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1、(10)申请公布号 CN 102864086 A(43)申请公布日 2013.01.09CN102864086A*CN102864086A*(21)申请号 201210385473.9(22)申请日 2012.10.12CCTCC NO： M 2012242 2012.06.28C12N 1/16(2006.01)B09C 1/10(2006.01)C12R 1/72(2006.01)(71)申请人台州职业技术学院地址 318000 浙江省台州市椒江区学院路788号(72)发明人张昕欣 于红艳(74)专利代理机构浙江杭州金通专利事务所有限公司 33100代理人吴辉辉 徐关寿(54) 发明名称一。
2、株降解多环芳烃的菌株及其在土壤修复中的应用(57) 摘要本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株降解多环芳烃的酵母（Candidainfanticola）tzyj及其在土壤修复中的应用。该菌株为酵母（Candidainfanticola）tzyj，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNO：M2012242，具备降解多环芳烃的能力。能利用土壤中的多环芳烃作碳源并降解多环芳烃，可用于多环芳烃污染土壤的修复。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书4页序列表2页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 4 页序列表。
3、 2 页1/1页21.一株降解多环芳烃的菌株，其特征在于，该菌株为酵母（Candida infanticola）tzyj，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M 2012242，具备降解多环芳烃的能力。2.根据权利要求1所述降解多环芳烃的菌株，其特征在于所述菌株具有以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力。3.根据权利要求1所述多环芳烃降解菌株，其特征在于所述菌株在多环芳烃污染土壤中具有良好的降解多环芳烃的能力。4.根据权利要求1所述多环芳烃降解菌株，其特征在于所述多环芳烃选自萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的一种或多种的混合物。5.根据权利要求1所述降解多环芳烃的菌株，其特征。
4、在于所述菌株的ITS序列如SEQ NO.1所示。6.根据权利要求1所述降解多环芳烃的菌株在多环芳烃污染的土壤的生物修复中的应用。7.利用权利要求1所述降解多环芳烃的菌株进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：选取多环芳烃污染土壤100g，将酵母（Candida infanticola）tzyj按质量百分比2.0%用量与土壤混合均匀，加水使土壤含水率保持在15%，放入恒温振荡器中，控制培养温度在25的恒温条件下，振荡培养修复120小时， 提取纯化处理后进行液相色谱分析。权 利 要 求 书CN 102864086 A1/4页3一株降解多环芳烃的菌株及其在土壤修复中的应用技术领域00。
5、01 本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株降解多环芳烃的酵母（Candida infanticola） tzyj及其在土壤修复中的应用。背景技术0002 多环芳烃（PAHs）是一类持久性有机污染物（POPs）。PAHs污染源主要来自于废旧机器油、电器产品的润滑油和来自废旧金属拆解中的木材、有机高分子化合物、纸张等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生成的。由于多环芳烃及其衍生物具有致癌性、致突变性和致畸性，以及急性毒性和亚致死作用，目前已引起人们的极大关注。0003 多环芳烃（PAHs）污染土壤修复是当前环境修复中研究的热点。生物降解是对PAHs污染土壤进行。
6、修复的重要途径之一。对于多环芳烃污染，国内外进行了大量多环芳烃降解微生物的筛选工作。到目前为止，已分离出多个具有多环芳烃降解能力的菌株，如假单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属等，并没有隐球酵母科用于多环芳烃修复的报道。0004 但是土壤中的PAHs的生物利用率一般较低，通常认为，溶解于液相中的PAHs或其他的底物可被微生物利用，反之若被吸附于土壤上，则较难被微生物利用。发明内容0005 本发明针对现有技术中土壤PAHs的生物利用率一般较低，难被微生物利用的不足之处，提供一种降解多环芳烃菌株、能利用土壤中的多环芳烃作碳源并降解多环芳烃，可用于多环芳烃污染土壤的修复。0006 为达到上述目的，本发明。
7、是通过以下技术方案得以实现的：一株降解多环芳烃的菌株，其特征在于，该菌株为酵母（Candida infanticola）tzyj，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO： M 2012242，具备降解多环芳烃的能力。0007 所述菌株具有以环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力。0008 所述菌株在多环芳烃污染土壤中具有良好的降解多环芳烃的能力。0009 所述多环芳烃选自萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的一种或多种的混合物。0010 所述菌株的ITS序列如SEQ NO.1所示。0011 所述降解多环芳烃的菌株在多环芳烃污染的土壤的生物修复中的应用。0012 利用所述降解多环芳烃的菌株。
8、进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：选取多环芳烃污染土壤100g，将酵母Candida infanticola tzyj按质量百分比2.0%用量与土壤混合均匀，加水使土壤含水率保持在15%，放入恒温振荡器中，控制培养温度在25的恒温条件下，振荡培养修复120小时， 提取纯化处理后进行液相色谱分析。0013 tzyj是从浙江省台州市固体废弃物拆解场某污染土壤中分离并筛选得到。菌株可在1535，pH值6.08.5培养条件下较好生长；菌株在YEPD平板上培养三天菌落特征为圆形，白色奶油状，表面光滑，边缘整齐；细胞卵圆形，进行出芽生殖，培养七天后出现说 明 书CN 10286408。
9、6 A2/4页4不太发达的有隔假菌丝。0014 作为优选，本发明所述菌株能以多环芳烃为唯一碳源和能源生长。0015 上述高效多环芳烃降解菌的筛选方法，可按如下步骤依次实施：（1）从固废拆解场采集距地表下520cm处表层土壤样品，作为菌源进行自然富集培养；所述富集培养基含有：胰蛋白胨、葡萄糖及酵母膏；（2）取（1）中所述富集培养液接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，所无机盐选择培养基含有：K2HPO4、MgSO47H2O、（NH4）2SO4、萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘等多环芳烃（多环芳烃萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的浓度均为150mg/L250mg/L）；（3）取（2）中所述选择培养。
10、物稀释涂布于固体无机盐选择培养基上，进行分离进行分离即得到多环芳烃降解菌tzyj。0016 上述高效多环芳烃降解菌tzyj可用于多环芳烃土壤污染的生物修复。0017 本发明tzyj可在1535，pH值6.08.5培养条件下较好生长；菌株在YEPD平板上培养三天菌落特征为圆形，白色奶油状，表面光滑，边缘整齐；细胞卵圆形，进行出芽生殖，培养七天后出现不太发达的有隔假菌丝。0018 tzyj在YEPD（葡萄糖：2.0 %；胰蛋白胨：2.0；酵母粉：1.0%）培养三天菌落特征为圆形，白色奶油状，表面光滑，边缘整齐；细胞卵圆形，进行出芽生殖，培养七天后出现不太发达的有隔假菌丝。0019 tzyj的生理生。
11、化特征，见表1。0020 表1 tzyj的生理生化特征说 明 书CN 102864086 A3/4页5tzyj的ITS基因的PCR扩增、测序由北京三博远志公司完成，得到了长度为1109bp的ITS序列。选择同源性大于97%的基因序列进行系统发育分析，表明菌株与Candida infanticola同源性最高，结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于Candida infanticola。0021 本发明tzyj既可以在营养培养基，如：普通察氏培养基、普通YEPD中生长，又可在以多环芳烃为唯一碳源、能源的无机盐基础培养基中生长。0022 综上所述，本发明具有以下优点：本发明提供的tzy。
12、j能利用土壤中的多环芳烃作碳源，对污染土壤中的多环芳烃有快速降解能力，且降解底物范围广，降解率高。使其在污染土壤牢固吸附的多环芳烃污染场修复中有着广阔的应用潜力。0023 拉丁文名： Candida infanticola tzyj保藏单位：中国典型培养物保藏中心地址：中国武汉武汉大学保藏日期：2012年6月24日保藏编号：CCTCC NO：M 2012242。具体实施方式说 明 书CN 102864086 A4/4页60024 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。0025 实施例1本发明提供的Tzyj的分离筛选方法。0026 从固废拆解场采。
13、集距地表下520cm处表层土壤样品，作为菌源进行自然富集培养，将葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g加入到一定量的蒸馏水中，配制好的培养液在121的温度条件下灭菌处理20min，在此培养基上菌液培养三天，再配制无机盐基础培养基，加入萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的多环芳烃化合物，上述加入萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的加入量为150mg/mL，在此培养基上培养三天，稀释涂布分离出一株菌命名为tzyj；该菌于2012年6月24日保藏于“中国典型培养物保藏中心”其保藏号CCTCC NO：M 2012242。0027 tzyj的ITS基因的PCR扩增、测序由北京三博远志公司完成。根据测序结果。
14、构建系统发育树。系统发育表明菌株与Candida infanticola的进化距离最近，结合形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于Candida infanticola。0028 实施例2tzyj降解污染土壤中的多环芳烃。0029 选取多环芳烃污染土壤100g，tzyj按2.0%（质量百分比）用量与土壤混合均匀，加少量水使土壤含水率保持在15%左右，放入恒温振荡器中，控制培养温度在25的恒温条件下，振荡培养修复120小时， 提取纯化处理后进行液相色谱分析， 所含萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的降解率均为90%以上。0030 本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属。
15、技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说 明 书CN 102864086 A1/2页7SEQUENCE LISTING台州职业技术学院一株降解多环芳烃的菌株及其在土壤修复中的应用1 PatentIn version 3.311109DNACandida infanticola1ttgtacacac gcccgtcgtt actaccgatt gaatggctta gtgaggcctc cggat。
16、gcgat 60tcacttgtgg gcaaccgcaa cgaagtcgca gaagctggac aaacttggtc atttagagga 120agtacaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt gaacctggga aggatcatta ttgagattca 180tattacacct gtgaaacaac tgaattgctt ggccgcaagg ccaatgtaac aaaaactatt 240ttacmtatta tatctgaaaa acgaaatcaa aagtttcaac aacggatctc ttggttctcg 300catcgagaag aacgc。
17、agcaa agcgcgatag ttagtgtgaa ttgcagacgt gaatcattga 360gtttttgaac gcacattgca ccttctggta ttccgggagg tatacttgtg cgagcgtcat 420ttcatcttca taaagcaatt tatgtgttgg ggctgtagcc agccttgaaa aagatgatag 480agtacatgtt agacacaatg tgcttttcta tatttttgac ctcgtatcaa gcaagattac 540ccgctgaact taagcatatc aataagcgga ggaaaag。
18、aaa ccaacaggga ttgccttagt 600序 列 表CN 102864086 A2/2页8agcggcgagt gaagcggcaa tagctcaaat ttgaaatctg ccaacaggcc gagttgtaat 660ttgaagaaag caattctgga tatgtctttg ctcaagttcc ttggaacagg acatcatgga 720gggtgagaat cccgtgatgc gaaggtagca tatctatgta gaatgttttc gacgagtcga 780gttgtttggg aatgcagctc aaagtgggtg gtaaatt。
19、cca tctaaagcta aatattggcg 840agagaccgat agcgaacaag tactgtgaag gaaagatgaa aagaactttg aaaagagagt 900gaaaaagtac gtgaaattgt tgaaatggaa gggcttgaga ttagacatgg tgtttagtgt 960tccactttct tttgggaatg tgtactcgct ttwcaccggg ccagcatcag ttttggtggg 1020aggataaatg gtattgaatg tggctgcttg cagtgttata gctttatcaa atacttccaa 1080ccgggactga ggaccgcgca ttgctagga 1109序 列 表CN 102864086 A。