抗氧化剂接枝的多糖及其用途 本发明涉及用抗氧化剂接枝的多糖，特别是与位阻酚接枝的透明质酸或交联的透明质酸。
在哺乳动物关节中的滑液起着润滑剂和减震剂的作用。滑液中最重要的成分是透明质酸钠，它对滑液的机械性能的贡献最大。透明质酸是天然存在的高分子量的葡糖氨基聚糖(glycosaminoglycan)，具有重复双糖单元2-氨基-2-脱氧-3-O-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-D-葡萄糖。所述双糖通过β1→4糖甙键连接形成无支链、不交联的多糖链。透明质酸除在滑液中存在外，还存在于细胞外壳、胞周凝胶、脊椎动物结缔组织的胞外基质物质、眼地玻璃体液、人的脐带组织、公鸡冠和一些细菌中。
在例如由骨关节炎或类风湿性关节炎所致的关节发炎期间，透明质酸的分子量及其浓度均降低。透明质酸的分子量减小使滑液作为减震剂的能力减弱，于是该滑液对该关节的软骨不能提供适当的保护。此外，透明质酸的分子量减小还能降低粘度，因而促进其由关节渗出。在晚期关节炎的情况下，软骨被腐蚀掉了，当关节运动时会产生疼痛(参见例如“The Merck Manual of Diagnosis and Therapy-16th Edition”，第1338-1342页)。
所述透明质酸的分子量减小和透明质酸钠由滑液中快速流失的原因之一是该分子被羟基游离基降解。羟基游离基的来源有两个。主要来源是白细胞，当关节发炎时，白细胞进入该关节，并释放黄嘌呤过氧化酶和其它的酶，形成过氧化物阴离子、过氧化氢和次氯酸盐，一旦分解，便形成羟基游离基。羟基游离基的另一个来源为氧在铁存在下被还原剂还原的还原反应。在体内通常的还原剂是抗坏血酸。氧被铁(II)还原成过氧化物阴离子，然后它与铁(III)反应形成过氧化氢。过氧化氢被还原成羟基游离基。
已有报导使用中等分子量的透明质酸钠作为比赛用马腿关节的补充滑液(Balazs等人，J.Equine Vet.Sci.，第217-228页，1985)。然而人的关节滑液中的透明质酸钠的分子量比马的高得多。
还有人进行了将透明质酸钠的溶液通过注射入人的骨关节炎的关节中作为补充滑液的实验。下列文献披露了通过注射透明质酸钠治疗关节炎的方法：Weiss等人，Semin.Arthritis Rheum.，11，第143页，(1981)；Nakimi等人，J.Clin.Pharmacol.Therapy Toxicology，20，第501页，(1982)；Grecomoro等人，Pharmatherapeutica，5，第137页，(1987)和Briganiti等人，Clinical Trials Journal，24，第333页，(1987)。然而，已有报导说关节内注射透明质酸钠溶液与安慰剂没有多少差别(Dahlberg等人，Arthritis & Rheumatism，37，第521页，1994)。Brown等人在Exp.Physiol.76，第125页，(1991)中报导：关节中注射的透明质酸的半衰期仅为大约13小时。Dahlberg(见上)披露：13小时半衰期对于治疗来说为短。据认为，注射的透明质酸的半衰期短，部分因为被羟基游离基的降解(J.M.McCord，Science，185，第529页，1974)。
本发明涉及通过将多糖、特别是透明质酸和透明质酸钠与抗氧化剂接枝增强多糖、特别是透明质酸和透明质酸钠对羟基游离基的抗性的新方法。
本发明涉及含有在多糖的至少一个羟基基团上与抗氧化剂接枝的多糖的接枝多糖组合物。
在优选的实施方案中，所述多糖包括含有酸性基团的多糖。在最优选的实施方案中，所述多糖包括透明质酸或透明质酸的盐；所述抗氧化剂包括位阻酚；并且所述接枝的组合物对羟基游离基的抗性比未接枝的透明质酸或其钠盐的大得多。
在另一个实施方案中，本发明涉及多糖的接枝方法，包括使多糖与抗氧化剂的羟基活性衍生物反应。
在另一个实施方案中，本发明还涉及用于治疗哺乳动物关节的炎症例如关节炎、预防手术后粘连形成和促进慢性创伤愈合的药用组合物，它含有本发明的抗氧化剂接枝的多糖作为活性成分。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗氧化剂接枝的已交联的多糖的药物传输体系。
本发明还涉及包含本发明的接枝多糖的美容用组合物。
在再一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物关节的炎症例如关节炎、降低手术后粘连形成的发生率和促进慢性创伤和溃疡愈合的方法，它包括注射或施用有效量含有本发明抗氧化剂接枝的多糖作为活性成分的药用组合物。
本发明的接枝多糖组合物包含在该多糖的至少一个羟基基团上接枝了抗氧化剂的多糖。
本发明的组合物包含具有选自下列的分子式的物质：R-(O)-R2NH-Ar-HNR2，R-(O)-R2-Ar-NH-Ar式中R代表含有酸性基团或其盐的多糖或交联多糖的主链，-(O)-是多糖羟基基团的残基，R1是氢、C1-C20烷基、苯基或取代的苯基，R2是C1-C20烷基、苯基或取代的苯基，和Ar是芳基或取代的芳基。
本发明的组合物优选包含具有选自下列的分子式的物质：式中R代表含有酸性基团或其盐的多糖或交联多糖的主链，-(O)-是多糖羟基基团的残基，R1是氢、C1-C20烷基、苯基或取代的苯基，和R2是C1-C20烷基、苯基或取代的苯基。
在式I-V中，最好是，R1选自氢、甲基、乙基、异丙基和叔丁基，和R2选自甲基、乙基、异丙基和叔丁基。
所述组合物更优选包含式I、II和IV物质，式中R1和R2是叔丁基，并且所述多糖包括透明质酸。
用在本发明中的多糖包括例如选自下列的物质：阿拉伯胶，刺梧桐树胶，西黄耆胶，刺槐豆胶，瓜尔胶，欧车前胶(psyllium gum)，淀粉，果胶，琼脂，藻酸，丹麦琼脂，葡聚糖，黄原胶(xanthan)，羧甲基纤维素，甲基纤维素，羟基乙基羧甲基纤维素，羧甲基淀粉，阳离子淀粉，透明质酸，硫酸软骨素，硫酸角质素，硫酸皮肤素，硫酸乙酰肝素，肝素，聚半乳糖醛酸，聚甘露糖醛酸，聚葡糖醛酸和角叉菜胶。
本发明的多糖优选包括含有酸性基团或酸性基团的盐的多糖。优选的酸性基团包括至少一种选自羧基、硫酸根、亚硫酸根和磷酸根的基团。最优选的酸性基团是羧基。
含酸性基团的多糖可以包括例如选自下列的物质：透明质酸，硫酸软骨素，硫酸角质素，硫酸皮肤素，硫酸乙酰肝素，肝素，羧甲基纤维素，羟基乙基羧甲基纤维素，羧甲基淀粉，果胶，黄原胶，藻酸，聚半乳糖醛酸，聚甘露糖醛酸，聚葡糖醛酸和角叉菜胶。
按照本发明优选的盐包括碱金属或碱土金属、铝或铵的盐。最优选的盐是钠盐。
本发明的接枝多糖还可以是交联的。交联多糖可以用本领域公知的任何方法来制备。Sakurai等人在美国专利第4716224号中披露了通过将透明质酸或其盐与多官能环氧化物交联制得的交联透明质酸或其盐。Sakurai等人在美国专利第4863907号中披露了通过将葡糖氨基聚糖或其盐与多官能环氧化合物交联制得的交联葡糖氨基聚糖或其盐。Huang等人在欧洲专利申请第0507604 A2中披露了离子交联的含羧基多糖，其中的交联剂是具有三价阳离子的化合物。Mlson等人在美国专利第4716154号中披露了透明质酸与双或多官能环氧化物或其相应的卤代醇、表卤代醇或卤化物和二乙烯基砜交联。Mlson等人在美国专利第4772419号中还披露了透明质酸与多官能环氧化物交联。della Vale等人在美国专利第4957744号中披露了通过将透明质酸的羧基用多元醇酯化制得的透明质酸的交联酯。Balazs等人在美国专利第4582865、4605691和4636524号中披露了通过与二乙烯基砜反应交联透明质酸及其盐和其它多糖。Balazs等人在美国专利第5128326和4582865号中披露了透明质酸与甲醛、环氧化物、聚氮丙啶基化合物(polyaziridyl compounds)和二乙烯基砜交联。Balazs等人在美国专利第4713448号中披露了通过与醛例如甲醛、戊二醛和乙二醛反应将透明质酸化学改性，并指出交联发生的可能性。Kuo等人在美国专利第5356883号中披露通过与双碳化二亚胺反应交联透明质酸。
用于交联多糖的优选的方法是将多糖与羧酸二酐或多酐反应。优选的交联组合物包含上述R1和R2是叔丁基的式I的物质，并且多糖是通过与1，2，4，5-苯四酸二酐反应交联的透明质酸或其钠盐。
在接枝组合物中，接枝水平最易以每当量多糖重复单元中存在的抗氧化剂的当量数来表示。对本发明来说，接枝的最低水平可低至每1000当量多糖重复单元大约1当量抗氧化剂。优选的最低水平是每700当量多糖重复单元大约1当量抗氧化剂，最优选的最低水平是每600当量多糖重复单元大约1当量抗氧化剂。
接枝的最高水平可高至每10当量多糖重复单元大约1当量。优选的最高水平是每100当量多糖重复单元大约1当量，最优选的最高水平是每400当量多糖重复单元大约1当量。
现已发现，当按照本发明的抗氧化剂接枝的组合物来自透明质酸或其盐时，它对由羟基游离基所致降解的抗性比未接枝的透明质酸或其盐的大得多。
在羟基游离基降解实验中，羟基游离基按Wong等人在InorganicBiochemistry，14，第127页(1981)中所述由氯化铁与抗坏血酸反应产生。在典型实验中，粘度半衰期(viscosity half-life)对于透明质酸是0.9小时。当对接枝组合物在同样条件下进行同样的实验时，具有式I的本发明的交联的或未交联的物质，粘度半衰期均在3-48小时范围内，表明该接枝组合物对羟基游离基降解的抗性大得多；所述式I中，R，多糖，是透明质酸，和R1和R2是叔丁基。
抗氧化剂接枝的组合物通过多糖与羟基活性抗氧化剂衍生物反应来制备。术语“羟基活性抗氧化剂衍生物”是指含有能与含在多糖中的羟基基团反应的官能团的抗氧化剂。
用于制备本发明的组合物的优选的羟基活性抗氧化剂选自下列一组物质：B-R2SR2 B-R2-OP(OR2)2 B-R2NH-Ar-HNR2 VI ’ VII ’ VIII ’B-R2-Ar-NH-Ar，和 IX
式中R1是氢，C1-C20烷基，苯基或取代的苯基；R2是C1-C20烷基，苯基或取代的苯基；A是-C(O)X，-C(O)OCH2CH2OCH2CH2Y，-C(O)NHCH2CH2CH2Y，-OCH2CH2OCH2CH2Y或-CH2Y；B是-C(O)X，-CH2Y或X；X是卤素，1-咪唑，苯氧基，硝基苯氧基，对甲苯磺酸根，甲磺酸根或者烷基或芳基羧酸根；Y是卤素，对甲苯磺酸根和甲磺酸根。
优选的羟基活性抗氧化剂包括结构XII的羟基活性位阻酚，其中R1是氢、甲基、乙基、异丙基或叔丁基，和R2是甲基、乙基、异丙基或叔丁基。术语“位阻酚”是指在该羟基的邻位至少有一个位置被苯基、取代的苯基或C1-C20烷基取代基占据的酚类化合物。
优选的结构XII的羟基活性位阻酚包括式中取代基如下定义的化合物：R1和R2是叔丁基，A是-C(O)X，-CH2Y或C(O)OCH2CH2OCH2CH2Y；其中X是氯或1-咪唑，和Y是溴。具体来讲，优选的羟基活性位阻酚是3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰氯，2，6-二叔丁基-4-溴甲基苯酚，3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酸2-[2-(氯乙氧基)乙氧基]乙酯和3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰基-1-咪唑。
由于羟基活性抗氧化剂衍生物可能易与水反应，因此它们与多糖反应最好在干燥的、极性的非质子传递溶剂中进行。优选的溶剂是N-甲基吡咯烷酮，N-乙基吡咯烷酮，N-环己基吡咯烷酮，4-甲基吗啉N-氧化物，二甲基甲酰胺，四氢噻吩砜和二甲亚砜。
酸性多糖的盐可能在所述优选的溶剂中不溶解。特别是，透明质酸的钠盐不溶于所述优选的溶剂中，因此，就这个实施方案而言，一般宜将该钠盐转化成四烷基铵盐以增加溶解度。四烷基铵盐与羟基活性抗氧化剂衍生物接枝反应后，产物可通过离子交换转换回该钠盐形式。
若要制备抗氧化剂接枝的交联组合物，交联反应可在该接枝反应之前或之后进行。当用于交联的溶剂与用于接枝反应的溶剂相同时，交联反应还可以与接枝反应同时进行。
在接枝反应中，羟基活性抗氧化剂衍生物与多糖之比最易以每当量多糖中的重复单元所用的抗氧化剂衍生物的摩尔数来表示。对本发明来说，羟基活性抗氧化剂衍生物的最低水平可低至每1000当量多糖重复单元大约1当量。优选的最低水平是每700当量多糖重复单元大约1当量，而最优选的最低水平是每600当量多糖重复单元大约1当量。
羟基活性抗氧化剂衍生物的最高水平可高至每10当量多糖重复单元大约1当量。优选的最高水平是每100当量多糖重复单元大约1当量，最优选的最高水平是每400当量多糖重复单元大约1当量。
如上所述，在其它的实施方案中，本发明涉及用于治疗哺乳动物关节的炎症例如关节炎、预防手术后粘连和促进慢性创伤和溃疡愈合的组合物。这些组合物的活性成分包括本发明抗氧化剂接枝的多糖。优选的抗氧化剂接枝的多糖是位阻酚接枝的透明质酸或位阻酚接枝的交联透明质酸，或其药学上可接受的盐。
药学上可接受的盐包括碱金属或碱土金属、铝或铵盐。优选的药学上可接受的盐是钠盐。
本发明的抗氧化剂接枝的多糖组合物可用于预防手术后易产生不希望的粘连的任何动物的术后粘连。该组合物能用于防止哺乳动物、特别是人的粘连发展。它们可用于需要抑制术后粘连形成的所有类型的手术，例如腹部手术，妇科手术，胸部手术，矫形外科手术，神经手术和眼科手术。用于这种用途的优选的组合物是位阻酚接枝的透明质酸或位阻酚接枝的交联透明质酸，或其药学上可接受的盐。
粘连预防剂可以任何常规方式例如冲洗、以凝胶、乳膏、薄膜或泡沫直接涂敷至手术创伤部位或采用任何其它的常规方法施用至手术创伤部位。粘连预防剂可在重伤口愈合之前的任何时间使用，最好是在手术结束时在将伤口封闭之前使用。但在某些情况下，在一段时间内连续使用粘连预防剂可能是合乎需要的。粘连预防剂的有效量是能降低外科手术后粘连的发生率的必需量。该量最好应足以将该整个手术创伤部位覆盖，并且，若期望，另加一些量以足能覆盖与创伤部位邻接的身体组织。
本发明的抗氧化剂接枝的多糖组合物还可用于促进哺乳动物、特别是人的慢性创伤例如烧伤和溃疡例如糖尿病性脚部溃疡的愈合。用于这种用途的优选的组合物是位阻酚接枝的透明质酸或位阻酚接枝的交联透明质酸，或其药学上可接受的盐。透明质酸能保湿，还具有血管生成特性，这使得它可用于这种用途。当用于使伤口愈合时，该组合物可单独以水溶液、最好是生理盐水形式使用，或者该溶液可与愈伤药和其它水溶性聚合物合用。可将其以任何常规方式例如冲洗、以凝胶、乳膏、薄膜或泡沫形式直接涂敷至创伤或溃疡部位、以可施用于伤口或溃疡上的绷带或伤口敷裹浸渍或采用任何其它的常规方法施用至创伤或溃疡部位。促进愈合的有效量是足以将整个伤口或溃疡部位覆盖的量，并且，若期望，另加一些量以足能覆盖与该伤口或溃疡部位邻接的身体组织。典型的抗氧化剂接枝的多糖可以包含水溶性聚合物、抗生素、免疫抑制剂和减痛剂作为其它成分。
在使用本发明的接枝透明质酸或交联的接枝透明质酸治疗哺乳动物、特别是人的关节炎症例如关节炎时，通常将该透明质酸衍生物溶于生理盐水中以有足够的粘度通过注射针头。最大粘度为大约50000cps，最好为大约30000cps。最小粘度为大约5000cps。然后将该治疗溶液注射入患病关节内。
典型的膝关节滑液补给注射法与Miller等人在J.Bone and JointSurgery，40，第636页(1985)中所述的方法类似。在该方法中，将2.5ml抗氧化剂接枝的透明质酸的钠盐(接枝透明质酸的浓度：10mg/ml)在缓冲盐水(氯化钠8.5mg/ml，磷酸氢二钠0.537mg/ml，磷酸二氢钠0.016mg/ml)中的灭菌溶液缓慢吸入注射器中以确保无气泡。然后将膝用肥皂清洗、涂抹溴化十六烷基三甲基铵并涂擦碘酊，以准备注射。将该溶液通过预标记的位于通过胫骨坪连接的关节的外侧、髌韧带缘和外侧股骨髁曲的三角弧注射入滑膜腔内。在注射前可以采用局部麻醉。在某些情况下，在滑液补给注射之前可能需要用缓冲的盐水溶液进行膝吸引术。这样的方法见Dahlberg等人在Arthritis & Rheumatism，37，1994，第521页中所述。
该注射液除所述接枝组合物外还可以含有其它物质，包括水溶性聚合物例如硫酸软骨素、硫酸皮肤素，和/或磷脂以改善该溶液的润滑能力。还可以添加麻醉剂，抗炎剂，抗生素，抗菌剂，细胞毒素和糖。
本发明的抗氧化剂接枝的多糖、特别是交联形式可用作药物传输体系。用于这种用途的优选的组合物是位阻酚接枝的透明质酸或位阻酚接枝的交联透明质酸，或其药学上可接受的盐。交联透明质酸能形成分子笼(molecular cage)，具有药理活性的分子可分散在其中。包含在所述笼中的物质通过扩散释放进入环境中。药物分子或药物分子的混合物与该透明质酸可以是共价键合或非共价键合。共价键合可能是通过与该透明质酸部分的羧酸或羟基基团相连。透明质酸基组合物的凝胶、薄膜、线剂、颗粒或海绵可被置于、喷雾至、吸入、注射入或植入需要该所含药理活性物质的位置。这些物质可以是治疗药(例如麻醉剂，镇痛剂，抗炎剂，利尿剂，拮抗剂，抗生素，激素，抗风湿剂，肾上腺素能受体激动剂，细胞抑制剂，抗高血压剂或免疫抑制剂)，生长因子，酶或细胞抗粘连化合物。
本发明的抗氧化剂接枝的多糖还可以用作局部用美容剂的组分。用于这种用途的优选的组合物是位阻酚接枝的透明质酸或位阻酚接枝的交联透明质酸，或其药学上可接受的盐。由于透明质酸在低相对湿度条件下具有保湿作用并能在高相对湿度条件下产生令人愉快和光滑的感觉，因此，在美容制品中已将其用作保湿剂。本发明组合物能产生类似的作用。还可以使用该接枝透明质酸组合物与其它低成本的水溶性聚合物例如羧甲基纤维素、果胶、藻酸盐、大豆蛋白、酪蛋白和明胶的混合物。
可以将植物来源的天然的提取物例如cactus aloe vera、牧豆树属植物、母菊、姜黄、胡萝卜、jojoba、玫瑰和其它植物的提取物混入含有接枝透明质酸的美容制品中。α-羟基酸例如乳酸和羟基乙酸可被加至该制品中以改善皮肤的适应性。
典型的抗衰老美容组合物是：7％2-羟基乙酸、15％丙二醇、1％位阻酚接枝的透明质酸溶液(1g/100ml)、60％水和17％乙醇，所有的百分数均为重量百分数。
面用软凝胶的配方是：25％羧甲基纤维素水性浆液(3g/100ml)，11％三乙醇胺水溶液(10g/100ml)，5％Methyl Gluceth-10，1％位阻酚接枝的透明质酸水溶液(1g/100ml)，1％香料和防腐剂，57％水，所有的百分数均为重量百分数。
典型的基础皮肤保湿剂组合物是：0.5％羟基乙基纤维素，2％Methyl Gluceth-10，2％甘油，1％位阻酚接枝的透明质酸水溶液(1g/100ml)，94％水，0.5％防腐剂和香料，所有的百分数均为重量百分数。
下面用下列实施例举例说明本发明，这些实施例用作代表，不应被认为是对本发明范围的限制。除另作说明外，实施例中的所有份数和百分数均按重量计。
实施例1
3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰氯的合成
使3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酸(4克)、20ml己烷和20ml亚硫酰氯的混合物沸腾4.5小时。蒸馏去除溶剂和过量的亚硫酰氯，留下固体，不经进一步纯化直接使用。为鉴定该酰氯，将少量样品用过量的无水乙醇和三乙胺终止反应，并用水和二氯甲烷萃取。将溶剂蒸发后，得到油状物。1H NMR光谱(CDCl3，ppm(自TMS))证实该油状物是相应的酯：7.9ppm(s，Ar，2)，5.25ppm(s，OH，1)，4.3ppm(q，CH3，18)和1.44ppm(t，CH3，3)。该结果证实已生成3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰氯。
实施例2
2，6-二叔丁基-4-溴甲基苯酚的合成
使1g 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚、0.9g N-溴丁二酰亚胺和40ml四氯化碳的混合物沸腾1.5小时。滤除丁二酰亚胺，并将得到的有机溶液蒸发，得到具有下列1H NMR光谱数据(CDCl3，ppm(自TMS))的粘性液体：7.05ppm(s，ArH，2)，5.15ppm(s，OH，1)，4.35ppm(s，CH2Br，2)和1.3ppm(s，CH3，18)。
实施例3
3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰基-2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙酯的合成
在-个装有迪安-斯达克榻分水器的250ml烧瓶中，将5g 3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酸、3.7g 2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇、0.1g对甲苯磺酸和60ml甲苯的混合物加热沸腾4天。将得到的混合物用水和二氯甲烷萃取，然后将该二氯甲烷溶液用MgSO4干燥。蒸发溶剂，得到6.97g具有下列1HNMR光谱数据(CDCl3，ppm(自TMS))的酯：7.9ppm(s，ArH，2)，5.72ppm(s，OH，1)，5.45ppm(m，CH2，2)，3.86ppm(m，CH2，2)，3.7ppm(m，CH2，6)，3.6ppm(m，CH2，2)和2.45ppm(s，CH3，18)。
实施例4
3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰在-1-咪唑的合成
将1g 3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酸、0.7g 1，1’-二羰基二咪唑和50ml二氯甲烷的混合物于室温搅拌17小时。除去溶剂后，将产物在甲苯和己烷中重结晶，得到吸湿性固体。将该固体的少量样品与0.2g乙醇和2ml二氯甲烷混合，并静置10小时。除去溶剂后，如实施例1用1H NMR仅鉴定出相应的乙酯。该结果表明已生成3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰基-1-咪唑。
实施例5
透明质酸的甲基三辛基铵盐的制备
向10g透明质酸钠(发酵产物，Chisso Corporation，Chiba，Japan)在1000ml水中的溶液中加入50g氯化甲基三辛基铵(Aliquat 336，Aldrich Chemical，Milwaukee，Wisconsin)在50ml丙酮中的溶液。将混合物搅拌过夜，然后滤出橡胶状沉淀物，用水和丙酮洗涤，然后真空干燥过夜。将其再浸入500ml丙酮中7小时，并真空干燥过夜，得到46.9g橡胶状物质。
实施例6
3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰氯与透明质酸接枝
向10g透明质酸的甲基三辛基铵盐(用实施例5的方法制得)在1000ml干燥的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的溶液中加入0.4g 3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰氯(实施例1)。使该混合物翻滚3小时，然后于10℃储存16小时。为离子交换回钠盐，然后将NaCl水溶液(15g，在250ml水中)加至反应混合物中。将得到的溶液搅拌1小时后，加入3g碳酸氢钠和200ml丙酮以使产物沉淀。将聚合物过滤，用丙酮/水(比率：4/1,200ml)洗涤5次，然后用100ml丙酮洗涤。通过将产物再溶于1l水中然后使其沉淀入大体积的甲醇中而将产物进一步纯化，得到4g产物。
实施例7
3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰基-1-咪唑与透明质酸接枝
向2g透明质酸的甲基三辛基铵盐(用实施例5的方法制得)在280ml NMP中的溶液中加入0.25g 3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰基-1-咪唑(实施例4)。将该混合物于45℃保持20小时。然后将其按实施例6中所述离子交换回钠盐形式。产物重0.92g。
实施例8
3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰氯与同双酚A的二环氧甘油醚交联的透明质酸接枝
首先通过将2g透明质酸的甲基三辛基铵盐(用实施例5的方法制得)、0.2g双酚A的二环氧甘油醚和280ml NMP混合并将该混合物于45℃保持24小时，进行交联反应。然后向该混合物中加入0.2g 3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰氯，并将该全部反应混合物于室温保持17小时。将产物转化成钠盐并按实施例6中所述进行后处理。
实施例9
3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰氯与同1，2，4，5-苯四羧酸二酐交联的透明质酸接枝
向5g透明质酸的甲基三辛基铵盐(用实施例5的方法制得)在700mlNMP中的溶液中加入0.5g 1，2，4，5-苯四羧酸二酐。将该混合物于10℃保持7天。然后向该反应混合物中加入三乙胺(1ml)和3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰氯(0.5g)。16小时后，将产物用NaCl(0.5g)和NaHCO3(0.5g)在50ml水中的溶液进行离子交换，然后通过加入400ml丙酮使产物沉淀。滤出产物，并将其依次用4/1丙酮/水和纯丙酮洗涤。干燥后，得到2.9g聚合物。
实施例10
3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰基-2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙酯与诱明质酸接枝
将2g透明质酸的甲基三辛基铵盐(用实施例5的方法制得)和0.25g 3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酰基-2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙酯在280ml MP中的混合物于45℃保持20小时。将混合物用O.1g NaCl和0.1g NaHCO3在20ml水中的溶液处理，并按实施例9进行后处理。干燥后，得到1.0g聚合物。
实施例11
接枝透明质酸对羟基游离基降解的抗性
羟基游离基用Wong等人在Inorganic Biochemistry，14，第127页(1981)中所述的铁离子与抗坏血酸的反应产生。
向100ml位阻酚接枝的透明质酸的钠盐的水溶液(如所示，0.3-0.6％(重量/体积)，在pH7.4缓冲)中加入0.25ml氯化铁溶液(1.1g，在20ml水中)和0.25ml抗坏血酸溶液(0.64g，在20ml水中)。将混合物振摇大约10秒钟，然后在10分钟后测定第一粘度(Brookfield)。将这一点的粘度认作100％。样品的降解抗性通过测定粘度降低至10分钟值的50％所需的时间(粘度半衰期)来评定。对照为透明质酸钠。结果见表1。 表1位阻酚接枝的透明质酸的氯化铁/抗坏血酸试验 实施例产物样品浓度，％重量/体积粘度半衰期， 小时 对照 0.4 0.9 6 0.4 3 7 0.3 4.5 8 0.34 5 9 0.6 48 10 0.3 5