植物顶端发育相关的cDNA以及减弱植物顶端优势增加分枝数目的新方法 【技术领域】
本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及一种来自于谷子未成熟种子的cDNA文库的与植物顶端发育相关的cDNA(pf40)。本发明还涉及利用所述基因减弱植物顶端优势增加分枝数目的新方法。
背景技术
植物主茎顶端生长抑制侧芽的现象称之为顶端优势。但植物之间顶端优势存在着明显的差异，很早以来人们根据需要对植物顶端优势进行干扰控制，如棉花整枝、果树修剪等措施来减弱顶端优势，以有利于农业生产，研究表明顶端优势与植物体内激素的调节有关。植物体内存在自上而下的生长素浓度梯度和自下而上的细胞分裂素浓度梯度，两者协调作用，维持着植物的正常生长和分枝。
为了研究植物顶端优势形成的机理，人们利用了突变体和转基因技术。Klee等人将农杆菌中生长素合成基因导入植物，结果引起转基因植物内源生长素含量明显提高，顶端优势增强(Klee et al.，1987；Romano et al.，1993，1995)。Medford等将农杆菌中细胞分裂素合成基因ipt导入烟草，引起转基因烟草中细胞分裂素含量增加，顶端优势减弱，侧芽增多(Medford et al 1989)，Chaughurg等获得拟南芥突变体amp1，其细胞分裂素水平比野生型高6倍，其侧枝显著增多(Chaughurg et al 1991)。Romano等人将来自真菌的编码催化生长素生成赖氨酸酶的基因iaaL转化烟草，结果游离的IAA水平降低，顶端优势减弱(Romanoet al 1991)。这些研究都说明IAA和细胞分裂素的含量与植物顶端优势的形成有密切关系。
1995年Abel等对具有叶片发生改变，侧芽显著增加，生长素不敏感的拟南芥突变体AXR1的分析研究结果表明，突变体中地被IAA迅速诱导的基因对生长素的敏感性下降，说明AXR1蛋白是生长素信号传递所必须的(Abel etal，1995；Timpte et al.，199)。Stirnberg等人通过比较野生型和IAA不敏感突变体axr1-12腋芽的发育以及侧生花序对生长素的敏感性，发现axr1-12突变体不影响早期腋芽的发育，却促进后期腋芽的生长，同时也使侧生花序能够抵抗生长素的抑制作用。说明生长素对侧芽发育的影响是在腋生分生组织形成后以及一些腋生叶片原基形成后(Stirnberg et al，1999)。
【发明内容】
本发明目的之一是提供一种与植物顶端发育相关的新的cDNA，称之为pf40基因，它来自于谷子未成熟种子的cDNA文库。该cDNA与植物生长素调节有关。
本发明的另一目的是提供一种利用所述基因减弱植物顶端优势增加分枝的新方法。
发明详述
本发明从谷子花序cDNA文库中筛选得到一个cDNA克隆，称之为pf40基因。该cDNA的序列长度为1274bp，为双链核酸类型，线性，其序列示于附图1。通过三大数据库的检索，发现是一个未见报道的新基因。Southern印迹研究表明该基因在谷子基因组中以单拷贝存在，而烟草中不存在该基因。Northern印迹和RT-PCR分析pf40基因的表达模式，表明其在谷子根中不表达，在叶片、花，茎等其他组织中均可检测到其转录产物的存在。
本发明构建了含有pf40 cDNA的烟草表达载体。在一个优选的实施方式中，其表达盒是由花椰菜花叶病毒35S启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域构成，选择标记基因为新霉素磷酸转移酶II(NPTII)。所述的表达载体优选的是重组质粒pBI40S，其中pf40 cDNA正向插入并且在35S启动子驱动下。
本发明还构建了含有pf40 cDNA的谷子表达载体。在一个优选的实施方式中，其表达盒是由玉米花粉特异启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域构成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因，编码氨基核糖苷4-磷酸转移酶APH(4)--1。所述的表达载体优选的是pROK219HPF40。
本发明将上述含有所述pf40 cDNA的重组表达载体转化植物，如烟草和谷子，获得了顶端优势减弱，分枝增加的转基因植物。
在一个优选的实施方式中，将含有所述cDNA的表达载体转化烟草，获得的植株顶端优势减弱，侧枝丛生，叶片衰老延迟，植株矮化。
在另一个优选的实施方式中，将含有所述cDNA的表达载体转化谷子，获得的植物比对照分枝数目显著增加。
有益效果
本发明找到了与植物顶端发育相关的cDNA(称为pf40基因)，将所述的基因转化到植物中可使植物本身减弱顶端优势，增加分枝数目。本发明提供了一种利用所述基因减弱植物顶端优势增加分枝的新方法。有利于农业生产。
附图简述
图1表示来自谷子的pf40 cDNA序列，以及推导的氨基酸序列。
图2表示含有pf40 cDNA的烟草表达载体构建过程。
图3R0代转基因烟草的Southern杂交，部分转pBI40S烟草植株的Southern杂交检测结果，其中2.阳性对照；3.未转化的烟草对照；4-16.转化的烟草。
图4R0代转基因烟草的RT-PCR分析。RT-PCR分析PF40基因在转pBI40S烟草中的转录情况，其中1.λ/H标记物；2.未转化的烟草；3.阳性质粒；4-9.转化的烟草。
图5转基因烟草的表型分析，其中A：对照株；B：转pBI40S植株，箭头所指是主茎。
图6转基因烟草的表型。
图7表示含有pf40 cDNA的谷子表达载体构建过程。
图8转基因谷子的表型分析。左：非转基因植株；右上右下：转pF40正义载体植株。
下面是实现本发明的具体实施方式。
实施例1
植物顶端优势相关基因pf40的克隆
选取谷子授粉后5、7及12天的未成熟种子，材料混合后，提取总RNA，磁珠法富集mRNA(Promega)，采用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA，双链cDNA补平后，连接EcoRI adapter，将其构建至λZAPII(Stratagene公司)载体上，使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold CloningKit(Stratagene公司)进行体外包装。包装完毕后，加入SM溶液和氯仿，离心后，上清即为构建好的文库。取1μl文库上清液进行滴度测定，结果表明构建的文库容量为2×107pfu/ml。原始文库构建完成后，扩增一次备用。
以来源于马铃薯的花粉发育相关基因SB401cDNA(Liu JQ等，Plant MolBiol 1997，33：291～300)在大肠杆菌中表达的蛋白免疫兔子，获得抗血清进行抗原-抗体反应筛选cDNA表达文库，杂交技术为公知技术，经过两轮筛选后，得到阳性克隆。将所得阳性克隆利用辅助噬菌体从λDNA上环化得到重组质粒，利用通用引物T7对重组质粒上的插入片段进行序列分析，该序列示于图1中，称之为pf40。
实施例2
用于烟草中表达pf40的表达载体的构建和转化农杆菌
表达盒是由花椰菜花叶病毒35S启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域(Depickere等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561-570)组成，选择标记基因为新霉素磷酸转移酶II(NPTII)。具体构建过程示于图2：
将pf40 cDNA用限制性内切酶KpnI和SmaI从文库构建载体λZAPII上切下，回收片段，构建至pGEMEX-3Z载体上(购自Promega公司)，得到中间载体pGEMEX-3Z40，PstI酶切后，T4 DNA聚合酶补平，再用SacI酶切后，回收切下的cDNA片段；将双元表达载体pBI121((购自Clontech公司)用SacI和SmaI双酶切，除去报告基因GUS，回收载体大片段，将载体和目的片段连接，转化后，得到构建在pBI121载体上，由35S启动子驱动的pf40 cDNA正向插入的重组质粒pBI40S。将pBI40S采用冻融法直接转化农杆菌LBA4404，获得含有重组质粒pBI40S的农杆菌LBA4404(pBI40S)。农杆菌转化技术为公知技术。
实施例3
35S启动子/pf40表达载体转化烟草
取温室生长的烟草叶片，流水下冲洗，再用蒸馏水洗涤；70％的乙醇灭菌30秒后，无菌水冲洗一次；2.5％次氯酸钠处理8～10分钟；无菌水冲洗三次；将灭菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成0.4×0.6cm2大小；切好的外植体在农杆菌LBA4404(pBI40S)菌液中浸泡10分钟；用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基，28℃暗培养；三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基(MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+Kan75～100μg/ml+Cb(羧苄青霉素)500μg/ml)中进行培养；待抗性芽生长至2～3cm高时，切下小芽转入生根培养基(MS基本培养基+Kan 100μg/ml+Cb 500μg/ml)中诱导生根。
实施例4
转基因烟草叶片中RNA的检测
提取转基因烟草叶片总RNA，采用Oligo(dT)引物进行反转录合成第一链cDNA。RNA的提取及反转录采用现有公知的技术。以此cDNA为模板，根据PF40 cDNA两端的序列设计引物P1：5’GGTGTTCTACAGGGCGCTGATGCT3’和P2：5’CTGCTTTGACAGCTCGCTTCTGGC 3’进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性1分钟；55℃退火1分钟；72℃延伸1分钟；扩增循环数：30。结果参见图4。图中结果表明目的基因在烟草中得到正常转录。转基因烟草植株表现顶端生长受到抑制，顶端优势减弱，侧枝发育(图5，图6)。
实施例5
用于谷子中表达pf40的表达载体的构建
表达盒是由玉米花粉特异启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域(Depickere等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561-570)组成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因，编码氨基核糖苷4-磷酸转移酶APH(4)--1。具体构建过程示于图7。
用HindIII将潮霉素磷酸转移酶基因2.0Kb从pUChyg(Gritz，L and DaviesJ.1983)载体上切下来，然后用HindIII单切ROK219载体(其制备见下文)，将潮霉素磷酸转移酶基因与经HindIII单切的ROK219载体连接得到重组质粒pROK219H。
将PF40质粒(同实施例2中的pGEMEX-3Z40)用限制性内切酶KpnI和SacI双酶切，回收片段，与经KpnI和SacI消化的pROK219H载体连接，得到pROK219HPF40。
制备过程：质粒pBI121(购自Clontech公司)用HindIII/XbaI双酶切，将得到的片段即35S启动子插入到质粒pUC19(Messing J.1983)HindIII/XbaI位点，得到质粒pUC35S，将pBI121用SacI/EcoRI双酶切，将得到的小片段插入到质粒pUC35S的SacI/EcoRI位点，得到质粒ROK219。
实施例6
35S启动子/pf40表达载体转化谷子
取温室生长的谷子幼穗，70％的乙醇灭菌30秒后，无菌水冲洗一次；2.5％次氯酸钠处理8～10分钟；无菌水冲洗三次；剥离幼穗，切成2mm长，在LS培养基(添加物：0.69g/l脯氨酸，0.8g/L酸水解酪蛋白，4mg/LAgNO3，2.5mg/L2，4-D，0.5mg/LKT)诱导愈伤，用于基因枪转化。基因枪轰击采用BioRad BiolisticPDS-1000/Helium系统。在基因枪轰击前4小时，将愈伤切成小块，转移到含0.4M甘露醇的培养基A上，将实施例5制备的pROK219HPF40用于轰击，然后，使愈伤组织在该培养基上继续培养过夜，然后转移到培养基A上培养4-6天，转移至含潮霉素(20mg/L)抗性培养基A上，每周继代一次，2个月后，转化至分化培养基上(LS培养基，含2mg/L6-BA+0.2mg/L1NAA)。
愈伤分化：分化培养基上一个月的时间长出幼芽。
愈伤生根：1/2 LS培养基，诱导生根一个月。
转基因谷子植株表现分蘖增加(图8)。
实施例7
转基因烟草中生长素和细胞分裂素测定
样品处理：取转基因烟草主枝茎尖、侧枝茎尖和根各1g，加4ml PBS提取液(0.8％NaCl，0.02％KH2PO4，0.296％Na2HPO4·12H2O，pH7.5)，冰浴下研磨成匀浆。4℃下提取4h，3500～4000rpm离心15min，取上清液。上清液过C18柱纯化后，在40～45℃水浴下用N2气吹干，用样品稀释液(100ml PBS中加0.1mlTween-20，0.1g白明胶)定容，摇匀后测定。
样品测定：包被：按照给定的稀释倍数进行稀释，各激素的包被条件为IAA4℃过夜；ZR+Z为37℃ 3hr；洗板后，加标准物，待测样和抗体；竞争条件：IAA4℃4hr，ZR+Z为37℃ 0.5hr；洗板；加IgG-HRP：按给定的稀释倍数稀释IgG-HRP，条件为37℃ 30min；洗板；加底物显色，用酶联免疫仪测定。
激素测定结果(表1)表明，转基因烟草顶端组织生长素水平显著比对照降低，根中生长素水平明显提高。pf40基因在顶端优势形成中起激素调节作用。
表1烟草植株生长素和细胞分裂素的含量 部位类别编号 IAA (mg/g) ZR(mg/g) IAA/ZR 主茎 茎尖转基因植株1 176.368 18.123 9.732 2 114.857 15.357 7.479 3 30.581 19.57 1.563 4 277.90 41.72 6.661 5 158.48 17.93 8.839 6 500.25 18.23 27.441 7 498.36 15.645 31.854 8 534.01 18.561 28.771CK 522.09 16.032 32.565 侧枝 茎尖转基因植株 1 43.296 36.819 1.176 2 20.805 14.691 1.416 4-1 55.00 38.65 1.423 4-2 41.72 32.59 1.280 5-1 45.67 37.83 1.207 5-2 40.12 28.93 1.386 5-3 46.58 34.60 1.346 根转基因植株 1 9.732 26.666 0.373 2 11.566 48.9889 0.236 3 8.44 33.87 0.249 4 10.32 29.65 0.348 5 9.85 27.49 0.358 6 0.455 7.231 0.061 7 0.258 6.824 0.037 8 0.560 7.582 0.073CK 0.359 6.917 0.052
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序列表纸件(1)
序列表
<110>中国农业大学
<120>植物顶端发育相关的cDNA以及减弱植物顶端优势增加分枝数目的新方法
<130>PCT08-1
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1274
<212>DNA
<213>rice
<220>
<221>CDS
<222>(146)..(979)
<223>
<400>1
gttcaattca atcactcccc cagccatcgc ctcgcgcagg ctcacgacaa gctcaccctc 60
ctctccctcc cctcccctcc ccttccccgc ttcagcctcg aatcccccaa agcccaaacc 120
ctagcgtagg ctgcgtgggg ggaga atg gag tcg cag gtg ttc tac agg gcg 172
Met Glu Ser Gln Val Phe Tyr Arg Ala
1 5
ctg atg ctc tcg gcc gtc ggc ggg ctc agc acc gcc atc ggt gcg ctg 220
Leu Met Leu Ser Ala Val Gly Gly Leu Ser Thr Ala Ile Gly Ala Leu
10 15 20 25
ttt gtg gtt ttg aat cct gcc cct aac ctt aag atg ctt ggg ctt ctc 268
Phe Val Val Leu Asn Pro Ala Pro Asn Leu Lys Met Leu Gly Leu Leu
30 35 40
cag ggt ttt gct gct ggg ctt atg ctg agc atc tcc ttt cta gac ttg 316
Gln Gly Phe Ala Ala Gly Leu Met Leu Ser Ile Ser Phe Leu Asp Leu
45 50 55
gca cac aat gcg atg aat tct att ggc ttc ttg aag ggc aac ctc tgg 364
Ala His Asn Ala Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Lys Gly Asn Leu Trp
60 65 70
ttt ttt gca gga gtt ctt ttc ttt ggt ttt atc gtc aaa ttt att cca 412
Phe Phe Ala Gly Val Leu Phe Phe Gly Phe Ile Val Lys Phe Ile Pro
75 80 85
gag cca gac ttt tca cca gaa gct gat cca agt gag aaa aag gct gat 460
Glu Pro Asp Phe Ser Pro Glu Ala Asp Pro Ser Glu Lys Lys Ala Asp
90 95 100 105
gat ggt ggc tcg ggt aaa gat atg atg aga aaa cat cgc cgg caa gtg 508
Asp Gly Gly Ser Gly Lys Asp Met Met Arg Lys His Arg Arg Gln Val
110 115 120
tta ttc agt ggt att atc act gct gtt gga att agc ttg cac aat ttt 556
Leu Phe Ser Gly Ile Ile Thr Ala Val Gly Ile Ser Leu His Asn Phe
125 130 135
cca gag gga atg gct gta ttt ctt ggg tct gtg aag ggt ctt cat gtg 604
Pro Glu Gly Met Ala Val Phe Leu Gly Ser Val Lys Gly Leu His Val
140 145 150
ggt ctg aac ttg gct gtt gct att gct tta cat aac ata cca gag ggg 652
Gly Leu Asn Leu Ala Val Ala Ile Ala Leu His Asn Ile Pro Glu Gly
155 160 165
gtt gct gta gct ctt cca att tat ttt gct acc aag agc aaa tgg aag 700
Val Ala Val Ala Leu Pro Ile Tyr Phe Ala Thr Lys Ser Lys Trp Lys
170 175 180 185
序列表纸件(1)
gca ttt tat atg gca gca gga tcc ggt ttg gcc gag cca gta gga gta 748
Ala Phe Tyr Met Ala Ala Gly Ser Gly Leu Ala Glu Pro Val Gly Val
190 195 200
att gct gta gct tac ttg ttt cca agc agc ttg aat cct gac att ctt 796
Ile Ala Val Ala Tyr Leu Phe Pro Ser Ser Leu Asn Pro Asp Ile Leu
205 210 215
gaa ggt tta ctt gga tct gtt ggt ggt gtt atg gct ttc ctc act ctg 844
Glu Gly Leu Leu Gly Ser Val Gly Gly Val Met Ala Phe Leu Thr Leu
220 225 230
cat gaa atg ctg cct ctt gca ttt gac tat tgt ggc cag aag cga gct 892
His Glu Met Leu Pro Leu Ala Phe Asp Tyr Cys Gly Gln Lys Arg Ala
235 240 245
gtc aaa gca gtc ttt gtg ggc atg gcc tgc atg tct gca agc ttg tac 940
Val Lys Ala Val Phe Val Gly Met Ala Cys Met Ser Ala Ser Leu Tyr
250 255 260 265
ttc ttg gag atc agc cta cca aag gag ata agc ttg tag catcacatct 989
Phe Leu Glu Ile Ser Leu Pro Lys Glu Ile Ser Leu
270 275
gtagcgccgc aagtcctcca cagtgtcaca gcagcatctg aattctaaag ctgagctttt 1049
cagtcagtgt gttcctggag gatttcatcc gacaatgtgt ttaggcagta ggcactacac 1109
caaaacatca gaaaggagcc aggaacaatg gctacatgta tcggaggggg gaaactgcat 1169
ttccccagga tgtaaaaact gaattagttg ccagacgatt cgtggcaact gtaacaatcg 1229
aaaaattgta gtcctcagtt ggtcgacaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1274
<210>2
<211>277
<212>PRT
<213>rice
<400>2
Met Glu Ser Gln Val Phe Tyr Arg Ala Leu Met Leu Ser Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Leu Ser Thr Ala Ile Gly Ala Leu Phe Val Val Leu Asn Pro Ala
20 25 30
Pro Asn Leu Lys Met Leu Gly Leu Leu Gln Gly Phe Ala Ala Gly Leu
35 40 45
Met Leu Ser Ile Ser Phe Leu Asp Leu Ala His Asn Ala Met Asn Ser
50 55 60
Ile Gly Phe Leu Lys Gly Asn Leu Trp Phe Phe Ala Gly Val Leu Phe
65 70 75 80
Phe Gly Phe Ile Val Lys Phe Ile Pro Glu Pro Asp Phe Ser Pro Glu
85 90 95
Ala Asp Pro Ser Glu Lys Lys Ala Asp Asp Gly Gly Ser Gly Lys Asp
100 105 110
Met Met Arg Lys His Arg Arg Gln Val Leu Phe Ser Gly Ile Ile Thr
115 120 125
Ala Val Gly Ile Ser Leu His Asn Phe Pro Glu Gly Met Ala Val Phe
序列表纸件(1)
130 135 140
Leu Gly Ser Val Lys Gly Leu His Val Gly Leu Asn Leu Ala Val Ala
145 150 155 160
Ile Ala Leu His Asn Ile Pro Glu Gly Val Ala Val Ala Leu Pro Ile
165 170 175
Tyr Phe Ala Thr Lys Ser Lys Trp Lys Ala Phe Tyr Met Ala Ala Gly
180 185 190
Ser Gly Leu Ala Glu Pro Val Gly Val Ile Ala Val Ala Tyr Leu Phe
195 200 205
Pro Ser Ser Leu Asn Pro Asp Ile Leu Glu Gly Leu Leu Gly Ser Val
210 215 220
Gly Gly Val Met Ala Phe Leu Thr Leu His Glu Met Leu Pro Leu Ala
225 230 235 240
Phe Asp Tyr Cys Gly Gln Lys Arg Ala Val Lys Ala Val Phe Val Gly
245 250 255
Met Ala Cys Met Ser Ala Ser Leu Tyr Phe Leu Glu Ile Ser Leu Pro
260 265 270
Lys Glu Ile Ser Leu
275