醛糖还原酶抑制剂、其制备方法和用途技术领域
本发明涉及一种新的醛糖还原酶抑制剂，其制备方法和其用途，
更具体地说，本发明涉及作为醛糖还原酶抑制剂的通式(I)化合物，
含有它们的药物组合物，利用微生物发酵制备通式(I)化合物的方法
及其中使用的新的微生物，和通式(I)化合物或含有它们的药物组合
物在制备用于预防糖尿病并发症的药物中的用途。
背景技术
糖尿病是由胰岛素分泌和/或胰岛素作用的绝对或相对减弱而引
起的综合症，主要表现为高血糖。糖尿病分为胰岛素依赖型糖尿病(I
型糖尿病)和胰岛素非依赖型糖尿病(II型糖尿病)，II型糖尿病晚
期可出现并发症，其中微血管并发症包括眼病、肾病和外周和自主神
经病，大血管并发症包括动脉粥样硬化冠心病和外周动脉病。糖尿病，
特别是其并发症，给患者及其亲属带来了巨大的痛苦。
根据世界卫生组织糖尿病专家委员会2002年公布的数据，全世
界糖尿病人数已接近2亿，其中96％患者会因慢性并发症而死亡。据
报导，中国糖尿病患者已超过5000万。随着工业化进程加快，患病人
数呈不断上升趋势。
自从胰岛素用于治疗糖尿病以来，酮酸中毒、感染不再威胁糖尿
病患者的生命安全。但长期的糖尿病导致的并发症仍然是糖尿病患者
头痛的严重问题。通过对糖尿病患者多元醇代谢通路异常的研究发现，
细胞组织中山梨醇的蓄积是组织结构、功能改变的重要原因，而多元
醇代谢通路中的关键酶是醛糖还原酶(aldose reductase，AR)。醛糖还
原酶以还原型辅酶II(NADPH)为辅酶，它催化己糖的还原反应，可
以将葡萄糖和半乳糖转化为相应的还原产物山梨醇和半乳糖醇。然后，
山梨醇再在山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase)的作用下氧化成
果糖。山梨醇脱氢酶则是多元醇代谢通路中的第二个酶，它可以氧化
多种糖醇，但却不能氧化半乳糖醇。因此，在体内易导致半乳糖醇的
积聚，从而引起半乳糖血症的发生(张礼萍等人，醛糖还原酶抑制剂
研究，国外医药抗生素分册，1997，18(1)：5-10)。值得注意的是，
葡萄糖和半乳糖均不是AR的最适底物，当血糖浓度维持在正常的生
理水平时，AR并不被激活。在高血糖的生理状况(如糖尿病发生时)，
催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖的己糖激酶被饱和，此时AR则被激
活，促使体内的葡萄糖转化成山梨醇。然而，山梨醇脱氢酶的活力并
未呈比例地相应增加，山梨醇又由于自身极性因素不易通过细胞膜，
所以在胞内造成了山梨醇的聚积。大量的动物和临床试验都已证实，
醛糖还原酶抑制剂(ARI)能有效地改善糖尿病患者的聚醇代谢紊乱，
从而预防和延缓糖尿病并发症如白内障、神经病变、肾脏病变等的发
生和发展(杨哲，醛糖还原酶抑制剂和糖尿病并发症，国外医学药学
分册，1999，26(4)：217-222)。
人们对醛糖还原酶抑制剂已经进行了一些研究，Ayerst公司开发
的羧酸类醛糖还原酶抑制剂托瑞司他(Tolrestat)1989年在爱尔兰上
市。但是后来在治疗糖尿病并发症神经病变的大规模随机双盲临床试
验中因未能表现出足够的疗效而未能通过FDA批准上市。
辉瑞公司开发出第一个在体内外均具有较高活性的海因类ARI索
比尼尔(sorbinil)，其对大鼠晶状体AR和人胎盘AR有效，并已在美
国、欧洲和日本上市，但后来发现引起严重的过敏反应而被终止临床
应用(Sarges R.German Patent 2746244，1977)。
Varma等人研究了多种黄酮类化合物的醛糖还原酶抑制活性。结
果表明它们不同程度具有活性。但至今还没有一个化合物投放市场
(Var SD，etal，Flavonoids as inhibitors of lens aldose reductase，
Science NY，1975，188：1215-1216)。
Eugene de Juan等人发现，具有异黄酮结构的Genistein具有治疗
糖尿病性白内障的作用(US5919813、US5980929、US6208099和
US6399655)。
![]()
(Genestein)
但是他们并未发现作为甙元的Genestein形成的糖甙在治疗白内
障中的活性。
尽管已有预防糖尿病并发症的药物，但仍不能满足市场的需要。
市场仍需要预防或治疗糖尿病并发症的替代药物，特别是天然来源的
替代药物。
因此，本发明的一个目的是提供一种新型的治疗或预防糖尿病或
其并发症的化合物、含有它们的药物组合物及将它们用于治疗或预防
糖尿病并发症。
本发明另一目的是提供一种制备这样化合物的方法及在该方法中
使用的新的微生物。
本发明另一目的是提供一种治疗糖尿病同时预防糖尿病并发症的
药物组合物。
发明概述
本发明发明人对醛糖还原酶抑制剂进行了大量研究，结果惊人地
发现某些微生物的代谢产物具有醛糖还原酶抑制剂活性，因此完成本
发明。
一方面，本发明提供了一种下面通式(I)的化合物，及其可药用
盐、溶剂化物、立体异构体或前药：
![]()
其中，
R1为OH，或
![]()
所示的α-L-吡喃岩藻糖基或其羟基被其他糖基或者保护基取代
的基团；
R2为H或-OH
R3为-OH或羟基保护基，或是如下式所示的
![]()
α-L-鼠李糖基，或其羟基被其他糖基或者保护基取代的基团，条件是
R1和R3至少有1个是糖基或糖基衍生得到的基团。
另一方面，本发明提供了一种制备上述通式(I)化合物的方法，
该方法包括将选定的放线菌在培养基上发酵，然后对所得发酵液进行
分离和纯化。
另一方面，本发明提供了两种新的微生物，它可用于上述发酵方
法，它的保藏编号为CGMCC 0834和CGMCC 0885。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括上述式(I)化
合物或其可药用盐作为活性成分和可药用载体。另外，所述药物组合
物还可包含一种常用的治疗糖尿病的已知药物。
另一方面，本发明涉及上述式(I)化合物或组合物用于制备预防
糖尿病并发症的药物的用途，以及含有已知药物的药物组合物用于制
备治疗糖尿病和预防糖尿病并发症的药物的用途。
附图说明：
图1为菌株N99-253的光学显微照片。
图2为菌株N99-596的光学显微照片。
图3依据16S rDNA序列构建的菌株N99-596及相关菌种的系统
发育树
图4依据16S rDNA序列构建的菌株N99-253及相关菌种的系统
发育树。
图5为N99-596A、B对醛糖还原酶抑制的量效曲线。
图6为N99-253A对醛糖还原酶抑制的量效曲线。
发明的详细描述
如上所述，本发明涉及作为醛糖还原酶抑制剂的式(I)化合物，
其可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药：
![]()
其中R1为OH，或
![]()
所示的α-L-吡喃岩藻糖基或其羟基被其他糖基或者保护基取代的
基团；
R2为H，-OH
R3为-OH或羟基保护基，或是如下式所示的
![]()
α-鼠李糖基，或其羟基被其他糖基或者保护基取代的基团，条件是R1
和R3至少有1个是糖基或糖基衍生得到的基团。
按照本发明的优选方案，式(I)化合物中的R3为OH，R2为H
或-OH，R1为α-L-吡喃岩藻糖基。
上述化合物可做为醛糖还原酶抑制剂用于预防糖尿病并发症。
本发明的醛糖还原酶抑制剂可以是上述化合物本身，适当时也可
以是其药学上可接受的衍生物，例如羟基保护基或者糖基上的羟基再
被其他糖基或者保护基取代的衍生物等。
作为羟基保护基，例如保护单羟基的甲基、叔丁基、烯丙基、苄
基、三苯甲基、被甲氧基等取代的三苯甲基、三甲基甲硅烷基、叔丁
基二甲基甲硅烷基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、四氢硫代吡喃基、噻
吩基、甲醛缩醛、环己酮缩醛、甲硫基甲基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、
邻、间、对硝基苯甲酰氧基、甲酰氧基、三氟乙酰氧基、氯乙酰氧基、
甲氧基乙酰氧基、苯氧基乙酰氧基、甲氧羰基、乙氧羰基、异丁氧羰
基、苄氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、2，2，2-三溴乙氧羰基、
对硝基苯氧羰基、苯氨羰基、苄硫羰基、新戊酰氧基、3-苯甲酰乙酰
氧基、苯甲酰甲酰基、琥珀酰氧基、惕各酰氧基、邻苄氧羰基苯甲酰
基、3-苯丙酰氧基、硝基、对甲苯磺酰氧基、2，4-二硝基苯氧磺酰
氧基、烷氧基乙酰基、甲氧基甲基、1-乙氧基乙基、苯甲酰基甲基、
三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、β-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、
苯甲酰氧基羰基等，保护双羟基的甲叉缩醛、乙叉缩醛、苄叉缩醛、
取代苄叉缩醛、异丙叉缩醛、环己叉缩醛、原甲酸酯、碳酸环酯、苯
硼酸环酯等。以及其他常规羟基保护基等。
在保护基含有酸性或碱性基团的情况下，上述化合物也可以与非
毒性的碱或酸形成可药用盐的形式。酸的例子包括无机酸，诸如盐酸、
氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸；有机酸，诸如乙酸、丙酸、羟乙酸、
乳酸、丙酮酸、乙醇酸、马来酸、丙二酸、草酸、苯磺酸、甲苯磺酸、
甲磺酸、三氟乙酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、水
杨酸、对氨基水杨酸、扑酸、苯甲酸、抗坏血酸等。碱加成盐形式的
例子是钠、钾、钙盐，以及与药学可接受的胺形成的盐，所述的胺是
诸如氨、烷基胺、苯胺和氨基酸，诸如精氨酸和赖氨酸等。
上述化合物、衍生物和盐可以形成溶剂化物，例如水合物、醇合
物等。上述醛糖还原酶抑制剂还可以是前药或可在体内代谢变化后释
放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技
术人员公知技术。
下文中为简便起见，本发明限定的任何化合物、其可药用盐、其
溶剂化物及其立体异构体都简称为本发明的化合物。
本发明另一方面提供了制备上述化合物的方法，该方法包括：
将能够通过发酵产生式(I)化合物的微生物培养基中进行发酵，
并选择性地对所得培养物进行分离和纯化。
在需要获得特定取代基的特定化合物的情况下，可以根据本领域
技术人员熟悉的方法，通过在培养液中加入特定的诱导物或者诱导微
生物产生特定发酵物的方法进行。
本发明的一个具体实施方案中，包括选择性地在种子培养基上培养
微生物获得预培养物，将预培养物在发酵培养基中进行培养(发酵)，对
所得发酵液进行分离和纯化获得本发明的化合物。
得到的本发明化合物可以进一步进行衍生化获得各种衍生物。
分离包括离心发酵液，收集菌体，用溶剂提取菌体再除去溶剂，
纯化包括硅胶柱层析和选择性的HPLC单组分制备等，以上操作属于
本领域技术人员熟知的操作。
本发明方法不受上述顺序的限制，并且所述培养基成分可以在本
领域技术人员可预见的范围内采用其变体。
产生本发明式(I)化合物的微生物，例如由下述本发明人等分离
得到滇南链霉菌(Streptomyces diannanensis)CGMCC No.0834
(N99-596)或华云链霉菌(Streptomyces huayunensis)CGMCC
No.0885(N99-253)等链霉菌。但本发明并非限于这两种链霉菌，只
要其代谢产物中可以获得本发明通式(I)化合物，均可以用于发酵生
产。
菌株N99-596是从中国云南省的土壤样品中分离得到的(图1)。
*特征描述：该菌株在酵母膏-麦芽膏培养基上菌落灰色，表面平
坦、绒毛状。显微镜下观察其菌丝发达，多分枝，无隔；孢子链或波
曲形或不规则螺旋及钩状。能在所有供试培养基上生长良好，气丝和
基丝均以灰棕色或棕灰色为主，培养特征参见表1和2。
表1菌株N99-596的培养特征
培养基
气生菌丝
基内菌丝
可溶性色素
察氏琼脂
浅棕灰色
浅灰棕色
无
甘油-天门冬酰胺琼脂(ISP5)
浅灰棕色
灰色
无
无机盐淀粉琼脂(ISP4)
浅棕灰色
浅灰棕色
无
燕麦片琼脂(ISP3)
浅灰黄棕色
浅棕灰色
无
酵母膏-麦芽膏琼脂(ISP2)
灰黄棕色
深黄棕色
无
马铃薯浸汁琼脂
浅棕灰色
灰棕色
无
表2菌株N99-596的生理生化特征和碳源利用状况
生理生化
N99-596
碳源利用
N99-596
明胶液化
+
葡萄糖
+
牛奶凝固
+
阿拉伯糖
+
牛奶胨化
-
甜醇
+
淀粉水解
-
蔗糖
+
硝酸盐还原
+
甘油
+
硫化氢产生
-
果糖
+
黑色素生成
-
半乳糖
+
纤维素生长
-
麦芽糖
+
脲的利用
+
甘露糖
+
棉子糖
+
抗菌谱
木糖
+
E.coli
-
山梨醇
+
B.subtilis
-
草酸钠
+
Candida albicans
-
醋酸钠
+
Aspergillus niger
-
密二糖
+
*16S rDNA序列及系统进化分析：
*菌株N99-596的16S rDNA部分序列如序列1所示。将N99-596
的16S rDNA与已知的若干菌株的16S rDNA进行比对，所得的依据16S
rDNA序列构建的菌株N99-596及相关菌种的系统发育树参见图3。
进行比对的菌株如下：
表3
学名
株
编号
Streptomyces sp
N99-596
Streptomyces argenteolus
JCM 4623
AB045872
Streptomyces ornatus
DSM 40307
X79326
Streptomyces caviscabies
ATCC 51928
AF112160
Streptomyces setonii
ATCC 25497
D63872
Streptomyces avermitilis
NCIBM 12804T
AF145223
Streptomyces virginiae
IFO 3729
D85119
Streptomyces lavendulae
IFO 12341
D85110
Streptomyces cyaneus
NRRL B-2296
AF346475
Streptomyces indigocolor
NRRL B-12336
AF346474
Streptomyces mirabilis
ATCC 27447
AF112180
Streptosporangium roseum
DSM 43021
X89947
综上，N99-596号菌株使明胶液化，牛奶凝固，硝酸盐还原，均
呈阳性，纤维素上不生长，硫化氢及黑色素不产生，不产生脲酶，能
利用几乎所有的受试碳源。细胞壁含有L-DAP，胞壁I型。根据其形
态学特征及基于16S rDNA序列的系统进化分析，将菌株N99-596定
为链霉菌的一个新种，命名为滇南链霉菌(Streptomyces
diannanensis)。N99-596已于2002年11月15日保藏在中国微生物菌
种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC
N0.0834。
菌株N99-253是从中国云南省的土壤样品中分离得到的(图2)。
*特征描述：该菌株在酵母膏-麦芽膏培养基上菌落灰色，周围有小
水解圈。显微镜下观察其菌丝发达，多分枝，无隔；孢子链或波曲形或
不规则螺旋。能在所有供试培养基上生长良好，气丝和基丝均以灰棕色
或棕灰色为主，培养特征参见表4。
表4菌株N99-253的培养特征
培养基
气生菌丝
基内菌丝
可溶性色素
察氏琼脂
浅棕灰色
浅灰棕色
无
甘油-天门冬酰胺琼脂(ISP5)
浅灰棕色
灰色
无
无机盐淀粉琼脂(ISP4)
浅棕灰色
浅灰棕色
无
燕麦片琼脂(ISP3)
棕灰色
浅棕灰色
无
酵母膏-麦芽膏琼脂(ISP2)
棕灰色
深黄棕色
无
马铃薯浸汁琼脂
浅棕灰色
灰棕色
无
*16S rDNA序列及系统进化分析：
*菌株N99-253的16S rDNA部分序列如序列2所示。将N99-253
的16S rDNA与已知的若干菌株的16S rDNA进行比对，所得的依据16S
rDNA序列构建的菌株N99-253及相关菌种的系统发育树参见图4。
进行比对的菌株如下：
表5
学名
株
编号
Streptomyces sp.
N99-253
Streptomyces argenteolus
JCM 4623T
AB045872
Streptomyces flavogriseus
CBS 101.34＝DSM 40323T
AJ494864
Streptomyces caviscabies
ATCC 51928T
AF112160
Streptomyces setonii
ATCC 25497T
D63872
Streptomyces ornatus
DSM 40307T
X79326
Streptomyces cyaneus
ISP 5108T
A0899460
Streptomyces venezuelae
JCM 4526T
AB045890
Streptomyces galilaeus
JCM 4757T
AB045878
Streptomyces bobili
JCM 4624T
AB045846
依据16S rDNA序列构建的菌株N99-253及相关菌种的系统发育
树参见图4。
N99-253能利用几乎所有的受试碳源。细胞壁含有L-DAP，胞壁
I型。根据其形态学特征及基于16S rDNA序列的系统进化分析，菌株
N99-253定为链霉菌属的一个新种，命名为华云链霉菌(Streptomyces
huayunensis)。N99-253于2003年1月21保藏在中国微生物菌种保藏
管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.0885。
本发明另一方面提供了一种药物组合物，其含有作为活性成分的
上述式(I)化合物和可药用载体。药物组合物的制备方法为本领域常
用方法。
本文所述的化合物或其药学上可接受的加成盐或水合物可以利用
各种给药途径或方式释放至患者。适合的给药途径包括但不限于吸入、
透皮、口服、直肠、经粘膜、肠内和肠胃外给药，肠胃外给药包括肌
内、皮下和静脉内注射。
本文所用的术语“给药”包括所有直接与间接释放化合物到其预期
作用部位的手段。
本文所述的化合物或其药学上可接受的衍生物可以单独给药或与
其他本发明化合物联合给药，和/或以与其它已知糖尿病或者糖尿病并
发症治疗剂联合的形式给药。
本发明的活性化合物可以本身形式给药的，或者以药物组合物形
式给药，其中活性化合物是与一种或多种药学上可接受的载体、赋形
剂或稀释剂混合的。按照本发明使用的药物组合物通常是按常规方式
配制的，使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，
它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制
剂取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。
例如，对于治疗糖尿病来说，通常采用口服制剂是有利的。可以
口服的药物制剂包括胶囊剂和片剂等。病人吞咽有困难时，也可以采
用舌下片或者其他非吞咽的方式给药。
本发明化合物也可以配制用于肠胃外给药或者透皮给药或者经粘
膜给药。或者采用栓剂或者埋植剂的方式给药。
本领域技术人员可以理解，在本发明化合物的基础上，可以采用
合适的药物释放系统(DDS)，以得到更有利的效果。
由于糖尿病属于慢性病，因此，可以长期服用的口服剂型从经济
上讲对患者是有利的。
优选地，组合物是单位剂型，例如片剂或胶囊剂。
给药方式以及有效剂量的选择将尤其根据所治疗的疾病而异。给
药方式和剂量的选择在本领域技术人员的能力范围内。
本发明化合物的单位剂型通常将含有0.1至99重量％活性物质，
更通常为5至75重量％活性物质。举例来说，单位剂型可以含有1mg
至1g化合物，更通常为10mg至500mg，例如在50mg与400mg之间，
剂量通常为100mg至200mg。
每个剂量单位或每次口服给药优选地含有1至250mg(关于肠胃
外给药，优选地含有0.1至25mg)结构式(I)化合物或其药学上可
接受的衍生物，每日给药3次或根据进餐次数决定。
本发明的化合物将按照有效提供所需治疗效果的量给药。提供所
需治疗效果所必要的浓度将尤其根据疾病的明确性质、患者的年龄、
体重和疾病的严重性而异。
通常，本发明化合物的给药量将在0.01mg/kg至100mg/kg体重的
范围内，更优选为0.1mg/kg至10mg/kg体重，特别是1mg/kg至5mg/kg
体重。
药学上可接受的本发明化合物正常地将按照每日剂量方案对受治
疗者给药。关于成年患者，这例如可以是通式(I)化合物或其药学上
可接受的盐的口服剂量在1mg与500mg之间，优选在1mg与250mg
之间，或者静脉内、皮下或肌内剂量在0.1mg与100mg之间，优选在
0.1mg与25mg之间，按照游离化合物计算，化合物每天分1至4次给
药。因而，关于体重70kg的普通人，本发明化合物的典型每日剂量将
在70mg至700mg的范围内。这样一种剂量例如可以每日分3次或者
2至4次给药，因进餐次数而定。
不过，给药剂量的大小和给药的频率最终将由治疗该患者的医师
来决定和判断。
本发明的化合物还可以选择性地与已知的治疗糖尿病的药物联合
给药。在上述组合物中可以加入有效量的治疗糖尿病的药物。治疗糖
尿病的药物是本领域技术人员已知的，例如：甲苯磺丁脲、醋磺己脲、
格列苯脲、格列吡嗪、格列齐特、格列喹酮、格列美脲、苯乙双胍、
二甲双胍、瑞格列奈、那格列奈、罗格列酮、吡格列酮、阿卡波糖、
伏格列波糖、依帕司它、氯磺丙脲、格列波脲、格列喹酮、格列嘧啶、
木糖醇或壳聚糖等。
当本发明化合物与已知治疗糖尿病的药物联合给药时，它们可以
同时、分别或顺序给药。或者将其制成复方制剂。
本发明的化合物可用于预防或治疗糖尿病并发症，其中糖尿病并
发症选自下面并发症所组成的组：糖尿病肾病，糖尿病眼病、糖尿病
神经系统疾病、糖尿病心脏病、糖尿病动脉硬化和糖尿病微血管病，
优选糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病神经系统疾病或糖尿病微血管
病。
本发明化合物预防糖尿病并发症的原理如背景部分所述，关于多
元醇通路与糖尿病并发症的关系，有肌醇丧失假说。该假说从原理上
对本发明进行解释，但是无论如何，本发明不受这种理论所限制，因
为本发明化合物事实上已经起到预防糖尿病并发症的作用。
肌醇丧失假说
Greene D研究发现，神经细胞中山梨醇的蓄积导致肌醇丧失，使
用ARI可以有效地阻止肌醇的丧失，于是提出了肌醇丧失假说，肌醇
是合成一种叫聚磷酸肌醇磷脂的细胞膜脂质的主要成分，这种脂质与
细胞膜的结构和功能密切相关。葡萄糖具有与肌醇相似的空间三维结
构，所以组织中葡萄糖浓度的增加可以竞争性地抑制肌醇运转系统。
肌醇的磷酸化衍生物磷酸酰肌醇二磷酸(PIP2)水解后，可以产生两
种具特殊性质的化合物-甘油二酯和1，4，5-三磷酸肌醇。其中，甘
油二酯可以激活细胞膜脂质双分子层中的蛋白激酶C。蛋白激酶C可
以激活Na+/K+-ATP酶，而肌醇进入胞内又要依赖Na+/K+-ATP酶。
所以糖尿病导致的高血糖依次使肌醇进入胞内减少，AR活力增强，
山梨醇蓄积，从而形成了一个循环，最终导致肌醇丧失。周围神经的
肌醇丧失使神经索突间质中的Na+蓄积，从而引起神经电冲动传导阻
滞。Raskin对患糖尿病的小鼠和半乳糖喂养的大鼠模型的研究也证明
肾小球和视网膜中肌醇丧失与Na+/K+-ATP酶活力下降和山梨醇蓄
积有关。
上述假说仅用于理解本发明。
本发明的另一方面，本发明提供了本发明化合物及含本发明化合
物的组合物用于制备预防或治疗糖尿病并发症的药物中的用途，其中
所述并发症如上所述。
本发明另一方面，本发明提供了含有治疗糖尿病药物的本发明组
合物用于制备治疗糖尿病和预防糖尿病并发症的药物中的用途，其中
所述的糖尿病并发症如上所述。
本发明，还提供了一种醛糖还原酶抑制剂的筛选方法。
以往醛糖还原酶抑制剂活性的一般测定方法为在辅酶NADPH的存
在下，醛糖还原酶催化含醛基的糖类，同时NADPH转化为NADP+(烟酰
胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，而NADP+所含吡啶环的还原态NADPH在
340nm处有特征吸收，可以通过测定340nm处光密度的下降速率，间接测
定醛糖还原酶的活性。醛糖还原酶的来源可以为牛、猪、猴、鼠、或人
等，也可以是来自不同的脏器如精囊、脑、胎盘等。但按文献报道操作，
该筛选模型存在以下难点：
(1)醛糖还原酶需自己从屠宰场挖猪眼进行提取，每次活性不同。
(2)辅酶NADPH极不稳定。
(3)测定指标为每分钟OD值的变化，要求精确到0.001，一般的分光光
度计精密度不够。
(4)有些样品加到测活体系发生浑浊，带来干扰。
选用自动化程度较高的生化分析仪，针对以上存在的困难，对筛选
和测活方法进行了改进。把测活体系的总体积减少到200微升，这就减
少了酶和试剂的用量。自动化的程序设置减少了人工操作的偶然误差并
提高了测量的精密度。由于对大量样品同时测定，这样对每次测定时系
统的稳定性要求较高，所以在每次测活之前先测定酶的活性，作为对照，
确认OD值变化在一个合适的范围中后再将该酶用于筛选。每次新配
NADPH，并同时测定空白。选择对样品溶解性好而对酶活性影响小的溶
剂，减少发生浑浊。对初筛呈阳性的样品，为鉴别该样品是否与NADPH
作用，引起OD值上升，则在不加醛糖还原酶的条件下，记录OD值的
变化情况，若OD值上升，则此为假阳性，予以剔除。将此醛糖还原酶
抑制剂高效筛选方法用于微生物代谢产物的筛选，提高了筛选的准确性、
稳定性。
具体来说，本发明测活方法是以DL-甘油醛为底物，以NADPH为
辅酶测定酶活性的：
在NADPH的存在下，醛糖还原酶催化DL-甘油醛还原为甘油，同
时NADPH转化为NADP+，而还原态NADPH在340nm处有特征吸收，
可以测定340nm处光密度的下降速率，间接测定醛糖还原酶的活性。
具体操作是在96孔板中，每个样品孔加入缓冲液、酶液和样品；对
照孔以溶剂代替样品，其余相同；空白孔以溶剂代替样品并以缓冲液代
替酶液，其余相同。混合保温15分钟，再加入Li2SO4、DL-甘油醛和
NADPH开始反应，在与保温相同温度下测定在340nm波长处每分钟的
光密度减少值(ΔOD/min)。
![]()
下面结合实施例进一步详细说明本发明，但它们并非理解成对本
发明范围的任何限制。
仪器与试剂为本领域技术人员常用的。
材料：
NADPH(北京欣经科生物技术公司)
新鲜猪眼球(石家庄肉联厂)。
巯基乙醇，PMSF(苯基甲基磺酰基氟化物，Sigma公司)
1.斜面培养基：葡萄糖4％，酵母粉4％，麦芽膏5％，琼脂粉
2.0％，复合VB 0.035％，微量盐0.001％，pH7.2；
2.种子培养基：含淀粉2.4％，葡萄糖0.1％，蛋白胨0.3％，牛肉
膏0.3％，酵母膏0.5％，CaCO30.4％，pH7.0；
3.发酵培养基：
46号培养基：可溶性淀粉4.0％，脱脂大豆粉2.0％，0.1mol/L
NaS2O4 3.2微升，FeSO4·7H2O 0.05％，K2HPO4 0.05％，KCl 0.03％，
pH6.5；
48号培养基：，含葡萄糖4.7％，蛋白胨0.4％，酵母粉0.1％，牛肉
膏0.4％，NaCl 0.2％，CaCO3 0.5％，pH7.0
实施例1
培养方法
由放线菌N99-596斜面，接种于种子培养基，27℃，72hr培养后，
接入内含量为140ml培养基的750ml三角瓶中，于发酵培养基中27℃振
摇培养6天。
分离方法
N99-596发酵液5000ml于3000rpm离心15分钟，分别收集菌体与
上清，菌体用2000ml丙酮提取后，蒸去丙酮，用2500mL乙酸乙酯抽
提二次，乙酸乙酯层经无水Na2SO4脱水后，浓缩抽干后，得到褐色物质
2.2g。
取2.2g样品，用少量甲醇溶解后，使用硅胶柱(φ2.5×25cm)色谱
进行进一步的分离纯化，层析柱的洗脱条件为100％的CHCl3至100％
MeOH的阶段洗脱，收集合并活性组分，浓缩抽干后得褐色固体85.2mg。
取上述活性物质，使用ODS反相柱(PHENOMENEX
ODSφ20×250mm)在制备型HPLC上进行单组分的制备(流动相为
30％CH3CN，流速为6ml/min，检测波长为254nm)，得到黄色物质
N99-596 A(12.1mg)、B(9.6 mg)。
分析方法：
取N99-596A、B各1mg，加入甲醇1ml定容于1mg/ml，HPLC分
析条件如下：
样品：N99-596A、B(1mg/ml)
HPLC：高压液相泵：Waters 515(双泵)
检测器：2487紫外检测器
色谱柱：Kromasil 100_ C18 4.6mm×250mm
流动相：25％乙腈-水
流速：1ml/min
检测波长：254nm
柱温为室温(22-25℃)
进样量：10μl
保留时间：A：9～10min，B：19～20min
N99-596A、B的纯度均大于98％
N99-596A、B的理化性质：
分子量：A为：416，B为：432
分子式：A为C21H20O9，B为C21H20O10
紫外吸收：A的λmax 249nm，B的λmax 260nm
N99-596 A、B的结构
根据理化性质与核磁共振图谱，确定了A组份和B组份的化学结构
如下：
![]()
N99-596A N99-596B
N99-596 A、B组份的13C-NMR、1H-NMR如下：
N99-596 A：
1H-NMR(δ，ppm)8.29(1H，s，2-CH)7.95(1H，d，J＝9Hz，5-CH)7.28
(1H，d，J＝2Hz，2’-CH)7.05(1H，dd，J＝8.5，2Hz，5’-CH)6.93(1H，dd，J＝9，
2.5Hz，6-CH)6.87(1H，d，J＝8.5Hz，6’-CH)6.86(1H，d，J＝2.5Hz，8-CH)
5.27(1H，s，1”-CH)3.90(1H，m，3”-CH)3.65-3.79(2H，m，2”，5”-CH)3.16
(1H，m，4”-CH)1.13(3H，d，J＝6.5Hz，6”-CH3)
13C-NMR(δ，ppm)174.59(4-C)162.51(7-C)157.39(9-C)154.584
(2-C)147.85(4’-C)143.69(3’-C)127.31(5-C)123.45(6’-C)123.20(1’-C)
122.97(3-C)119.45(2’-C)116.63(5’-C)116.31(10-C)115.15(6-C)102.09
(8-C)99.94(1”-C)71.94(4”-C)70.33(3”-C)70.17(2”-C)69.48(5”-C)
17.85(6”-C)
N99-596 B
1H-NMR(δ，ppm)8.34(1H，s，2-CH)7.28(1H，d，J＝2Hz，2’-CH)7.07
(1H，dd，J＝8.5，2Hz，5’-CH)6.88(1H，d，J＝8.5Hz，6’-CH)6.38(1H，d，
J＝2.5Hz，8-CH)6.22(1H，d，J＝2.5Hz，6-CH)5.27(1H，s，1”-CH)3.90(1H，
m，3”-CH)3.65-3.79(2H，m，2”，5”-CH)3.16(1H，m，4”-CH)1.05(3H，d，
J＝6.5Hz，6”-CH3)
13C-NMR(δ，ppm)179.90(4-C)164.09(5-C)161.82(7-C)157.36(9-C)
153.76(2-C)147.90(4’-C)143.69(3’-C)123.29(2’-C)121.91(3-C)121.51
(1’-C)120.99(6’-C)115.96(5’-C)106.73(10-C)99.92(6-C)98.83(1”-C)
93.48(8-C)71.86(4”-C)70.28(3”-C)69.96(2”-C)69.25(5”-C)17.49
(6”-C)
实施例2
醛糖还原酶的制备
下面的操作均在0～4℃进行。每批取猪的晶状体约90g，于三倍
体积的冷的NaPi缓冲液中匀浆，10000×g离心50分钟除去不溶物。
上清中加入(NH4)2SO4至40％的饱和度，轻度搅拌15分钟，离心除去
沉淀，再加入(NH4)2SO4至50％的饱和度，轻度搅拌15分钟，离心除
去沉淀，加入(NH4)2SO4至75％的饱和度，轻度搅拌15分钟离心收集
沉淀，用冷的0.05mol/L的NaPi(含0.5mmol/lPMSF和0.5mmol/l
EtSH)溶解，于0.05mol/L的NaPi溶液(含0.5mmol/lPMSF和
0.5mmol/lEtSH)中透析过夜。透析后，将上述酶液加入甘油至40％
的浓度，于-20℃保存备用。
化合物活性测定方法：
取N99-596A、B各适量，用甲醇配制成6mg/ml溶液，并逐级稀释
至3mg/ml、1.5ml/ml、0.75mg/ml、0.375mg/ml。分别取出50微升加入
共1000微升的测活体系中，其终浓度分别为0.3mg/ml，0.15mg/ml，
0.075mg/ml，0.0375mg/ml，0.01875mg/ml，测定其对醛糖原原酶的抑制
活性。
测活反应的样品管加入：60mmol/L NaPi缓冲液(pH6.2)和适量的
酶液，50μl样品的甲醇溶液；对照孔加入：60mmol/L NaPi缓冲液(pH6.2)
和适量的酶液，50μl甲醇；空白孔加入：60mmol/L NaPi缓冲液(pH6.2)，
50μl甲醇。样品孔、对照孔和空白孔均在37℃保湿15分钟，各管加入
334μl 1.2mol/L Li2SO4、83μl 36mmol/L DL-甘油醛和83μl 1.5mmol/L
NADPH开始反应，用生化分析仪于340nm波长处测定37℃每分钟的光
密度减少值(ΔOD/min)。
结果：
对醛糖还原酶活性的抑制率(％)
药物浓度(mol/L)
N99-596A
药物浓度(mol/L)
N99-596B
720
89.1
696
90.3
360
82.3
348
81.6
180
56.8
174
51.5
90
37.5
87
21.2
45
22.5
43.5
18.5
22.5
15.8
21.75
11.8
如图5所示N99-596 A、B对醛糖还原酶的IC50分别为170μmol/L
和165μmol/L。
N99-596 A、B组份的衍生物具有相似的活性。
实施例3
N99-253的培养方法与实施例1中N99-596的培养方法相同。
分离方法：
N99-253(46)发酵液5000ml于3000rpm离心15分钟，分别收集
菌体与上清，菌体用2000ml丙酮提取后，蒸去丙酮，用2500mL乙酸
乙酯抽提二次，乙酸乙酯层经无水Na2SO4脱水后，浓缩抽干后，得到褐
色物质1.2g。
取1.0g样品，用少量甲醇溶解后，使用硅胶柱(φ2.5×25cm)层析，
进行进一步的分离纯化，层析柱的洗脱条件为CHCl3∶MeOH 100∶0～0～
100梯度洗脱，收集合并活性组分，浓缩抽干后得褐色固体118mg。
取上述活性物质，使用ODS反相柱(PHENOMENEX ODS
φ20×250mm)在制备型HPLC上进行单组分的制备(流动相为30％
CH3CN，流速为6ml/min，检测波长为210nm)，得到黄色物质N99-253
A(11.1mg)和N99-253B(9.6mg)。
2.2.3分析方法：
取N99-253A、B各1mg，加入甲醇1ml定容于1mg/ml，HPLC分
析条件如下：
样品：N99-253A、B(各1mg/ml)
HPLC：高压液相泵：Waters 515(双泵)
检测器：2487紫外检测器
色谱柱：Kromasil 100_ C18 4.6mm×250mm
流动相：25％乙腈-水
流速：1ml/min
检测波长：254nm
柱温为室温(22-25℃)
进样量：10μl
保留时间：A：10-12min，B：13-15min
N99-253A、B的纯度均大于98％。
2.2.4 N99-253A、B的理化性质：
分子量：A、B均为：416
分子式：A、B均为C21H20O9
紫外吸收：A的λmax 261nm，B的λmax 261nm
2.2.5 N99-253的结构
根据理化性质与核磁共振图谱，确定了A、B组份的化学结构如下：
253A
![]()
253B
![]()
N99-253A、B的1H-NMR和13C-NMR如下：
N99-253 A
1H-NMR(δ，ppm)8.42(1H，s，2-CH)7.40(2H，d，J＝8.5Hz，2’，6’-CH)
6.84(1H，d，J＝2Hz，8-CH)6.67(2H，d，J＝8.5Hz，3’，5’-CH)6.43(1H，d，
J＝2Hz，6-CH)5.26(1H，d，J＝8.0Hz，1”-CH)4.16(1H，m，3”-CH)3.84(1H，
m，5”-CH)3.71(1H，m，2”-CH)3.37(1H，m，4”-CH)1.12(3H，d，J＝6.5Hz，
6”-CH3)
13C-NMR(δ，ppm)180.49(4-C)163.22(7-C)161.66(5-C)157.51
(9-C)157.25(4’-C)154.56(2-C)130.18(2’，6’-C)122.55(3-C)121.00(1’
-C)115.09(3’，5’-C)105.98(10-C)99.37(6-C)98.36(1”-C)94.28(8-C)
71.88(4”-C)71.47(2”-C)69.92(3”-C)66.93(5”-C)16.08(6”-C)
N99-253B
1H-NMR(δ，ppm)8.42(1H，s，2-CH)7.39(2H，d，J＝8.5Hz，2’，6’-CH)
6.86(1H，d，J＝2Hz，8-CH)6.83(2H，d，J＝8.5Hz，3’，5’-CH)6.48(1H，d，
J＝2Hz，6-CH)5.57(1H，s，1”-CH)3.85(1H，m，3”-CH)3.65-3.79(1H，m，
5”-CH)3.29-3.654(1H，m，2”-CH)3.17(1H，m，4”-CH)1.12(3H，d，
J＝6.5Hz，6”-CH3)
13C-NMR(δ，ppm)180.52(4-C)161.75(7-C)161.68(5-C)157.51
(9-C)157.21(4’-C)154.58(2-C)130.18(2’，6’-C)122.58(3-C)121.02(1’-C)
115.10(3’，5’-C)106.09(10-C)99.65(6-C)98.38(1”-C)94.59(8-C)71.57
(4”-C)70.24(3”-C)70.07(2”-C)69.83(5”-C)17.85(6”-C)
2.2.7 N99-253A的生物学活性
按照实施例2方法测定其活性。
测定结果表明N99-253 A对AR的抑制活性IC50为200μmol/L。
N99-253 A组份的衍生物具有相似的活性。
序列表
<110>华北制药集团有限责任公司
<120>醛糖还原酶抑制剂、其制备方法和用途
<130>IDC020023
<140>CN
<141>2003-07-09
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1487
<212>DNA
<213>滇南链霉菌Streptomyces diannanensis
<220>
<221>misc_feature
<222>(783)..(834)
<223>n＝a或g或c或t
<400>1
gctaccttgt tacgacttcg tcccaatcgc cagtcccacc ttcgacagct ccctcccaca 60
aggggttggg ccaccggctt cgggtgttac cgactttcgt gacgtgacgg gcggtgtgta 120
caaggcccgg gaacgtattc accgcagcaa tgctgatctg cgattactag caactccgac 180
ttcatggggt cgagttgcag accccaatcc gaactgagac cggctttttg agattcgctc 240
cgcctcgcgg catcgcagct cattgtaccg gccattgtag cacgtgtgca gcccaagaca 300
taaggggcat gatgacttga cgtcgtcccc accttcctcc gagttgaccc cggcagtctc 360
ctgtgagtcc ccatcacccc gaagggcatg ctggcaacac agaacaaggg ttgcgctcgt 420
tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca ccacctgtac 480
accgaccaca aggggggcac catctctgat gctttccggt gtatgtcaag ccttggtaag 540
gttcttcgcg ttgcgtcgaa ttaagccaca tgctccgctg cttgtgcggg cccccgtcaa 600
ttcctttgag ttttagcctt gcggccgtac tccccaggcg gggaacttaa tgcgttagct 660
gcggcaccga cgacgtggaa tgtcgccaac acctagttcc caacgtttac ggcgtggact 720
accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc agtaatggcc 780
canagatccg ccttcgccac cggtgttcct cctgatatct gcgcatttca ccgntacacc 840
aggaattccg atctccccta ccacactcta gcctgcccgt atcgactgca gacccggggt 900
taagccccgg gctttcacaa ccgacgcaac aagccgccta cgagctcttt acgcccaata 960
attccggaca acgcttgcgc cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggc 1020
gcttcttctg caggtaccgt cactctcgct tcttccctgc tgaaagaggt ttacaacccg 1080
aaggccgtca tccctcacgc ggcgtcgctg catcaggctt tcgcccattg tgcaatattc 1140
cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccggtcgcc 1200
ctctcaggcc ggctacccgt cgtcgccttg gtaggccatc accccaccaa caagctgata 1260
ggccgcgggc tcatccttca ccgccggagc tttcaacccc gtcccatgcg ggacagagtg 1320
ttatccggta ttagaccccg tttccagggc ttgtcccaga gtgaagggca gattgcccac 1380
gtgttactca cccgttcgcc actaatccac cccgaagggc ttcatcgttc gacttgcatg 1440
tgttaagcac gccgccagcg ttcgtcctga gccaggatca aactcta 1487
<210>2
<211>1476
<212>DNA
<213>华云链霉菌Streptomyces huayunensis
<400>2
tagacgaacg ctggcggcgt gcttaacaca tgcaagtcga acgatgaagc ccttcggggt 60
ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg cccttcactc tgggacaagc 120
cctggaaacg gggtctaata ccggataaca ctctgtcccg catgggacgg ggttgaaagc 180
tccggcggtg aaggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt ggtggggtga tggcctacca 240
aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca 360
gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag 420
cgaaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcttgt 540
tgcgtcggtt gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg cagtcgatac gggcaggcta 600
gagtgtggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag 660
gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccattactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgttggg aactaggtgt 780
tggcgacatt ccacgtcgtc ggtgccgcag ctaacgcatt aagttccccg cctggggagt 840
acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagca gcggagcatg 900
tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct tgacatacac cggaaagcat 960
cagagatggt gccccccttg tggtcggtgt acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttctgt gttgccagca 1080
tgcccttcgg ggtgatgggg actcacagga gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg 1140
ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg cacacgtgct acaatggccg 1200
gtacaatgag ctgcgatgcc gcgaggcgga gcgaatctca aaaagccggt ctcagttcgg 1260
attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagttgct agtaatcgca gatcagcatt 1320
gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt 1380
aacacccgaa gccggtggcc caaccccttg tgggagggag ctgtcgaagg tgggactggc 1440
gattgggacg aagtcgtaac aaggtagccg tacgga 1476