切酶位点插入包含attR重组位点的cassette，使之成为Gateway兼容载体。通过LR反应将上述目的基因交换至最终的表达载体pEARLEGATE101，配置如下LR反应体系：GhEDR2-pDONR3μL，pEARLEGATE101载体1μL，LRASE 1μL，反应过夜。然后将所得产物转化大肠杆菌感受态。转化菌液均匀涂布到带有Kan抗性的LB固体培养基上，37℃培养12～18小时。筛选阳性克隆并测序验证，提取阳性克隆质粒，即得到表达载体GhEDR2-pEARLEGATE101。
4.重组质粒农杆菌的转化
将上述获得的表达载体GhEDR2-pEARLEGATE101质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞。在培养好的平板上挑取阳性单菌落，加入到800μL抗性LB液体培养基(50mg/LKan+50mg/LRif+50mg/LGen)中，28℃摇床培养6～8小时。培养菌液作为PCR检测的模板进行目的基因检测。具体操作步骤如下：取过夜培养农杆菌菌液100μL加入新的EP管中，4000rpm离心5min，弃上清；取5μLddH20加入EP管中，轻轻吹打沉淀，重悬菌体，将EP管置于98℃水浴锅中煮15min，作为PCR的模板进行PCR检测。经凝胶电泳检测得到的阳性表达载体GV3101菌株后，存菌备用。
5.GhEDR2基因的亚细胞定位
将转入了GhEDR2基因表达载体的农杆菌GV3101黑暗环境下震荡培养，待农杆菌培养至OD＝0.6时，3000rpm离心10分钟，用MS培养基(4.4克MS粉，20克蔗糖，pH 5.6定容1升)，将菌液沉淀悬浮，调OD₆₀₀＝0.6，加入MES(10mM，AS 200μL)，静置3小时备用。用1mL的一次性注射器针头在烟草叶片背面刺1-3个小孔，用手抵住叶面的小孔处，然后用无针头的针管将农杆菌的菌液沿小孔通过渗透压缓慢注入叶片组织空隙，在培养间培养2天，随后在激光共聚焦显微镜下进行观察。图4中a图是融合蛋白(GhEDR2-YFP)在细胞内的分布情况，b图是代表在普通白光下细胞的形态，c图是将a图和b图重叠在一起产生的。GhEDR2蛋白主要定位于细胞膜和细胞核，胞质中的细胞骨架上有少量分布。
四、转基因拟南芥的遗传转化和PCR分子鉴定
采用蘸花法侵染转化拟南芥方法：将上述得到的阳性GV3101菌株扩大培养，接种于5mL LB/(Gen十Kan十Rif)液体培养基中，28℃，250r/min振荡培养过夜。次日加入300mL LB/(Gen十Kan十Rif)液体培养基，28℃，250rpm振荡培养16-20h，4500rpm离心10min，弃上清，收集菌体，用300mL拟南芥转化Buffer(1/2MS)悬浮；将处于生长旺盛且花蕾较多的拟南芥花序倒置，浸入含有重组质粒的农杆菌中侵染60s，小心取出，弹去多余的液体；用保鲜膜密封，倒置于暗培养过夜，24h-48h后掲去保鲜膜，正常培养。大约半个月至一个月后，收获成熟种子。将收获种子置于4℃，48h春化后播种，正常培养。待长至2-3片真叶时用除草剂Basta(稀释1000倍)进行喷洒筛选处理，经3-4次筛选后获得T0代抗性植株。对筛选出的抗性植株采用CTAB法抽提拟南芥基因组DNA。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，部分阳性再生植株的PCR结果如图5所示(1 为扩增克隆载体的结果；2为非转基因拟南芥的结果；3-10为转入GhEDR2基因拟南芥的结果)。这些PCR结果表明基因已整合到拟南芥植株的染色体组中。
五、GhEDR2转基因拟南芥T1带植株的抗病性鉴定
待拟南芥生长1个月后进行抗病性鉴定，所用菌株分别为落叶型强致病力黄萎病菌V991，病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25℃，180rmin培养5-6d，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。接种方法为苗期抱子悬浮液灌根法，每盆接种抱子数为1×10⁷，每个转基因株系每种病原菌的鉴定株数需大于24株，接种后每天观察病害的发生情况，在14天后就可以明显看见发病症状，主要表现为叶片黄化，萎蔫，生长延缓。病指按照以下标准进行鉴定，0级：无病植株；1级：0.1％-25％叶片发病的植株；2级：25％-50％叶片发病的植株；3级：50％-75％叶片发病的植株；4级：75％以上叶片发病的植株，病情指数＝(各病级病株数又相应病级)/(调查总株数×4)×100％，对转基因植物的抗病性鉴定结果显示，黄萎病病原菌接种15天后(如图6所示)，5个转基因株系的平均病指仅为17.3％，而对照达到50.8％；接种黄萎病20天后(如图7所示)，5个转基因株系的平均病指仅为34.8％，而对照达到90.2％。转基因拟南芥株系的发病率明显低于对照。从转GhEDR2基因拟南芥的抗病性鉴定结果可得出，陆地棉GhEDR2基因在拟南芥抗黄萎病的过程中起重要作用，也可以推断出GhEDR2基因可在其他植物抗黄萎病中得到应用，如双子叶植物和单子叶植物，特别是拟南芥、棉花和玉米。
<110>山西省农业科学院棉花研究所
<120>棉花GhEDR2基因及其编码蛋白与应用
<160>2
<210>1
<211>2449
<212>DNA
<213>棉花
<221>CDS
<222>（1）…（2449）
<400>1
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<211>816
<212>PRT
<213>棉花
<222>（1）…（816）
<400>2
MetIleLeuPheLeu  LeuIleValThrCys  SerLeuGlnGlnIle  AspGluGlnCysPhe  20
PheIleMETProThr  LeuTyrLysLysAla  GlyPheMetAlaGly  SerGlyAspGlyGly  40
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ValTyrHisValGly  ThrAsnSerIleGly HisGluTyrSerHis GlnArgPheLeuTyr  100
ValLysGlyLysTyr  ValGluMetTyrArg ArgAspProGlnGlu AsnProGlyIleArg  120
ProIleArgLysGly  IleIleGlyProThr LeuMetValGluGlu ThrGlySerArgLys  140
ValGlyAsnGluGlu  LeuTyrThrIleGln PheTyrAsnArgLeu AspGluThrLysLys  160
GlyGluIleAlaCys  ThrSerAlaGluGlu SerLysLysTrpIle GluAlaLeuAspTyr  180
AlaLysGlnGlnAla  GluTyrGluLeuSer ArgGlyGlyGlyAla ArgAsnLysLeuSer  200
LeuGluAlaAspIle  AspLeuGluGlyHis ArgProArgValArg ArgTyrAlaSerGly  220
LeuLysLysLeuIle  ArgIleGlyGlyGly ProGluLeuLeuSer ArgSerSerSerSer  240
LeuGlyThrGlySer  SerAspGlyAspPhe GluGlyGluPheGly AspAlaValGluAla  260
HisGluTrpLysCys  ValArgThrIleAsn GlyValArgIleLeu GluAspValAlaAsp  280
GlyLysGlyGlyLys  AlaSerLeuValLys AlaValAlaProVal AspAlaSerAlaAsp  300
ThrValLeuGluVal  IleLeuAsnLeuAsp ArgHisLysArgTyr GluTrpAspMetLeu  320
ThrGlyAspLeuGlu  LeuValAspSerTyr AspGlyAsnTyrAsp ValValTyrGlyThr  340
TyrAspProLysTyr  LeuGlyArgTrpGln SerLysArgAspPhe ValPheSerArgGln  360
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GlyArgTrpLysLys  SerSerSerCysSer LysPheGluLysThr IleProPheAlaLeu  440
LeuSerGlnValAla  GlyLeuLysGluTyr IleGlyAlaAsnPro SerLeuLysCysGlu  460
ProSerSerLeuAla  LeuHisSerLysHis SerGluGlyAspPro ProAspGluPheTyr  480
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