可活化的药物前体中的加长的多间隔基 技术领域
本发明涉及可以在优选的作用位点被激活的药物前体，其可用于向靶细胞或靶部位选择性地输运相应的治疗或诊断母体部分。因此，本发明主要但不仅仅涉及以肿瘤细胞作为靶细胞。
背景技术
化疗剂缺乏选择性是癌症治疗中的一个主要问题。因为在癌症化疗中使用的化合物毒性都很高，所以它们往往带来严重的副作用。为了抑制这些副作用(如对胃肠道和骨髓的毒性)，往往需要限制剂量，而这又使得无法达到可以彻底根除肿瘤的药物浓度。此外，长时间治疗后肿瘤可以对抗癌制剂产生抗药性。在现代药物研发中，细胞毒性药物对肿瘤位点的靶向性被视为主要的目标之一。
获得对肿瘤细胞或肿瘤组织地选择性的一个有希望的研究途径是利用与肿瘤有关的酶的存在。较高水平的肿瘤特异性酶可以将无药学活性的药物前体在肿瘤附近转变为相应的活性母体药物。借此，在肿瘤部位可以产生高浓度的毒性抗癌制剂。如果剂量足够高的话可以杀死所有的肿瘤细胞，从而降低了肿瘤细胞抗药性的产生。
在某些肿瘤组织中，某些酶的水平较高。一个实例是β-葡糖苷酸酶，其从某些坏死的肿瘤区域释放出来。此外，已表明一些蛋白水解酶与肿瘤的侵入和转移有关。多种蛋白酶如组织蛋白酶和来自脲激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)系统的蛋白酶都参与肿瘤的转移。丝氨酸蛋白酶纤溶酶在肿瘤的侵入和转移中其关键作用。纤溶酶的蛋白水解活性形式由其失活的酶原形式的纤溶酶原借助u-PA形成。可以利用与肿瘤有关的纤溶酶的存在来引导(targeting)可用纤溶酶裂解的药物前体。
在本发明中，公开了一项新技术，其可以用来制备将药物导向与疾病有关的或器官特异性的组织或细胞的药物前体或共轭物(conjugate)，例如，肿瘤特异性药物前体。该技术还可以用于化合物的(非特异性)控制释放中，其目的在于促进母体部分的释放。本发明可用于需要输运至特定靶部位的所有药物，其中与特异性疾病相关的生物分子可以将药物前体转变为药物或者引起所述药物前体向药物的转变。
发明内容
本发明的技术涉及新的连接基(1inker)系统，所述连接基插在特异物(specitier，药物前体的将被酶裂解的部分)和母体药物之间。过去开发的大量抗癌药物前体含有自身消去的连接剂或连接基，也可以称为自身消去型间隔基。所述间隔基(spacer)可以插在特异物和药物之间，以便于酶的裂解并因此提高药物释放的动力学(如图1所示)。所述特异物(例如，其可以是蛋白酶的寡肽底物或者是β-葡糖苷酸酶的β-葡糖苷酸底物)必须在特定位点除去，接着是自发的间隔基消去反应以释放细胞毒性的母体药物。在本发明中，公开了大大改进的连接基系统。它们可用于药物前体(例如，抗癌药物前体)中，并显著地提高酶的活化速度。
更具体地讲，本发明涉及下式的化合物：
V-(W)k-(X)l-A-Z
其中：
V是酶解可除去的特异物，
(W)k-(X)l-A是加长的自身消去型间隔基系统，
W和X各是l，(4+2n)电子级联间隔基(electronic cascade spacer)，可相同或不同，
A是式(Y)m的间隔基，其中Y是l，(4+2n)电子级联间隔基，
或者是式U所示的基团，作为一个环合消去间隔基，
Z是用于治疗或诊断的药物部分，
k、l和m各自独立地是0至5的整数(包括0和5)，
n是0至10的整数(包括0和10)，
其条件是：
-当A是(Y)m时：则k+l+m≥1，且
如果k+l+m＝1，则n＞1；
-当A是U时：则k+l≥1。
这些新的加长的连接基系统显示出改进的酶活化特征，这些将在下文的实施例中说明。
本发明的可活化药物前体包含特异物V，其由一个可在特定位点除去的基团组成，并通过本发明的新的加长的可自身消去型连接基系统(W)k-(X)l-A，与用于治疗或诊断的Z部分之间建立共价连接(图2)。这些自身消去型连接基系统具有增加的长度，其导致母体药物Z与特异物之间的距离增加。
观察到通过1，(4+2n)-消去(n＝0，1，2，3，4，5...10)(例如1，6-消去、1，8-消去或1，10-消去)进行自消去的间隔基(现称其为“电子级联(electronic cascade)”间隔基)。
按照本发明的优选实施方案，电子级联间隔基W、X和Y各自独立地选自下式化合物：
Q＝-R5C＝CR6-、S、O、NR5、-R5C＝N-或-N＝CR5-
P＝NR7、O、S
其中，a、b和c各自独立地是0至5的整数(包括0和5)；
I、F和G各自独立地选自下式化合物：
或或
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地表示H、C1-6烷基、C3-20杂环基、C5-20芳基、C1-6烷氧基、羟基(OH)、氨基(NH2)、单取代的氨基(NRxH)、二取代的氨基(NRx1Rx2)硝基(NO2)、卤素、CF3、CN、CONH2、SO2Me、CONHMe、环C1-5烷基氨基、咪唑基、C1-6烷基哌嗪基、吗啉代、巯基(SH)、硫醚基(SRx)、四唑基、羧基(COOH)、羧酸酯基(COORx)、亚硫酸基(S(＝O)2OH)、磺酸酯基(S(＝O)2ORx)、磺酰基(S(＝O)2Rx)、亚磺酸基(S(＝O)OH)、亚磺酸酯基(S(＝O)ORx)、亚磺酰基(S(＝O)Rx)、磷酰氧基(OP(＝O)(OH)2)和磷酸酯基(OP(＝O)(ORx)2)，其中Rx、Rx1和Rx2各自独立地选自C1-6烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，取代基R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9中的两个或多个任选地彼此连接形成一个或多个脂族或芳族环结构。
还观察到，1981年发现的1，6-消去反应的原则，可以看做是可用于药物前体设计的最通用的自身消去反应原则之一。根据这一原则，通过图3描述的机理进行间隔基消去反应。已证明此特定的消去方法用于药物前体概念中时是非常成功的。通过附图3描述的电子级联顺序进行自身消去型间隔基一般比通过环合反应消去的间隔基显示出更短的消去半衰期。这是环合间隔基和电子级联间隔基的显著区别。
在下列实施例中，使用了对-氨基苄氧基羰基(PABC)电子级联间隔基系统，这是因为与羟基苄基电子级联间隔基相比，它们在胺暴露时消去得更快，而且要发生间隔基消去反应，在羟基苄基电子级联间隔基的苯基部分需要吸电子取代基。当间隔基是未被取代的羟基苄基电子级联间隔基时不会发生药物释放。
因此，过去人们将大部分的努力投向了对含吸电子取代基(一个或多个)的电子级联间隔基的合成。人们设想从发生酶活化的位点吸引电子将会提高酶活化的速度。但是，间隔基上含吸电子基团的药物前体的活化速度与含有未被取代的电子级联间隔基的药物前体相比，并没有显著不同：例如，在氨基苄基间隔基上的氯取代基，只略微提高了纤溶酶对酶的药物前体活化的速度。对于通过β-葡糖苷酸酶活化的含氨基苄基间隔基的蒽环药物前体，氯或溴取代基只显示出很小的作用。还必须进一步考虑虽然氨基苄基间隔基上的吸电子基团可以增加酶活化速度，但是具有如此电性的取代基造成的后果是间隔基消去反应速度将会降低。对于产生羟基氨基苄基电子级联间隔基的情况，苄基环上的给电子取代基似乎确实加速了裂解。此作用可能归因于这些取代基对苄基碳原子上形成的正电荷的稳定作用。在一些情况下，当一个或多个间隔基取代基都是吸电子的时，间隔基消去反应将根本不发生。处于特异物的间位的含硝基取代基的氨基苄基间隔基，不自身消去释放游离的药物。还发现，在特异物的间位的含硝基取代基的氨基苄基间隔基显示出的消去反应速度在此类被取代的羟基氨基苄基间隔基中最低。似乎间隔基取代基的吸电子性质对酶活化速度只产生很小的影响，而间隔基消去反应极大地依赖于间隔基取代基的电性，并根据使用的电子级联间隔基的类型只在较窄的特征电性中发生。
以前已报道过一些药物前体，它们含有一个电子级联间隔基，当不同的母体药物与相同的原部分(promoiety)连接时或者当母体药物在药物的不同位点与相同的原部分连接时，仍可观察到酶活化速度的不同。例如，当紫杉醇是母体药物时，与含阿霉素作为母体药物的药物前体相比，β-葡糖苷酸酶从β-葡糖苷酸-环合间隔基的原部分裂解葡糖苷酸的速度慢得多。在其它实例中，当紫杉醇通过其7位连接时，与通过其2’位连接相比，通过氨基苄基间隔基连接的紫杉醇的二肽衍生物更容易被组织蛋白酶B裂解。此外，组织蛋白酶B裂解含电子级联间隔基的阿霉素药物前体或丝裂霉素C药物前体的半衰期，比以紫杉醇作为母体药物的相应药物前体的半衰期更短。最后，纤溶酶从含电子级联间隔基的阿霉素药物前体中裂解三肽比从相应的紫杉醇药物前体中裂解三肽更容易。因此，在一些药物前体系统中，母体药物对酶活化的速度仍表现出显著的影响，即使上述药物前体都含有一个电子级联间隔基。
本发明使用加长的间隔基系统，通过降低间隔基的取代基对药物前体活化和/或间隔基消去的影响以及母体药物对药物前体的酶活化的影响，从而克服了上述缺点。
第二方面，本发明涉及上述通式的化合物，其中基团U是环合间隔基(此后称为“ω-氨基氨基羰基”环合间隔基)，而Z是带有羟基的药物。
更优选本发明的ω-氨基氨基羰基环合消去间隔基U是下式化合物：
或或或
其中：
a是0或1的整数；而
b是0或1的整数；且
c是0或1的整数；其条件是
a+b+c＝2或3；
而其中R1和/或R2各自独立地表示H、C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个下列基团取代：羟基(OH)、醚(ORx)、氨基(NH2)、单取代的氨基(NRxH)、二取代的氨基(NRx1Rx2)、硝基(NO2)、卤素、CF3、CN、CONH2、SO2Me、CONHMe、环C1-5烷基氨基、咪唑基、C1-6烷基哌嗪基、吗啉代、巯基(SH)、硫醚基(SRx)、四唑基、羧基(COOH)、羧酸酯基(COORx)、亚硫酸基(S(＝O)2OH)、磺酸酯基(S(＝O)2ORx)、磺酰基(S(＝O)2Rx)、亚磺酸基(S(＝O)OH)、亚磺酸酯基(S(＝O)ORx)、亚磺酰基(S(＝O)Rx)、磷酰氧基(OP(＝O)(OH)2)和磷酸酯基(OP(＝O)(ORx)2)，其中Rx、Rx1和Rx2选自C1-6烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基；且
R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地表示H、C1-6烷基、C3-20杂环基、C5-20芳基、C1-6烷氧基、羟基(OH)、氨基(NH2)、单取代的氨基(NRxH)、二取代的氨基(NRx1Rx2)、硝基(NO2)、卤素、CF3、CN、CONH2、SO2Me、CONHMe、环C1-5烷基氨基、咪唑基、C1-6烷基哌嗪基、吗啉代、巯基(SH)、硫醚基(SRx)、四唑基、羧基(COOH)、羧酸酯基(COORx)、亚硫酸基(S(＝O)2OH)、磺酸酯基(S(＝O)2ORx)、磺酰基(S(＝O)2Rx)、亚磺酸基(S(＝O)OH)、亚磺酸酯基(S(＝O)ORx)、亚磺酰基(S(＝O)Rx)、磷酰氧基(OP(＝O)(OH)2)和磷酸酯基(OP(＝O)(ORx)2)，其中Rx、Rx1和Rx2选自C1-6烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7或R8取代基中的两个或多个任选地彼此连接形成一个或多个脂族或芳族环结构。
在第三方面，本发明涉及上述通式的化合物，其中间隔基A是下式的电子级联间隔基：
Q＝-R5C＝CR6-、S、O、NR5、-R5C＝N-或-N＝CR5-
P＝NR7、O、S
其中a、b和c各自独立地是0至5的整数；
I、F和G各自独立地选自下式化合物：
或或
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地表示H、C1-6烷基、C3-20杂环基、C5-20芳基、C1-6烷氧基、羟基(OH)、氨基(NH2)、单取代的氨基(NRxH)、二取代的氨基(NRx1Rx2)、硝基(NO2)、卤素、CF3、CN，CONH2、SO2Me、CONHMe、环C1-5烷基氨基、咪唑基、C1-6烷基哌嗪基、吗啉代、巯基(SH)、硫醚基(SRx)、四唑基、羧基(COOH)、羧酸酯基(COORx)、亚硫酸基(S(＝O)2OH)、磺酸酯基(S(＝O)2ORx)、磺酰基(S(＝O)2Rx)、亚磺酸基(S(＝O)OH)、亚磺酸酯基(S(＝O)ORx)、亚磺酰基(S(＝O)Rx)、磷酰氧基(OP(＝O)(OH)2)和磷酸酯基(OP(＝O)(ORx)2)，其中Rx、Rx1和Rx2各自独立地选自C1-6烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，取代基R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9中的两个或多个任选地彼此连接形成一个或多个脂族或芳族环结构。
在本发明的一个实施方案中，加长的间隔基系统(W)k-(X)l-A是通过1，(4+2n)消去(n＝2，3，4，5……10)来进行自身消去的分子，例如1，8-消去反应(图4)。此新间隔基系统的长度可以延伸，例如至1，10-消去反应间隔基系统，其中两个或多个(而不是一个)双键或三键与间隔基的芳族部分相共轭(图5)。
在另一个实施方案中，本发明的间隔基系统由彼此连接的两个或多个电子级联间隔基组成。两个或多个顺序排列的间隔基消去后，发生离去基(药物)的释放。
在又一个实施方案中，请求保护含羟基官能团的药物(如紫杉醇)的药物前体，其含有一个或多个电子级联间隔基和一个环合间隔基。
在优选的实施方案中，直接与紫杉醇分子连接的间隔基是ω-氨基羰基环合间隔基，其通过氨基甲酸酯键连接在紫杉醇的2′位上。本申请公开了此类紫杉醇衍生物的便利的合成路线。
在另一个实施方案中，加长的电子级联间隔基系统与药物部分的酚羟基通过醚键偶联。当离去基(即药物)是酚羟基时，已发现对氨基苄基醚发生自身消去。
本发明的自身消去连接基系统与目前使用的电子级联间隔基系统相比长度更长。观察到，所述连接基系统的一端必须能够与特异物反应，例如，作为纤溶酶底物的三肽。一般来说，间隔基系统的此末端是氨基或羟基，但是其也可以是其它官能团。所述连接基系统的另一端的官能团必须能够与药物反应。一般来说，所述间隔基系统的此末端是羟基，但是其也可以是其它官能团。在一个实施方案中，此官能团与药物的氨基反应在连接基和药物之间形成氨基甲酸酯键。在另一个实施方案中，此官能团与药物的羟基基团反应在连接基和药物之间形成碳酸酯键。在另一个实施方案中，此官能团与巯基基团反应在连接基和药物之间形成硫代碳酸酯键。在另一个实施方案中，此官能团与药物的羧酸基团反应在连接基和药物之间形成酯键。
一般来说，间隔基系统是对-氨基苄氧基羰基-对-氨基苄氧基羰基、对-氨基苄氧基羰基-对-氨基苄氧基羰基-对-氨基苄氧基羰基、对-氨基肉桂基氧基羰基、对-氨基肉桂基氧基羰基-对-氨基苄氧基羰基、对-氨基苄氧基羰基-对-氨基肉桂基氧基羰基、对-氨基肉桂基氧基羰基-对-氨基肉桂基氧基羰基、对-氨基苯基戊二烯氧基羰基、对-氨基苯基戊二烯氧基羰基-对-氨基肉桂基氧基羰基、对-氨基苯基戊二烯氧基羰基-对-氨基苄氧基羰基、对-氨基苯基戊二烯氧基羰基-对-氨基苯基戊二烯氧基羰基、对氨基苄氧基羰基(甲基氨基)乙基(甲基氨基)羰基、对-氨基肉桂基氧基羰基(甲基氨基)乙基(甲基氨基)羰基、对-氨基苄氧基羰基-对-氨基苄氧基羰基(甲基氨基)乙基(甲基氨基)羰基、对-氨基肉桂酰氧基羰基-对-氨基苄氧基羰基(甲基氨基)乙基(甲基氨基)羰基、对-氨基苄氧基羰基-对-氨基肉桂酰氧基羰基(甲基氨基)乙基(甲基氨基)羰基、对-氨基肉桂酰氧基羰基-对-氨基肉桂酰氧基羰基(甲基氨基)乙基(甲基氨基)羰基、对-氨基苄氧基羰基-对-氨基苄基、对氨基苄氧基羰基-对-氨基苄氧基羰基-对-氨基苄基、对-氨基肉桂基、对氨基肉桂基氧基羰基-对-氨基苄基、对-氨基苄氧基羰基-对-氨基肉桂基、对-氨基肉桂基氧基羰基-对氨基肉桂基、对氨基苯基戊二烯基、对-氨基苯基戊二烯基氧基羰基-对-氨基肉桂基、对-氨基苯基戊二烯基氧基羰基-对-氨基苄基或者对-氨基苯基戊二烯基氧基羰基-对-氨基苯基戊二烯基。
在式V-(W)k-(X)l-A-Z的化合物中，特异物V-般含有被靶细胞如肿瘤细胞附近存在的酶特异地裂解的底物分子。更具体地讲，特异物V含有被与身体的其它部位相比在靶细胞附近以较高水平存在的酶所特异地裂解的底物，并且优选该酶仅存在于靶细胞的附近。
特异物V还可以含有将式V-(W)k-(X)l-A-Z的化合物导向特定位点的部分，这一靶向作用可以通过与受体或其它与指定的靶细胞群相关的接受部分选择性结合、或者通过其它机制引起化合物V-(W)k-(X)l-A-Z在靶细胞附近的蓄积来完成。所述靶向部分，例如，可以是铃蟾肽、运铁蛋白、胃泌素、胃泌素释放肽、特异地结合αvβ3和/或αvβ5-整联蛋白受体的分子(如含RGD的肽)、血小板衍生因子、IL-2、IL-6、肿瘤生长因子、痘苗生长因子、胰岛素和胰岛素样生长因子I和II、抗原识别免疫球蛋白或其抗原识别片断、或者碳水化合物。优选，被免疫球蛋白(或其片断)识别的所述抗原对靶细胞是特异性的，如肿瘤特异性抗原。特异物V还可以含有聚合物，其引起化合物V-(W)k-(X)l-A-Z在靶细胞(如肿瘤细胞)的附近蓄积，这是由于增强性渗透能力和保留(EPR)作用。
在一个实施方案中，所述特异物是二肽、三肽或寡肽，其由被蛋白酶特异地识别的氨基酸序列，所述蛋白酶如纤溶酶、组织蛋白酶、组织蛋白酶B、前列腺特异性抗原(PSA)、脲激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)、或者基质金属蛋白酶族的一些成员，其存在于靶细胞(如肿瘤细胞)的附近，或者在另一个实施方案中，被β-葡糖苷酸酶特异地识别的β-葡糖苷酸存在于肿瘤细胞附近。在另一个实施方案中，所述特异物是能在缺氧条件下被还原或通过硝基还原酶还原而被除去的硝基-芳族部分。所述硝基-芳族特异物除去后，本发明描述的间隔基系统的消去导致药物的释放。可以理解，在被疾病特异性和/或器官特异性酶和/或受体识别后特异地裂解的任何特异物，均可以引入到含有本申请所要求保护的连接基系统的药物前体中。
Z部分是治疗或诊断部分。例如，Z可以是抗癌药、抗生素、抗炎剂或抗病毒剂。一般来说，Z部分是抗癌药。优选所述抗癌药是含氨基的柔红霉素、阿霉素、N-(5，5-二乙酰氧基戊基)阿霉素、蒽环类、丝裂霉素C、丝裂霉素A、9-氨基喜树碱、氨基喋呤、放线霉素、博莱霉素、N8-乙酰基亚精胺、1-(2-氯乙基)-1，2-二甲烷磺酰基肼、他利霉素(tallysomycin)或其衍生物。所述抗癌药物也可以是含羟基的依托泊苷、喜树碱、伊立替康(irinotecan)、托普替康(topotecan)、9-氨基喜树碱、紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、esperamycin、1，8-二羟基-二环[7.3.1]十三碳-4-烯-2，6-二炔-13-酮、anguidine、阿霉素、吗啉-阿霉素、N-(5，5-二乙酰氧基戊基)阿霉素、长春新碱、长春碱或其衍生物。所述抗癌药物也可以是含巯基的esperamicin、6-巯基嘌呤或其衍生物。所述药物也可以是含有羧基的氨甲蝶呤、喜树碱(内酯的开环形式)、丁酸、视黄酸或其衍生物。
为了显示加长的间隔基系统的消去反应原则，合成能被与肿瘤相关的蛋白酶纤溶酶选择性水解的肿瘤特异性药物前体。合成的药物前体由通过延长的自身消去型间隔基与药物偶联的三肽特异物组成。所述三肽特异物含有能被与肿瘤有关的纤溶酶特异性识别的氨基酸序列。本申请公开了这些衍生物的合成。
与制备针对恶性肿瘤的某些蛋白酶相关的文献正不断增加。首先，当肿瘤细胞变得具有侵入性和形成转移时需要蛋白水解活性。原发性肿瘤包封在由蛋白质组成的细胞外基质中。为了形成转移，原发性肿瘤必须冲出该基质。为此，产生了侵入和转移肿瘤对蛋白水解酶的加强表达。最近的研究表明蛋白酶还参与了肿瘤恶化的早期阶段，不论是在原发部位还是在转移部位。多种蛋白酶，如组织蛋白酶、u-PA系统和基质金属蛋白酶，都参与了所述的蛋白水解级联(proteolytic cascade)。
所述u-PA系统在文献中受到了广泛的关注，特别是在最近十年中。一些侵入和转移的人肿瘤表达了明显高于正常组织的纤溶酶原激活剂活性。在一些肿瘤细胞系和人实体瘤(如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌及其它类型的肿瘤)中发现了u-PA的表达和活性的增加。在癌症中和组织改型过程中，u-PA是细胞散播和侵入所需要的蛋白水解反应中的一种重要的酶。u-PA与细胞表面特异性高亲合力受体相互作用。与受体结合的u-PA不需要经过细胞内摄(internalization)就在细胞表面表现出催化活性。它与纤溶酶原作用产生仍结合在细胞表面的纤溶酶。通过此路径的高u-PA水平导致纤溶酶水平升高。现已存在确实的证据，表明蛋白酶纤溶酶本身在肿瘤侵入和转移中扮演了关键角色。纤溶酶本身催化细胞外基质蛋白的裂解。因此，纤溶酶原激活剂系统与肿瘤转移有密切联系。即使是最近被看做是开发新治疗策略的一个重要靶向机制的血管生成过程，也是一个脲激酶依赖性过程。纤溶酶原激活系统可以通过调节整联蛋白功能参与细胞的粘附过程。有迹象表明血管内皮生长因子(VEGF，一种血管生成分子)，在肿瘤恶化中与u-PA相互作用。在很多动物模型系统试验中，催化纤溶酶产生的u-PA被证明是肿瘤转移的元凶。
基于上述原因，纤溶酶可能是引导抗癌剂的肽类药物前体的一种非常有希望的酶。活性纤溶酶位于肿瘤组织中，由于它是借助u-PA由其失活的酶原形式的纤溶酶原形成的，而u-PA是由癌症和/或基质细胞产生的。在血液循环中，活性纤溶酶非常快速地被阻断活性位点的抑制剂(如α2-抗纤溶酶)所抑制。在肿瘤组织中存在的结合细胞的纤溶酶不被抑制。此外，纤溶酶非常适于用作药物前体的靶向酶，因为它在蛋白水解级联的末端产生。一个分子的u-PA可以产生一个分子以上的纤溶酶。
用作纤溶酶底物的三肽的氨基酸序列必须是丝氨酸蛋白酶纤溶酶的特异性的底物。与间隔基-药物部分偶联的C-末端氨基酸，优选是L-赖氨酸残基。已知在赖氨酸残基后，纤溶酶裂解最容易进行。在N-末端的氨基酸具有D-构型以防止其在体内被大量存在的氨基肽酶裂解。用Boc或Fmoc基团保护N-末端氨基官能团也可以防止不希望的肽酶裂解的发生。中间的氨基酸优选是疏水性的L-氨基酸，并选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、环己基甘氨酸、色氨酸和脯氨酸。优选的三肽序列为D-丙氨酸苯丙氨酸赖氨酸、D-缬氨酸亮氨酸赖氨酸、D-丙氨酸亮氨酸赖氨酸、D-缬氨酸苯丙氨酸赖氨酸、D-缬氨酸色氨酸赖氨酸及D-丙氨酸亮氨酸赖氨酸。通过将三肽的两个氨基转变为相应的铵盐，可以改善所述药物前体的水溶性。
在本发明中，描述了新的加长的间隔基系统的合成和应用。在一个实施方案中，通过1，(4+2n)-消去方法进行所述间隔基的自身消去(图4，5)。与常规的1，6-消去间隔基相比，这些1，(4+2n)-消去间隔基是加长的。用锌和乙酸进行的紫杉醇硝基肉桂基碳酸酯衍生物的化学还原反应证实了1，8-消去原则(图6、7)。以良好的收率分离了释放的紫杉醇。首先，合成双重保护的三肽(图8)。如图9所示由4-硝基肉桂基醇合成1，8-消去间隔基本身。在阿霉素和用于激活纤溶酶的三肽之间插入4-氨基肉桂基醇(图10)。本发明还公开了含有两个或多个彼此连接的电子级联间隔基的药物前体的合成，所述间隔基插在特异物和药物之间(图11)。以前没有报告过含有此类连接基系统的药物前体。本发明的这一实施方案通过合成两种含有与阿霉素或紫杉醇通过两个1，6-消去间隔基偶联的三肽特异物的药物前体，来举例说明。所述被保护的三肽接着与4-氨基苄基醇偶联，并用氯甲酸4-硝基苯基酯活化所得苄醇，得到相应的4-硝基苯基碳酸酯(图12)。在一个非常有效的反应中，第二个分子的4-氨基苄基醇与所述活化的碳酸酯发生偶联，其中用羟基苯并三唑(HOBt)作为催化剂，得到相应的三肽-双间隔基轭合物(图13)。当用二苯基膦酸作为催化剂进行此反应时，只以16％的收率分离出产物(图14)。将所述肽-双间隔基轭合物(conjugate)插入到阿霉素药物前体(图15)和紫杉醇药物前体(图16)中，通过依次进行氯甲酸酯活化，接着与药物偶联并最终脱保护。还合成了其中用色氨酸残基代替苯丙氨酸的含双间隔基的阿霉素药物前体(图17，18)。按照另一个实施方案，第三个4-氨基苄基醇间隔基与4-硝基苯基碳酸酯激活的三肽-双间隔基轭合物反应得到相应的三肽-三间隔基轭合物(图19)。接着，采用类似于图15和16描述的路线，将此化合物转变为含相应的三电子级联间隔基的阿霉素药物前体。
还要求保护的是多种药物前体，其中原部分与母Z部分的羟基通过氨基甲酸酯键偶合。这些氨基甲酸酯偶合的药物前体含有一个加长的连接基系统，其含有一个或多个电子级联间隔基和一个ω-氨基氨基羰基环合间隔基(图20)。此类紫杉醇-2′-氨基甲酸酯药物前体通过新的汇聚性路线合成，这带来了高收率，如权利要求35和36所述。在经过一个或多个1，(4+2n)-消去(n＝0，1，2，3，4，5，....10)和随后的分子内环合后，将紫杉醇释放出来。在本发明中，所述环合间隔基通过氨基甲酸酯键与紫杉醇的2′-OH基团连接(图20)。首先，紫杉醇在2′-位被选择性地激活(图21)。其次，单保护的环合间隔基与2′-活化的紫杉醇类物质偶合，并在酸性条件下除去保护基，得到第一个片断(图22)。通过将1，6-消去间隔基连接在三肽特异物上，并接着进行苄醇官能团的氯甲酸4-硝基苯基酯激活，合成第二个片断(图12)。然后，将两个片断彼此偶联(图23)，并将偶联的产物脱保护(图24)。按照此方案进行的两个独立的片断的偶联(其中在最后阶段在两个间隔基之间建立化学连接)，确实提供了合成紫杉醇药物前体的最有效途经。这是获得此类药物前体的新途经，其中特异物与含羟基的药物通过电子级联间隔基系统(与特异物连接)和环合间隔基(与药物连接)连接。含电子级联间隔系统和环合间隔基的紫杉醇的另外两种药物前体的制备，描述于图25-27。在图28中，描述了以前报导的含一个电子级联间隔基的可活化纤溶酶的药物前体。
本发明的另一个方面涉及合成上述药物前体的方法。例如，本发明涉及合成上述带有彼此连接的、插入特异物基团和药物分子之间的至少一个电子级联间隔基及一个ω-氨基氨基羰基环合消去连接基的上述药物前体的合成方法，其中所述药物分子通过其羟基官能团与所述环合消去间隔基连接，通过将与所述特异物基团连接的第一个电子级联间隔基，如果需要，通过将至少一个与所述第一个电子级联间隔基相同或不同的第二个电子级联间隔基与所述环合消去间隔基偶联。在优选的方法中，所述药物分子是紫杉醇，且在第一步中通过将游离的间隔基-胺加入到4-硝基苯基碳酸酯激活的药物中，来将环合消去间隔基通过氨基甲酸酯键与紫杉醇的2′-羟基连接，接着脱保护获得由与紫杉醇相连的环合间隔基组成的第一片断来；而在第二步中将相同或不同的一个或多个1，(4+2n)电子级联间隔基(其中n是1至10的整数)与特异物基团偶联，接着活化为相应的4-硝基苯基碳酸酯，此后，在第三步中，将在第一步和第二步中所获得的片断在碱性反应条件下彼此偶联。
本发明还涉及合成上述药物前体的方法，其中通过将上述一个电子级联间隔基的醇基转变为相应的4-硝基苯基碳酸酯基，并让此分子与另一个电子级联间隔基在催化量的1-羟基苯并三唑的存在下反应(该反应中可以存在或不存在碱)，将一个电子级联间隔基的末端醇基团与另一个电子级联间隔基的苯胺氨基通过氨基甲酸酯键偶联，从而将电子级联间隔基彼此连接起来。
本发明的另一个方面涉及任何上述化合物在制备用于治疗有治疗需要的哺乳动物的药物制剂中的用途。本发明还涉及治疗有治疗需要的哺乳动物的方法，该方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物。
本发明的另一个方面涉及制备含有上述化合物的药物组合物的方法，以提供口服、局部或注射给药的固体或液体制剂。该方法至少包括将所述化合物与药用载体混合的步骤。
本发明还涉及含有上述本发明化合物的药物组合物。本发明的化合物可以纯化的形式与药用载体以药物组合物的形式使用。优选的形式依赖于预定的给药方式和治疗或诊断用途。药用载体可以是任何相容的、无毒的、适于给患者输运本发明化合物的物质。药用载体是本领域熟知的，例如，水溶液(如(灭菌)水或生理缓冲盐水)或者其它溶剂或载体如二醇、甘油、油(如橄榄油)，或注射用有机酯、醇、脂肪、蜡，以及惰性固体，可以用作载体。药用载体可以进一步含有生理可接受的化合物，例如，起稳定作用或增加本发明化合物吸收的作用。此类生理可接受的化合物包括，例如，碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷)、抗氧剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白或其它稳定剂或赋形剂。本领域技术人员会知道药用载体(包括生理可接受化合物)的选择，依赖于，例如，所述组合物的给药途经。药用辅剂、缓冲剂、分散剂等，也可以加入到药物组合物中。
为了口服给药，所述活性组分可以固体剂型给药(如胶囊、片剂和散剂)，或者以液体剂型给药(如酏剂、糖浆剂混悬剂)。活性组分(一种或多种)可以与无活性组分和粉状载体一起包封在明胶胶囊中，其中无活性组分和粉状载体可以是葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等。可以加入的、用来提供所需的颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散性或其它所需特性的其它非活性组分的实例，为氧化铁、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、可食性白墨(white ink)等。可以使用类似的稀释剂来制备压片。片剂和胶囊都可以制备成缓释产品以便在数小时内提供药物的连续释放。压片可以进行糖包衣或膜包衣以掩盖任何令人不愉快的味道并在空气环境中保护该片剂，或者进行肠溶包衣以便在胃肠道中选择性崩解。口服液体剂型可以含有着色剂和较味剂，以提高患者的顺应性。
但是，本发明的化合物优选非肠道(parentally)给药。本发明化合物的非肠道给药制剂必须灭菌。 灭菌可通过灭菌过滤膜的过滤来完成，可以在冻干和重新构建之前或之后。本发明化合物的非肠道给药途经与已知的方法相符，例如，静脉注射或者输液、腹膜内、肌肉内、动脉内或伤口内注射的途经。本发明的化合物可以通过输液或通过快速浓注连续给药。典型的静脉输液用组合物可以含有100至500ml的灭菌0.9％氯化钠或者5％葡萄糖，任选地添加20％的白蛋白溶液以及1mg至10g的本发明化合物，这要视本发明化合物的特定类型及其需要的给药方案而定。制备非肠道给药组合物的方法是本领域熟知的，并在多处有详细记载，例如，包括Remington′s PharmaceuticalScience(第15版，Mack Publishing，Easton，PA，1980)(为了各种目的将其整体引入作为参考)。
本发明还涉及上述化合物，其中特异物V被酶除去，所述酶通过抗体定向酶药物前体疗法(ADEPT)、通过聚合物导向的酶药物前体疗法(PDEPT)、病毒导向的酶药物前体疗法(VDEPT)或基因导向的酶疗法(GDEPT)，输运到靶细胞或靶组织附近(见美国专利4975278；Melton等，1996，J.Natl.Can.Inst.，88(3/4)：153-165)。
本发明通过如下实施例进一步解释。这些实施例只是为了举例说明并不是用来限制本发明的范围。
附图简介
图1显示了含间隔基的三段式(tripartate)药物前体向母体药物转变的路线图。
图2显示了含有加长的间隔基的药物前体的结构示意图。
图3显示了1，6-消去的原则。
图4显示了1，8-消去的原则。
图5显示了1，10-消去的原则。
图6显示了典型的含紫杉醇的化合物的合成，以证明1，8-消去的原则。
图7显示了在还原和1，8-消去之后，紫杉醇的释放机理。
图8显示了双Aloc-保护的D-Ala-Phe-Lys三肽的合成。
图9显示了1，8-消去间隔基-对氨基肉桂基醇(PACA)的合成。
图10显示了含有1，8-消去含间隔基药物前体的合成。
图11显示了含两个或多个电子级联间隔基的药物前体的结构示意图。
图12显示了对-硝基苯基(PNP)碳酸酯-激活的三肽-间隔基轭合物的合成。
图13显示了第二个电子级联间隔基分子(对-氨基苄基醇(PABA))与4-硝基苯基碳酸酯-激活的三肽-间隔基轭合物在羟基苯并三唑(HOBt)存在下的催化偶联。
图14显示了通过将第二个电子级联1，6-消去的间隔基分子与4-硝基苯基碳酸酯活化的三肽-1，6-消去间隔基轭合物在催化量的二苯基膦酸的存在下偶联，而在化学连接两个电子级联间隔基分子之间形成化学键的反应。
图15显示了含阿霉素和双1，6-消去间隔基的药物前体的合成。
图16显示了含紫杉醇和双1，6-消去间隔基的药物前体的合成。
图17显示了含色氨酸的三肽双间隔基轭合物的合成。
图18显示了含色氨酸的阿霉素药物前体的合成。
图19显示了含阿霉素和三1，6-消去的间隔基药物前体的合成。
图20显示了含有通过2′-氨基甲酸酯键与药物连接的一个电子级联间隔基和一个环合间隔基的紫杉醇药物前体的结构示意图。
图21显示了用4-硝基苯基氯甲酸酯在低温下进行的2′-(4-硝基苯基碳酸酯)活化的紫杉醇的区域选择性合成。
图22显示了酸保护的紫杉醇-ω-氨基氨基羰基环合间隔基轭合物的合成。
图23显示了酸保护的紫杉醇-ω-氨基氨基羰基环合间隔基轭合物与4-硝基苯基碳酸酯活化的三肽-1，6-消去间隔基轭合物的偶联。
图24显示了获得含有一个1，6-消去间隔基和一个ω-氨基氨基羰基环合间隔基的紫杉醇药物前体的脱保护反应。
图25显示了含有一个1，6-消去间隔基和一个ω-氨基氨基羰基环合间隔基的紫杉醇药物前体的制备。
图26显示了对-硝基苯基(PNP)碳酸酯-激活的双对硝基苄氧基羰基保护的三肽-间隔基轭合物的合成。
图27显示了含有一个1，8-消去间隔基和一个ω-氨基氨基羰基环合间隔基的紫杉醇药物前体的制备。
图28显示了已经报道的含有一个电子级联间隔基的阿霉素药物前体和紫杉醇药物前体的结构。
实施例
实施例1
合成2′-[4-硝基肉桂基碳酸酯]-紫杉醇1.
在氩气氛中，向200mg(1.12mmol，4.8当量)的4-硝基肉桂基醇在干燥的二氯甲烷/四氢呋喃中的溶液中，加入吡啶(94μl，5.0当量)和4-硝基苯基氯甲酸酯(236mg，5.0当量)。将所述反应混合物在室温下搅拌12小时。将此混合物冷却至0℃，并加入催化量的DMAP、几滴三乙胺和200mg紫杉醇(1.0当量)。将此反应混合物在室温下搅拌12小时。蒸发溶剂并将残余的固体溶解于二氯甲烷。将有机层用以下溶液彻底洗涤：饱和碳酸氢钠溶液、0.5N硫酸氢钾和盐水，并用无水硫酸钠干燥。溶剂蒸发后，将残余的黄色油状物通过柱色谱纯化(乙酸乙酯-己烷；1∶1)，得到144mg的1(58％)。M.P.151℃；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.17(s，3H，17)，1.22(s，3H，16)，1.70(s，3H，19)，1.96(s，3H，18)，2.22(s，3H，10-OAc)，2.46(s，3H，4-OAc)，2.55(m，1H，6a)，3.82(d，1H，J＝7.0Hz，3)，4.26(d，1H，J＝8.4Hz，20b)，4.32(d，1H，J＝8.4Hz，20a)，4.39(m，1H，7)，4.87(bt，2H，CH2-间隔基)，4.99(bd，1H，J＝7.9Hz，5)，5.46(d，1H，J＝2.8Hz，2′)，5.72(d，1H，J＝7.1Hz，2)，6.01(m，1H，3′)，6.26(bt，1H，13)，6.34(s，1H，10)，6.43(dt，1H，J＝16.0Hz，HC＝CH-CH2)，6.75(d，1H，J＝16.0Hz，HC＝CH-CH2)，7.35-7.67(m，13H，芳族)，7.75(d，2H，J＝7.2Hz，芳族)，8.15(d，2H，J＝7.2Hz，芳族)，8.19(d，2H，J＝8.7Hz，硝基苯基)ppm；MS(FAB)m/e 1059(M+H)+，1081(M+Na)+；元素分析(C57H58N2O18·2_H2O)理论值C 62.01％，H5.75％，N 2.54％，实测值C 62.06％，H 5.31％，N 2.60％。
实施例2
1，8-消去的原则：硝基肉桂基碳酸酯1的化学还原
将36mg的2′-[4-硝基肉桂基碳酸酯]-紫杉醇1溶解于8ml甲醇和2ml乙酸。加入催化量的锌粉并将所得红色混合物搅拌12小时。加入二氯甲烷并将有机层用以下溶液洗涤：饱和碳酸氢钠、0.5N硫酸氢钾、盐水和水，并用无水硫酸钠干燥。溶剂蒸发后，将残余的黄色薄膜通过柱色谱纯化(乙酸乙酯-己烷；2∶1)，得到28mg的紫杉醇(通过300MHz 1H-NMR证实)和4mg的未反应的起始化合物。当该化合物在不存在锌粉情况下在相同条件下搅拌时，没有紫杉醇形成，这表明硝基被锌还原导致了紫杉醇的释放。
实施例3
合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-OH 9
步骤a：合成Fmoc-Phe-Lys(Boc)-OBu 4
在氩气氛中在0℃下，向2.50g Fmoc-Phe-ONSu 2(ONSu＝N-羟基琥珀酰亚胺)(5.16mmol)的干燥二氯甲烷溶液中，加入0.791ml三乙胺(1.1eq.)和1.92g H-Lys(Boc)-OBu·HCl 3(1.1eq.)。将所述反应混合物在室温下搅拌5小时，然后加入二氯甲烷并将有机层用以下溶液洗涤：10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和水。将有机层用无水硫酸钠干燥并蒸发。所得白色固体4(3.08g，89％)不经进一步纯化直接使用。M.P.93℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.10-1.90(m，24H，6 CH2-Lys和18叔丁基)，3.06(m，2H，N-CH2-Lys和苄基)，4.19(t，1H，Fmoc)，4.25-4.55(m，4H，2 Fmoc和2 Hα)，7.19-7.78(m，13H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 672(M+H)+，694(M+Na)+；C39H49N3O7理论值C 69.72％，H 7.35％，N 6.25％，实测值C 69.69％，H 7.48％，N 6.22％。
步骤b：合成Boc-D-Ala-Phe-Lys(Boc)-OBu 7
将3.08g(4.58mmol)的Fmoc-Phe-Lys(Boc)-OBu 4溶解于100ml二噁烷/甲醇/2N氢氧化钠(70/25/5)中并在室温下搅拌约1小时。将此反应混合物用乙酸(0.571ml)中和并将有机溶剂蒸发。加入水和二噁烷并将此溶液冻干。将二异丙基醚加入到所得固体中。过滤后，蒸发滤液。将残余的产物5溶解于干燥的二氯甲烷中，并在℃下加入到1.19g(4.16mmol)Boc-D-Ala-ONSu 6和0.634ml(1.1eq.)三乙胺的干燥二氯甲烷溶液中。将此反应混合物搅拌过夜，之后加入二氯甲烷。将有机层用以下溶液洗涤：10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和水。将有机层用无水硫酸钠干燥并蒸发。产物通过柱色谱纯化(SiO2-CHCl3/MeOH 20/1)得到2.56g(4.13mmol，99％)的Boc-D-Ala-Phe-Lys(Boc)-OBu 7的白色泡沫。M.P.59℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.25(d，3H，CH3-Ala)，1.43(bs，27H，叔丁基)，1.00-1.90(m，6H，CH2-Lys)，2.80-3.30(m，4H，N-CH2-Lys和苄基)，4.15(m，1H，Hα)，4.35(m，1H，Hα)，4.64(bd，1H，Hα)，7.15-7.35(m，5H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 621(M+H)+，643(M+Na)+；C32H52N4O8(·1/2H2O)理论值C 61.03％，H 8.48％，N 8.90％，实测值C 61.15％，H8.44％，N 8.66％。
步骤c：合成D-Ala-Phe-Lys-OH 8.
将2.56g(4.13mmol)Boc-D-Ala-Phe-Lys(Boc)-OBu 7搅拌于HCl的EtOAc溶液(3M)中。5小时后蒸发溶剂，加入叔丁醇并蒸发两次以除去残余的盐酸。将所得产物于二噁烷/水的混合物中冻干得到奶油色粉末8，其不经进一步纯化直接使用。1H-NMR(300MHz，D2O)：δ0.94(d，3H，CH3-Ala)，1.10-1.85(m，6H，CH2-Lys)，2.75-2.84(m，3H，N-CH2-Lys和苄基)，3.09(dd，1H，苄基)，3.54(dd，1H，Hα)，3.98(dd，1H，Hα)，4.54(q，1H，Hα)，7.10-7.22(m，5H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e365(M+H)+。
步骤d：合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-OH 9
向706mg(1.61mmol)的D-Ala-Phe-Lys-OH 8的水/乙腈溶液中，加入三乙胺直到pH达到9-9.5。然后加入704mg(2.2eq.)Aloc-ONSu的乙腈溶液，并加入三乙胺保持此反应混合物为碱性。在此混合物的pH不再有任何改变后，加入0.5M的HCl溶液直到pH达到3。将此混合物用二氯甲烷彻底提取。将有机层用水洗涤并将此水层再次用二氯甲烷提取。将有机层用无水硫酸钠干燥并蒸发至干，得到所需的产物9，其为奶油色泡沫(742mg，86％)。M.P.141℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.10-1.95(m，6H，CH2-Lys)，1.21(d，3H，CH3-Ala)，2.90-3.30(m，4H，N-CH2-Lys和苄基)，4.20(m，1H，Hα)，4.55(m，5H，Hα和4 Aloc)，4.76(bd，1H，Hα)，5.17-5.31(m，4H，Aloc)，5.83-5.92(m，2H，Aloc)，7.20-7.28(m，5H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 533(M+H)+，555(M+Na)+；C26H36N4O8理论值C 58.63％，H 6.81％，N 10.52％，实测值C 58.54％，H 6.81％，N 10.28％。
实施例4
合成4-氨基肉桂基醇10
向1.5g(8.37mmol)的4-硝基肉桂基醇的THF/甲醇溶液(60mL，1∶1 v/v)中，加入催化量的Raney镍和肼的一水合物(1.22ml，25.1mmol)。将此混合物在室温下搅拌3小时，1.5小时后再次加入肼的一水合物(1.22ml)。将此反应混合物通过HFLO过滤，并在减压下浓缩至5ml。加入二氯甲烷(100ml)，并将所得溶液用水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到10(1.24g，8.31mmol，99％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.24(d，2H，J＝6.1Hz，CH2OH)，6.11-6.20(dt，1H，J＝6.1Hz，J＝15.8Hz，CH＝CH-CH2OH)，6.48(d，1H，J＝15.8Hz，CH＝CH-CH2)，6.62(d，2H，J＝11.1Hz，芳族)，7.19(d，2H，J＝11.0Hz，芳族)ppm；MS(EI)m/e 149(M)+。
实施例5
合成Fmoc-D-Ala-Phe-Lys(Fmoc)-PACA 11
向D-Ala-Phe-Lys-OH 8(3.20g，8.79mmol)在水和乙腈的7∶3混合物(300ml)中的溶液中，加入三乙胺直到pH达到8.5。加入Fmoc-Osu(5.93g，17.6mol)的乙腈(50ml)溶液。通过加入三乙胺将所得溶液的pH保持为8.5-9.0。当pH不再变化时，加入1N盐酸中和该溶液。将此溶液在减压下浓缩以除去乙腈。将所得水溶液用乙酸乙酯萃取4次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物用二异丙基醚彻底洗涤以除去极性污染物。得到5.54g(6.85mmol，78％)的粗品9b。
将9b(500mg，0.618mmol)的THF(50ml)溶液冷却至-40℃。然后，依次加入N-甲基吗啉(75μl，0.68mmol)和氯甲酸异丁基酯(89μl，0.68mmol)。将所得溶液在-40℃下干燥3.5小时。缓慢加入对氨基肉桂基醇(111mg，0.742mmol)的THF(20ml)溶液。将此反应混合物在-20℃下搅拌5小时，然后在减压下浓缩。所得粗品通过柱色谱纯化(SiO2-二氯甲烷/甲醇；93∶7)。得到516mg的化合物11(0.549mmol，89％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)δ1.17(d，3H，J＝6.8Hz，Ala的CH3)，1.20-2.00(m，6H，3×CH2-Lys)，2.89-3.26(m，4H，Lys的N-CH2和Phe的苄基)，3.88-4.58(m，11H，Fmoc的CH2和CH及间隔基的CH2及3×Hα)，6.21(dt，1H，J＝15.9Hz，J＝5.8Hz，CH＝CH-CH2)，6.48(d，1H，J＝15.7Hz，CH＝CH-CH2)，7.15-7.43(m，17H，芳族)，7.52-7.57(m，2H，芳族)，7.67(d，1H，J＝7.4Hz，芳族)，7.71(d，1H，J＝7.4Hz，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 940(M+H)+。
实施例6
合成Fmoc-D-Ala-Phe-Lys(Fmoc)-PACA-PNP 12
在0℃下，向化合物11(800mg，0.851mmol)的THF(15ml)溶液中，加入DIPEA(594μl，3.40mmol)、对硝基苯基氯甲酸酯(515mg，2.55mmol)和吡啶(17.3μl，0.213mmol)。将此反应混合物在室温下搅拌2小时，之后加入二氯甲烷(50ml)和水(50ml)。分离水层和有机层并用二氯甲烷萃取(3×100ml)。将合并的有机层用水、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤并在减压下浓缩。将残余物用二氯甲烷和乙醚1∶2的混合物洗涤。得到化合物12(812mg，0.734mmol，86％)。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.95(d，3H，J＝7.8Hz，Ala的CH3)，1.05-1.90(m，6H，Lys的3×CH2)，2.90(dd，1H，J＝11.4Hz，J＝15.0Hz，Phe的CH2)，3.11(m，2H，Lys的N-CH2)，3.26(m，1H，Phe的CH2)，4.24-4.89(m，9H，Fmoc的CH2和CH及3×Hα)，5.24(d，2H，J＝6.6Hz，CH＝CH-CH2)，6.81(dt，1H，J＝17.4Hz，J＝7.0Hz，CH＝CH-CH2)，7.23(d，1H，J＝17.4Hz，CH＝CH-CH2)，7.66-8.25(m，23H，芳族)，8.44-8.48(m，4H，芳族)，8.97(d，2H，J＝10.1Hz，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 1105(M+H)+。
实施例7
合成Fmoc-D-Ala-Phe-Lys(Fmoc)-PACA-DOX 13
向化合物12(100mg，90.5μmol)的N-甲基吡咯烷酮(2ml)溶液中加入三乙胺(13.2μl，95.0μmol)和盐酸阿霉素(55.1mg，95.0μmol)。将此反应混合物在室温下搅拌15小时，然后倒入到10％异丙醇的乙酸乙酯溶液(25ml)中。将所得溶液用水洗涤，用二氯甲烷(50ml)稀释，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得粗品通过柱色谱(SiO2-二氯甲烷/甲醇，93/7)，并随后用乙醚沉淀，得到化合物13(82.3mg，54.5μmol，60％)。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.98(d，3H，J＝6.8Hz，Ala的CH3)，1.12(d，3H，J＝6.7Hz，5′-Me)，1.24-2.25(m，8H，Lys和2′和8位的3×CH2)，2.79(m，1H，Phe的CH2)，2.97(m，4H，Lys和10位的N-CH2)，3.11(m，1H，Phe的CH2)，3.47(m，1H，4′)，3.74(m，1H，3′)，3.97(s，3H，OCH3)，3.97-4.37 & 4.54-4.60 & 4.72 & 4.85 & 4.97 & 5.24 & 5.47(14H，Fmoc和CH＝CH-CH2和1′和5′和7和14的CH2和CH，和OH)，6.20(m，1H，CH＝CH-CH2)，6.55(d，1H，J＝16.2Hz，CH＝CH-CH2)，7.14-7.93(m，32H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 1533(M+Na)+。
实施例8
合成D-Ala-Phe-Lys-PACA-DOX(·2HCl)14
向搅拌的化合物50(40.0mg，26.5μmol)的DMF(2ml)溶液中，加入哌啶(128μl，1.30mmol)。10分钟后，将此反应混合物缓慢加入到搅拌的冰冷却的乙醚溶液中。离心收集沉淀，用乙醚洗涤，并溶解于乙酸乙酯中。加入约0.5M的HCl的乙酸乙酯溶液(200μl)，并离心收集形成的沉淀。将残余物溶解于叔丁醇和氯仿的2∶1的混合物中，并将所得溶液在减压下浓缩。将此步骤重复两次，得到化合物51(29.4mg，25.8μmol，97％)，冻干后为橙色色固体。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.22(d，3H，5′-Me)，1.29(d，3H，Ala的CH3)，1.30-2.00(m，8H，Lys和2′的3×CH2)，2.17(br.d，1H，8)，2.39(br.d，1H，8)，2.93-3.35(m，7H，Phe的CH2及Lys和10和4′的N-CH2)，3.63(m，1H，3′)，3.85-4.20(m，3H，5′和2×Hα)，4.07(s，3H，OCH3)，4.50-4.78(m，5H，Hα和14和CH＝CH-CH2)，5.25(m，1H，1′)，5.48(m，1H，7)，6.15(m，1H，CH＝CH-CH2)，6.56(d，1H，J＝14.6Hz，CH＝CH-CH2)，7.23-7.56(m，10H，芳族和3)，7.82(t，1H，J＝8.0Hz，2)，8.01(m，1H，1)ppm；MS(FAB)m/e 1065(M+H)+。
实施例9
合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABA 15
在氩气氛中将730mg(1.37mmol)的被保护的三肽Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-OH 9溶液溶解于干燥的THF中，并冷却至-40℃。加入NMM(166μl，1.1eq.)和氯甲酸异丁基酯(196μl，1.1eq.)。将此反应混合物在低于-30℃温度下搅拌3小时。向此反应混合物中滴加4-氨基苄基醇(203mg，1.2eq.)和NMM(181μl，1.2eq.)的干燥THF溶液。2小时后，蒸发THF并加入二氯甲烷。将有机层用以下溶液洗涤：饱和碳酸氢钠、0.5N硫酸氢钾溶液和盐水，用无水硫酸钠干燥并蒸发。将残余的淡黄色固体通过柱色谱纯化(SiO2-CHCl3/MeOH 9/1)得到812mg(93％)的所需产物15的奶油色粉末。
M.P.156℃；1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)：δ0.96(d，3H，CH3-Ala)，1.10-1.85(m，6H，CH2-Lys)，2.77(dd，1H，苄基Phe)，2.97(bd，2H，N-CH2-Lys)，3.09(dd，1H，苄基Phe)，4.00(t，1H，Hα)，4.20-4.60(m，8H，2 Hα和4 Aloc和CH2-OH)，5.00-5.35(m，4H，Aloc)，5.76-5.95(m，2H，Aloc)，7.05-7.30(m，7H，芳族)，7.41(d，1H，NH)，7.56(d，2H，芳族)，8.12(d，1H，NH)，8.18(d，1H，NH)，9.80(s，1H，NH苯胺)ppm；MS(FAB)m/e 638(M+H)+，660(M+Na)+；C33H43N5O8(·1/2 H2O)理论值C 61.29％，H 6.86％，N 10.83％，实测值C 61.39％，H 6.54％，N 10.55％。
实施例10
合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PNP 16
在氩气氛中，向384mg(0.602mmol)的化合物15的干燥THF/CH2Cl2溶液中，加入4-硝基苯基氯甲酸酯(182mg，1.5eq.)和干燥的吡啶(73μl，1.5eq.)。将此反应混合物在室温下搅拌48小时，然后加入EtOAc。将有机层用以下溶液洗涤：10％柠檬酸、盐水和水，用无水硫酸钠干燥，并蒸发得到黄色固体。产物通过柱色谱纯化(SiO2-CH2Cl2/MeOH 30/1)得到324mg(67％)的碳酸酯16。1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.21(d，3H，CH3-Ala)，1.25-2.05(m，6H，CH2-Lys)，2.95(dd，1H，苄基Phe)，3.13(bt，2H，N-CH2-Lys)，3.27(dd，1H，苄基Phe)，4.08(dd，1H，Hα)，4.25(dd，1H，Hα)，4.30-4.65(m，5H，Hα和4 Aloc)，5.04-5.35(m，4H，Aloc)，5.26(s，2H，CH2-OH)，5.65-6.00(m，2H，Aloc)，7.10-7.35(m，5H，芳族)，7.39-7.43(2*d，4H，芳族)，7.71(d，2H，芳族)，8.28(d，2H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e803(M+H)+，825(M+Na)+。
实施例11
合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PABA 17
在氩气氛中，向156mg(194μmol)的化合物16和26.3mg(1.1eq.)PABA的干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入二异丙基乙基胺(34μl，1.0eq.)和催化量的N-羟基苯并三唑(7.9mg，0.3eq.)。将所述反应溶液搅拌24小时，之后将其用10％丙醇-2/EtOAc稀释。将有机层用以下溶液洗涤：饱和碳酸氢钠、0.5N硫酸氢钾和盐水，用无水硫酸钠干燥并蒸发至干。将黄色残余薄膜通过柱色谱纯化(SiO2-CHCl3/MeOH 9/1)得到148mg(97％)的所需产物17。M.P.196-197℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.20(d，3H，3J＝6.4Hz，CH3-Ala)，1.27-2.05(m，6H，3 CH2-Lys)，2.99(dd，1H，苄基)，3.14(m，2H，N-CH2-Lys)，3.27(dd，1H，苄基)，4.00-4.64(m，7H，3 Hα和Aloc)，4.57(s，2H，苄基-间隔基)，5.14(s，2H，苄基-间隔基)，5.06-5.37(m，4H，Aloc)，5.72(m，1H，Aloc)，5.88(m，1H，Aloc)，7.10-7.46(m，11H，芳族)，7.64(d，2H，3J＝8.3Hz，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 809(M+Na)+；；C41H50N6O10(·1/2 H2O)理论值C 61.87％，H 6.46％，N 10.56％，实测值C 61.84％，H 6.38％，N 10.38％。
实施例12
合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PABC-PNP 18
将80.2mg(102μmol)的化合物17、吡啶(25μl，3.0eq.)和4-硝基苯基氯甲酸酯(44.3mg，220μmol)的干燥的四氢呋喃/二氯甲烷溶液在氩气氛中在0℃下搅拌2小时，并在室温下搅拌过夜。 将此溶液真空蒸发并将残余的产物溶解于二氯甲烷。将有机层用盐水和0.5N硫酸氢钾洗涤后，将此有机层用无水硫酸钠干燥，并浓缩至干。将所得粗产物通过柱色谱(SiO2-CHCl3/MeOH 20/1)得到61.9mg(84％)的化合物18。M.P.69-70℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.23(d，3H，3J＝7.0Hz，CH3-Ala)，1.10-2.08(m，6H，3 CH2-Lys)，3.04(m，1H，苄基)，3.13(m，2H，N-CH2-Lys)，3.27(bd，1H，苄基)，4.06(m，1H，Hα)，4.26(m，1H，Hα)，4.35-4.70(m，5H，Hα和Aloc)，5.04-5.47(m，4H，Aloc)，5.14(s，2H，苄基-间隔基)，5.24(s，2H，苄基-间隔基)，5.72(m，1H，Aloc)，5.90(m，1H，Aloc)，7.10-7.46(m，13H，芳族)，7.65(d，2H，J＝8.3Hz，芳族)，8.27(d，2H，3J＝9.1Hz，芳族-PNP)ppm；MS(FAB)m/e 952(M+H)+，974(M+Na)+；C40H46N6O12(·1/4 H2O)理论值C 59.51％，H 5.81％，N10.41％，实测值C 59.52％，H 5.54％，N 10.12％。
实施例13
合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PABC-DOX 19
将溶于N-甲基吡咯烷酮中的含双间隔基的4-硝基苯基碳酸酯18(140mg，0.147mmol)和阿霉素-HCl(94.1mg，1.1eq.)在室温下用三乙胺(22.5μl，1.1eq.)处理。所述反应混合物在暗处搅拌72小时，再加入三乙胺(1.1eq.)，再过24小时后，将此反应混合物用10％2-丙醇/乙酸乙酯稀释。将有机层用水和盐水洗涤并干燥(硫酸钠)。溶剂蒸发后，粗产物通过柱色谱纯化(氯仿-甲醇；9∶1)，接着以2mm硅胶板用chromatotron进行环形色谱(氯仿-甲醇；9∶1)，得到72mg(36％)的被保护的药物前体19。M.P.129℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.22(d，3H，J＝7.1Hz，糖CH3)，1.27(d，3H，J＝6.7Hz，CH3-Ala)，1.25-2.00(m，8H，CH2-Lys和2′)，2.15(dd，1H，8)，2.36(bd，1H，8)，3.04(bd，1H，J＝18.7Hz，10)，2.90-3.50(m，5H，苄基Phe和N-CH2-Lys和10)，3.37(bs，1H，4′)，3.58(m，1H，3′)，3.85(m，1H，Hα)，4.08(s，3H，OMe)，4.14(m，1H，Hα)，4.29(dd，1H，5′)，4.37-4.68(m，5H，Hα和4Aloc)，4.76(s，2H，14)，4.96(s，2H，苄基间隔基)，5.11(s，2H，苄基间隔基)，5.02-5.40(m，4H，Aloc)，5.48(bs，1H，1′)，5.61-6.00(m，3H，Aloc和7)，7.08-7.39(m，9H，芳族5H Phe和4H间隔基s)，7.33(d，2H，J＝8.3Hz，2H芳族间隔基)，7.42(d，1H，J＝8.4Hz，3)，7.62(d，2H，J＝8.0Hz，2H芳族间隔基)，7.80(t，1H，J＝8.1Hz，2)，8.03(d，1H，J＝7.5Hz，1)ppm；MS(FAB)m/e 1378(M+Na)+；元素分析(C69H77N7O22·2H2O)理论值C 59.52％，H 5.86％，N 7.04％，实测值C 59.34％，H 5.71％，N6.66％。
实施例14
合成H-D-Ala-Phe-Lys-PABC-PABC-DOX·5.7HCl20
在氩气氛中，向48mg(0.035mmol)的被保护的药物前体19的干燥的四氢呋喃/二氯甲烷溶液中，加入吗啉(31μl，10eq.)以及催化量的Pd(PPh3)4。将此反应混合物在暗处搅拌1小时。通过离心收集红色沉淀。加入乙酸乙酯并用1.0ml 0.5M的盐酸/乙酸乙酯来酸化此混合物。通过离心收集沉淀并用乙酸乙酯洗涤多次。加入叔丁醇并蒸发，将所得红色薄膜在水中冻干得到37mg(83％)的药物前体20。
Mp＞300℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.20(d，3H，J＝7.0Hz，糖CH3)，1.27(d，3H，J＝6.5Hz，CH3-Ala)，1.38-2.05(m，8H，CH2-Lys和2′)，2.18(dd，1H，8)，2.36(bd，1H，8)，2.82-3.41(m，6H，苄基Phe和N-CH2-Lys和10)，3.37(s，1H，4′)，3.60(bs，1H，3′)，4.02(m，1H，Hα)，4.08(s，3H，OMe)，4.18(m，1H，Hα)，4.53(dd，1H，5′)，4.66(dd，1H，Hα)，4.77(s，2H，14)，4.95(bs，2H，苄基间隔基)，5.14(s，2H，苄基间隔基)，5.27(bs，1H，1′)，5.48(bs，1H，7)，7.09-7.50(m，11H，芳族5H Phe和6H间隔基和3)，7.58(d，2H，J＝8.4Hz，2H芳族间隔基)，7.82(t，1H，J＝8.0Hz，2)，8.03(d，1H，J＝7.6Hz，1)ppm；MS(FAB)m/e 1188(M+H)+，m/e 1210(M+Na)+；元素分析(duplo)(C61H69N7O18·5.7HCl)理论值C52.42％，H 5.39％，N 7.01％，实测值C 52.38％，H 5.71％，N 7.14％。
实施例15
合成2′-[Aloc-D-A1a-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PABC]-紫杉醇21
在氩气氛中，将干燥的四氢呋喃/二氯甲烷中的4-硝基苯基碳酸酯18(47.4mg，49.8μmol)和紫杉醇(42.3mg，1.0eq.)在室温下用N，N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)(6.7mg，1.1eq.)处理。所述反应混合物在暗处搅拌48小时，然后浓缩至干。将产物溶解于二氯甲烷并将有机层用以下溶液洗涤：饱和碳酸氢钠、0.5N硫酸氢钾和盐水，并用无水硫酸钠干燥。溶剂蒸发后，将残余的黄色薄膜通过柱色谱纯化(SiO2-EtOAc/Hex/MeOH 5/5/1)，得到67.5mg(82％)的所需的被保护的紫杉醇药物前体21。M.P.137-138℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.14(s，3H，17)，1.23(s，3H，16)，1.27(d，3H，J＝7.1Hz，CH3-Ala)，1.05-2.10(m，6H，CH2-Lys)，1.67(s，3H，19)，1.89(s，3H，18)，2.22(s，3H，10-OAc)，2.44(s，3H，4-OAc)，2.97(m，1H，苄基)，3.14(m，2H，N-CH2-Lys)，3.21(m，1H，苄基)，3.81(d，1H，3J＝7.0Hz，3)，4.03(m，1H，Hα)，4.20(d，1H，2J＝8.4Hz，20b)，4.31(d，1H，2J＝8.4Hz，20a)，4.43(m，1H，7)，4.34-4.74(m，6H，Hα和Aloc)，4.90-5.37(m，11H，2 Hα，Aloc，5和2苄基-间隔基)，5.44(d，1H，3J＝2.9Hz，2′)，5.63(m，1H，Aloc)，5.69(d，1H，3J＝7.1Hz，2)，5.87(m，1H，Aloc)，5.97(bd，1H，3J＝2.9Hz，3J＝9.2Hz，3′)，6.26(m，1H，13)，6.29(m，1H，10)，7.05-7.80(m，26H，芳族)，8.14(d，2H，3J＝7.2Hz，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 1668(M+H)+，1689(M+Na)+；C89H99N7O25(·2H2O)理论值C 62.78％，H 6.10％，N 5.76％，实测值C62.55％，H 5.82％，N 5.57％。
实施例16
合成2′-[H-D-Ala-Phe-Lys-PABC-PABC]-紫杉醇(·2HCl)22.
在氩气氛中向51.4mg(30.8μmol)的被保护的药物前体2l的干燥四氢呋喃溶液中，加入冰醋酸(8.9μl，5eq.)以及三丁基氢化锡(24.6μl，3eq)和催化量的Pd(PPh3)4。30分钟后，向此反应混合物中小心地加入1ml 0.5M HCl/EtOAc。加入乙醚沉淀产物，并通过离心收集白色沉淀，用乙醚洗涤多次。加入叔丁醇并再次蒸发以除去过量的HCl，将所得产物溶解于水并冻干，得到46.9mg(100％)的所需药物前体22。M.P.＞192℃(dec.)；1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.15(s，3H，17)，1.21(s，3H，16)，1.10-2.00(m，9H，CH2-Lys和CH3-Ala)，1.67(s，3H，19)，1.90(s，3H，18)，2.20(s，3H，10-OAc)，2.43(s，3H，4-OAc)，2.85(m，4H，苄基和N-CH2-Lys)，3.80(d，1H，3J＝6.9Hz，3)，4.24(d，1H，2J＝8.4Hz，20b)，4.31(d，1H，2J＝8.4Hz，20a)，4.39(dd，1H，7)，4.56(m，1H，Hα)，5.68(m，1H，Hα)，4.98(d，1H，5)，5.08(m，4H，2苄基-间隔基)，5.43(d，1H，3J＝2.7Hz，2′)，5.70(d，1H，3J＝7.0Hz，2)，5.97(m，1H，3′)，6.22(m，1H，13)，6.32(m，1H，10)，7.05-7.68(m，24H，芳族)，7.71(d，1H，3J＝7.2Hz，芳族)，8.14(d，2H，3J＝7.3Hz，芳族)ppm；MS(FAB)m/e1499(M+H)+，1521(M+Na)+；C81H91N7O21(·3.7HCl)理论值C 59.60％，H 5.85％，N 6.01％，实测值C 59.60％，H 5.88％，N 5.98％。
实施例17
合成Fmoc-Trp-Lys(Boc)-OBu 24
在氩气氛中在0℃下，向3.00g(5.73mmol)的Fmoc-Trp-ONSu 23的干燥二氯甲烷溶液中，加入0.791ml(1.00当量)的三乙胺和2.12g(1.10当量)的H-Lys(Boc)-OBu·HCl。将此混合物在室温下搅拌5小时，然后加入二氯甲烷并将有机层用以下溶液洗涤：10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和水，用硫酸钠干燥并蒸发。所得白色固体24(3.52g，86％)不经进一步纯化直接使用。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.10-1.92(m，24H，3 CH2-Lys和18 t-Bu)，2.80-3.20(m，3H，N-CH2-Lys和CH2-Trp)，3.52(d，1H，CH2-Trp)，4.19(t，1H，Fmoc)，4.29-4.82(m，5H，2 Fmoc，2 Hα和NH)，6.54(d，H，芳基)，7.06-7.76(m，12H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e1444(2M+Na)；元素分析(C41H50N4O7·4H2O)的C、H、N理论值为：C 62.90％，H 6.30％，N 7.15％，实测值：C 63.22％，H 6.49％，N7.13％。
实施例l8
合成Boc-D-Ala-Trp-Lys(Boc)-OBu 26
将3.52g(4.95mmol)的Fmoc-Trp-Lys(Boc)-OBu 24溶解于100ml二噁烷/甲醇/2N氢氧化钠(70/25/5)中并在室温下搅拌1小时。混合物用乙酸(0.570ml)中和并将有机溶剂蒸发。加入水和二噁烷并将此溶液冻干。加入二异丙基醚，过滤后蒸发滤液。产物溶解于干燥的二氯甲烷中并在0℃下加入到1.41g(4.93mmol)的Boc-D-Ala-ONSu 6和0.756ml(1.10当量)的三乙胺的干燥二氯甲烷溶液中。将此混合物搅拌16小时，之后加入二氯甲烷。将有机层用以下溶液洗涤：10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和水，然后用硫酸钠干燥并蒸发。产物通过柱色谱纯化((SiO2-首先乙酸乙酯/庚烷1/1，然后CHCl3/MeOH；9/1)得到2.26g(3.42mmol，69％)的三肽26，其为白色泡沫。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.99-1.90(m，36H，3 CH2-Lys，CH3-Ala和3 t-Bu)，2.80-3.50(m，4H，N-CH2-Lys和2 CH2-Trp)，3.99(m，1H，Hα)，4.33(m，1H，Hα)，4.77(br d，1H，Hα)，6.90-7.65(m，5H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 660(M+H)+，682(M+Na)+；元素分析(C34H53N5O8·H2O)的C、H、N理论值为：C 60.25％，H 8.17％，N 10.33％，实测值：C 60.47％，H8.08％，N 9.73％。
实施例19
合成Aloc-D-Ala-Trp-Lys(Aloc)-OH 28
将2.56g(4.13mmol)的Boc-D-Ala-Trp-Lys(Boc)-OBu(26)在盐酸的乙酸乙酯(3M)溶液中搅拌。5小时后，蒸发溶剂，加入叔丁醇并蒸发两次以除去残余的盐酸。在二噁烷/水中将产物冻干，得到棕色粉末。向706mg(1.61mmol)的D-Ala-Phe-Lys-OH 27的水/乙腈溶液中，加入三乙胺直到pH达到9-9.5。然后加入1.58g(2.20当量)的Aloc-ONSu的乙腈溶液，并通过加入三乙胺保持混合物的碱性。在混合物的pH不再改变后，加入0.5M盐酸的乙酸乙酯溶液直到pH达到3。将此混合物用二氯甲烷彻底提取。将有机层用水洗涤，干燥(硫酸钠)并蒸发。奶油色产物28不经进一步纯化直接使用。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.00-1.80(m，9H，3 CH2-Lys和CH3-Ala)，2.80-3.35(m，4H，N-CH2-Lys和CH2Trp)，4.13(m，1H，Hα)，4.14(m，1H，Hα)，4.30-4.95(m，6H，4 Aloc和2 Hα)，5.01-5.40(m，5H，4 Aloc和Hα)，5.70-6.30(m，3H，2 Aloc和NH)，6.90-7.70(m，5H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e 572(M+H)+，594(M+Na)+；元素分析(C28H37N5O8·1_H2O)理论值C 56.18％，H 6.44％，N 11.70％，实测值C 56.07％，H 6.22％，N 11.21％。
实施例20
合成Aloc-D-Ala-Tm-Lys(Aloc)-PABA 29
在氩气氛中将239mg(0.419mmol)的Aloc-D-Ala-Trp-Lys(Aloc)-OH28溶解于干燥的四氢呋喃中形成溶液，并冷却至-40℃。加入N-甲基吗啉(48.3μl，1.05当量)和异丁基氯甲酸酯(57.0μl，1.05当量)。将此反应混合物在低于-30℃的温度下搅拌2小时。向此反应混合物中滴加4-氨基苄基醇(51.5mg，1.00当量)和N-甲基吗啉(50.6μl，1.1当量)的干燥THF溶液。2小时后，蒸发四氢呋喃并加入二氯甲烷。将有机层用以下溶液洗涤：饱和碳酸氢钠、0.5N硫酸氢钾溶液和盐水，干燥(硫酸钠)并蒸发得到265mg(94％)的所需产物29的奶油色粉末。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.00-1.62(m，9H，CH3-Ala和3CH2-Lys)，2.90-3.70(m，4H，N-CH2-Lys和CH2-Trp)，4.48-4.92(m，7H，2Hα和4 Aloc)，4.72(s，2H，CH2-OH)，5.00-5.50(m，5H，4 Aloc和Hα)，5.35-6.05(m，2H，Aloc)，6.80-7.83(m，9H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e677(M+H)+，699(M+Na)+。
实施例21
合成Aloc-D-Ala-Trp-Lys(Aloc)-PABC-PNP
向384mg(0.602mmol)的Aloc-D-Ala-Trp-Lys(Aloc)-PABA 29的干燥的四氢呋喃/二氯甲烷溶液中，在氩气氛中，加入4-硝基苯基氯甲酸酯(182mg，1.50当量)和干燥的吡啶(73μl，1.50当量)。将此混合物在室温下搅拌48小时和然后加入乙酸乙酯。将有机层用以下溶液洗涤：10％柠檬酸、盐水和水，干燥(硫酸钠)并蒸发得到黄色固体。产物通过柱色谱纯化(SiO2-CHCl3/MeOH；30/1)得到324mg(67％)的碳酸酯Aloc-D-Ala-Trp-Lys(Aloc)-PABC-PNP，其为奶油色粉末。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.00-2.10(m，9H，CH3-Ala和3CH2-Lys)，2.90-3.70(m，4H，N-CH2-Lys和CH2-Trp)，3.64(m，1H，Hα)，3.81(m，1H，Hα)，4.38-4.81(m，5H，Hα和4 Aloc)，5.10-5.35(m，4H，Aloc)，5.21(s，2H，CH2-OH)，5.40-6.00(m，2H，Aloc)，7.00-7.85(m，11H，芳族)，8.25(d，2H，J＝8.1，芳族)；MS(FAB)m/e 842(M+H)+，864(M+Na)+。
实施例22
合成Aloc-D-Ala-Trp-Lys(Aloc)-PABC-PABA 30
向219mg(260μmol)的Aloc-D-Ala-Trp-Lys(Aloc)-PABC-PNP和35.2mg(1.1当量)4-氨基苄基醇的干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，在氩气氛中加入二异丙基乙基胺(45.3μl，1.00当量)和催化量的N-羟基苯并三唑(10.5mg，0.30当量)。将所述反应溶液搅拌48小时，之后将其用10％丙醇-2/EtOAc稀释。将有机层用以下溶液洗涤：饱和碳酸氢钠，0.5N硫酸氢钾和盐水，然后用无水硫酸钠干燥并蒸发至干。将淡黄色的残余薄膜通过柱色谱纯化(SiO2-CHCl3/MeOH 15/1)得到192mg(89％)的所需产物30。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.90-2.10(m，9H，CH3-Ala和3 CH2-Lys)，2.90-3.70(m，4H，N-CH2-Lys和CH2-Trp)，4.08(m，H，Hα)，4.40-4.86(m，6H，2苄基-间隔基和4Aloc)，4.90-5.40(m，7H，2苄基-间隔基Hα和Aloc)，5.50(m，1H，Aloc)，5.92(m，1H，Aloc)，6.72-7.82(m，13H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e848(M+Na)+；(C43H51N7O10·2/4H2O)理论值C 58.99％，H 6.50％，N11.20％，实测值C 59.15％，H 6.25％，N 11.15％。
实施例23
合成Aloc-D-Ala-Trp-Lys(Aloc)-PABC-PABC-PNP 31
将70mg(85μmol)的化合物30、吡啶(17μl，2.5当量)和4-硝基苯基氯甲酸酯(34mg，2.0当量)的溶液在氩气氛中在0℃下搅拌2小时，并在室温下搅拌24小时。将此溶液真空蒸发并将残余的产物溶解于氯仿。将有机层用盐水和0.5N硫酸氢钾洗涤后，将此有机层用无水硫酸钠干燥并浓缩至干。对所得粗产物进行柱色谱(SiO2-CHCl3/MeOH 20/1)得到54mg(64％)的化合物31，其为淡黄色固体。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ0.90-2.10(m，9H，CH3-Ala和3CH2-Lys)，2.90-3.10(m，4H，N-CH2-Lys和CH2-Trp)，3.27(bd，1H，苄基)，4.35-4.78(m，6H，2Hα和Aloc)，4.90-5.52(m，4H，Aloc)，5.13(s，2H，苄基-间隔基)，5.60(m，1H，Aloc)，5.94(m，1H，Aloc)，7.10-7.46(m，15H，芳族)，8.36(d，2H，芳族-PNP)ppm；MS(FAB)m/e 991(M+H)+，1013(M+Na)+；C50H54N8O14·3/4 H2O)理论值C 59.78％，H 5.57％，N11.15％，实测值C 60.12％，H 5.89％，N 10.76％。
实施例24
合成Aloc-D-Ala-Trp-Lys(Aloc)-PABC-PABC-DOX 32
将含双间隔基的4-硝基苯基碳酸酯31(41mg，0.041mmol)和阿霉素-HCl(26mg，1.1当量)在N-甲基吡咯烷酮中的溶液，在室温下用三乙胺(6.3μl，1.1当量)处理。所述反应混合物在暗处搅拌48小时，再加入三乙胺(1.1当量)，再过24小时将此反应混合物用10％2-丙醇/乙酸乙酯稀释。将有机层用水和盐水洗涤，并干燥(硫酸钠)。溶剂蒸发后，粗产物通过柱色谱纯化(SiO2-CHCl3/MeOH；9/1)接着以2mm硅胶板用chromtotron进行环形色谱(氯仿-甲醇；9/1)，得到45mg(78％)的被保护的药物前体32。1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ0.92-1.52(m，13H，糖CH3，CH3-Ala，3 CH2-Lys和2′)，2.15(dd，1H，8)，2.36(bd，1H，8)，3.18(bd，1H，10)，2.90-3.10(m，5H，N-CH2-Lys和CH2-Trp和10)，3.59(bs，1H，4′)，3.82(m，1H，3′)，3.85(m，1H，Hα)，4.11(s，3H，OMe)，4.21(m，1H，Hα)，4.45(dd，1H，5′)，4.30-4.62(m，5H，Hα和4 Aloc)，4.76(s，2H，14)，4.96(s，2H，苄基间隔基)，5.11(s，2H，苄基间隔基)，5.513-5.4(m，2H，Aloc)，5.48(bs，1H，1′)，5.58(m，2H，Aloc和7)，5.91(m，2H，Aloc)，6.70-7.39(m，11H，芳族5Trp和6间隔基)，7.41(d，1H，J＝8.4Hz，3)，7.63(d，2H，芳族间隔基)，7.78(t，1H，2)，8.03(d，1H，J＝7.6Hz，1)ppm；MS(FAB)m/e1417(M+Na)+。
实施例25
合成D-Ala-Trp-Lys-PABC-PABC-DOX(·7_HCl)33
在氩气氛中向36mg(0.026mmo1)的被保护的药物前体32的干燥的THF/二氯甲烷溶液中，加入吗啉(22μl，10当量)以及催化量的Pd(PPh3)4。将此反应混合物在暗处搅拌1小时。通过离心收集红色沉淀。加入乙酸乙酯，并用0.5ml 1M盐酸/乙酸乙酯酸化此混合物。通过离心收集沉淀，并用乙酸乙酯洗涤沉淀几次。加入叔丁醇并蒸发，将所得红色薄膜在水中冻干得到28mg(72％)的阿霉素药物前体33。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.10-1.96(m，13H，CH3-Ala，CH3-糖，3 CH2-Lys和2′)，2.09(m，1H，8)，2.35(bd，1H，J＝15.1Hz，8)，2.79-3.39(m，3H，N-CH2-Lys，CH2-Trp和10)，3.60(s，1H，4′)，4.00(bs，1H，3′)，4.09(s，3H，OMe)，4.54(m，1H，5′)，4.77(s，2H，14)，4.97(2*d，2H，Bn间隔基)，5.13(s，CH2，Bn间隔基)，5.28(bs，1H，1′)，5.48(bs，1H，7)，6.99-7.72(m，12H，5 Trp和6间隔基)，7.62(d，1H，7.6Hz，3)，7.55(d，2H，J＝8.2Hz，芳族间隔基)，7.83(t，1H，2)，8.05(d，1H，J＝7.7Hz，1)ppm；MS(FAB)m/e 1228(M+H)；元素分析(C63H70N8O18·71/2HCl)理论值C 50.42％，H 5.21％，N 7.47％，实测值C 50.56％，H 5.48％，N 7.35％。
实施例26
合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PABC-PABA 34
在氩气氛中，将100mg(0.105mmol)的Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PABC-PNP 18溶解于干燥的N，N-二甲基甲酰胺中并冷却至-8℃。加入4-氨基苄基醇(14.2mg，1.1当量)、DIPEA(18.3μl，1.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(4mg，0.3当量)。将此反应混合物在室温下搅拌48小时，并用10％2-丙醇/乙酸乙酯稀释。将有机层用以下溶液洗涤：水、饱和碳酸氢钠、0.5 N硫酸氢钾和盐水，用硫酸钠干燥(硫酸钠)，蒸发得到所需产物34的奶油色粉末86mg(88％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.95-2.05(m，9H，3CH2-Lys和CH3-Ala)，2.88-3.11(m，4H，2H Bn-Phe和N-CH2-Lys)，3.95-4.62(m，7H，3Hα和4H Aloc)，4.75(s，2H，CH2-OH)，5.12-5.21(m，6H，4 Aloc和CH2-Bn)，5.09(s，2H，CH2-Bn)，5.65-6.00(m，2H，Aloc)，6.79-7.41(m，15H，芳族)，7.62(d，2H，芳族)ppm；MS(FAB)m/e959(M+Na)+。
实施例27
合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PABC-PAFBC-PNP 35
向59mg(0.063mmol)Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PABC-PABA34的干燥的四氢呋喃和二氯甲烷溶液中，在氩气氛中-40℃下，分别加入吡啶(13μl，2.5当量)和4-硝基苯基氯甲酸酯(25mg，2.0当量)。在-40℃下搅拌4.5小时，并在6℃下搅拌过夜后，再次加入吡啶(10μl，2.0当量)和4-硝基苯基氯甲酸酯(25mg，2.0当量)。在6℃下搅拌48小时后再次加入。48小时后，将此溶液真空蒸发，并将残余的产物溶解于氯仿。将有机层用以下溶液洗涤：10％柠檬酸、盐水和水，用硫酸钠干燥(硫酸钠)，并蒸发得到黄色固体。所得粗产物通过柱色谱纯化(SiO2-CHCl3/MeOH；15/1)定量地得到所需的产物35。1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.12-1.89(m，9H，CH3-Ala和3 CH2-Lys)，3.04(m，1H，苄基)，3.14(m，2H，N-CH2-Lys)，3.27(bd，1H，苄基)，4.09(m，1H，Hα)，4.28(m，1H，Hα)，4.34-4.68(m，5H，Hα和Aloc)，5.02-5.40(m，4H，Aloc)，5.14(s，2H，苄基-间隔基)，5.21(s，2H，苄基-间隔基)，5.31(s，2H，苄基-间隔基)，5.72(m，1H，Aloc)，5.90(m，1H，Aloc)，7.10-7.52(m，17H，芳族)，7.63(d，2H，J＝8.3Hz，芳族)，8.27(d，2H，J＝9.1Hz，芳族-PNP)ppm；MS(FAB)m/e 1102(M+H)+，1124(M+Na)+。
实施例28
合成Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Abc)-PABC-PABC-PABC-DOX 36
将N-甲基吡咯烷酮中的4-硝基苯基碳酸酯35(69mg，0.063mmol)和阿霉素-HC1(40mg，1.1当量)，在室温下用三乙胺(9.7μl，1.1当量)处理。所述反应混合物在暗处搅拌24小时，并将此反应混合物用10％2-丙醇/乙酸乙酯稀释。将有机层用水和盐水洗涤，并用硫酸钠干燥。溶剂蒸发后，粗产物通过柱色谱纯化(SiO2-CHCl3/MeOH 9/1)接着以2mm硅胶板用chromatotron进行环形色谱(CHCl3/MeOH；9/1)，得到65mg(71％)的被保护的药物前体36。1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.10-1.80(m，14H，糖CH3，CH3-Ala，3 CH2-Lys和2′)，2.14(dd，1H，8)，2.36(bd，1H，8)，3.18(bd，1H，10)，2.82-3.41(m，6H，苄基Phe和N-CH2-Lys和10)，3.37(s，1H，4′)，3.60(bs，1H，3′)，4.02(m，1H，Hα)，α)，4.07(s，3H，OMe)，4.29(dd，1H，5′)，4.37-4.68(m，5H，Hα和4 Aloc)，4.76(s，2H，14)，4.95(bs，2H，苄基间隔基)，5.10(s，2H，苄基间隔基)，5.14(s，2H，苄基间隔基)，5.02-5.35(m，4H，Aloc)，5.27(bs，1H，1′)，5.47(bs，1H，7)，5.70(m，1H，Aloc)，5.89(m，1H，Aloc)，7.09-7.50(m，16H，5 Phe和10间隔基和3)，7.64(d，2H，J＝8.4Hz，2H芳族间隔基)，7.79(t，1H，J＝8.1Hz，2)，8.06(d，1H，J＝7.5Hz，1)ppm；MS(FAB)m/e1506(M+H)+，1528(M+Na)+。
实施例29
合成D-Ala-Phe-Lys-PABC-PABC-PABC-DOX(·2HCl)37
在氩气氛中，向40mg的被保护的药物前体36(0.027mmol)的干燥的四氢呋喃/二氯甲烷溶液中，加入吗啉(24μl，10当量)和催化量的Pd(PPh3)4。将此反应混合物在暗处搅拌1小时。离心收集红色沉淀并用乙酸乙酯洗涤多次。加入水和二噁烷，并用4.4ml 0.125mM盐酸酸化此混合物。冻干后，得到26mg(70％)的阿霉素药物前体37。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.19(d，3H，J＝6.9Hz，糖CH3)，1.27(d，3H，J＝6.6Hz，CH3-Ala)，1.25-2.00(m，8H，3 CH2-Lys和2′)，2.18(dd，1H，8)，2.33(br d，1H，J＝16.1Hz，8)，2.89-3.38(m，6H，N-CH2-Lys和10和Bn Phe)，3.60(s，1H，4′)，3.72(m，1H，3′)，4.08(s，3H，OMe)，4.18(m，1H，Hα)，4.53(dd，1H，5′)4.66(m，1H，Hα)，4.77(s，2H，14)，4.96(s，2H，Bn间隔基)，5.11(s，2H，bn间隔基)，5.17(s，2H，Bn间隔基)，5.27(br s，1H，1′)，5.48(br s，1H，7)，7.05-7.35(m，16H，芳族间隔基和3)，7.52(d，2H，J＝8.5Hz，芳族间隔基)，7.84(t，1H，2)，8.01(d，1H，J＝7.7Hz，1)ppm。
实施例30
合成2′-[4-硝基苯基碳酸酯]-紫杉醇38
在氩气氛中向194mg(0.227mmol)的紫杉醇的干燥的二氯甲烷溶液中，加入吡啶(4滴)。在-50℃下，将溶解在二氯甲烷中的275mg(6.0eq.)4-硝基苯基氯甲酸酯加入上述溶液中。将此反应混合物在-50℃下搅拌，4小时后加入4-硝基苯基氯甲酸酯(4.2eq.)。1小时后，将此混合物用二氯甲烷稀释，并用0.5N硫酸氢钾和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。溶剂蒸发后，将残余的黄色薄膜通过柱色谱纯化(SiO2-EtOAc/Hex 1/1)，得到133mg的活化的紫杉醇38(78％，73％转变)。
M.P.161℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.14(s，3H，17)，1.25(s，3H，16)，1.68(s，3H，19)，1.92(s，3H，18)，2.22(s，3H，10-OAc)，2.49(s，3H，4-OAc)，2.55(m，1H，6a)，3.82(d，1H，3)，4.21(d，1H，20b)，4.32(d，1H，20a)，4.42(m，1H，7)，4.96(bd，1H，5)，5.53(d，1H，2′)，5.69(d，1H，2)，6.09(q，1H，3′)，6.29(s，1H，10)，6.34(m，1H，13)，6.90(d，1H，N-H)，7.20-7.65(m，13H，芳族)，7.75(d，2H，芳族)，8.15(d，2H，芳族)，8.25(d，2H，硝基苯基)ppm；MS(FAB)m/e 1020(M+H)+，1042(M+Na)+；C54H54N2O19(·1_ H2O)理论值C 62.00％，H 5.40％，N 2.68％，实测值C 61.89％，H 5.52％，N 2.64％。
实施例31
合成2′-[H-D-Ala-Phe-Lys-PABC-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]
-紫杉醇(·2HCl)43
步骤a：合成N(Me)-(CH2)2-N(Me)-Z 39(Z＝苄氧基羰基)
在氩气氛中室温下，向1.21g(13.7mmol)的N，N′-二甲基亚乙基二胺的干燥的二氯甲烷溶液中，滴加Z-ONSu(338mg，1.36mmol)的干燥的二氯甲烷溶液。搅拌120分钟后，将此溶液真空浓缩。将残余的产物溶解于乙酸乙酯中，并将有机层用盐水洗涤。将有机溶剂用无水硫酸钠干燥并蒸发至干。将油状产物通过柱色谱纯化(SiO2-CHCl3/MeOH 1/1)得到249mg(83％)的产物39，其为油状物。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.42(bd，3H，3J＝13.9Hz，CH3-NH-CH2)，2.73(m，2H，CH3-NH-CH2)，2.95(s，3H，CH3-N)，3.41(bs，2H，CH2-N)，5.13(s，2H，CH2-Z)，7.25-7.40(m，5H，芳族)ppm。
步骤b：合成2′-[Z-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]-紫杉醇40
在氩气氛中-50℃下，向114mg(112μmol)的2′-活化的紫杉醇38和25mg的Z-被保护的N，N′-二甲基亚乙基二胺39的干燥的二氯甲烷溶液中，加入三乙胺(20.0μl，144μmol)。将所述溶液在-40℃下搅拌7小时，随后加热至室温，然后室温下继续搅拌过夜。将此溶液用二氯甲烷稀释，并用饱和碳酸氢钠、盐水和0.5N硫酸氢钾洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，并真空浓缩得到黄色薄膜。产物通过柱色谱纯化(SiO2-EtOAc/Hex 2/1)得到113mg(92％)的所需产物40。M.P.130-131℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.12(s，3H，17)，1.21(s，3H，16)，1.70(s，3H，19)，2.00(s，3H，18)，2.26(s，3H，10-OAc)，2.60(s，3H，4-OAc)，2.90(s，3H，CH3-间隔基)，2.94(s，3H，CH3-间隔基)，2.97(m，1H，CH2-间隔基)，3.06(m，1H，CH2-间隔基)，3.54(m，1H，CH2-间隔基)，3.78(m，1H，CH2-间隔基)，3.84(d，1H，3J＝7.2Hz，3)，4.23(d，1H，2J＝8.4Hz，20b)，4.32(d，1H，2J＝8.4Hz，20a)，4.47(m，1H，7)，4.69(d，1H，2J＝12.4Hz，苄基)，4.85(d，1H，2J＝12.4Hz，苄基)，5.01(m，1H，5)，5.47(d，1H，3J＝2.9Hz，2′)，5.68(d，1H，3J＝7.0Hz，2)，6.19(dd，1H，3J＝9.8Hz，3J＝2.9Hz，3′)，6.28(s，1H，10)，6.33(m，1H，13)，6.94-7.70(m，16H，芳族)，7.83(d，2H，3J＝7.3Hz，芳族)，8.16(d，2H，3J＝7.1Hz，芳族)，8.57(d，1H，3J＝9.8Hz，NH)ppm；MS(FAB)m/e 1102(M+H)+，1124(M+Na)+；C60H67N3O17(·H2O)理论值C 64.33％，H 6.21％，N3.73％，实测值C 64.65％，H 6.11％，N 3.76％。
步骤c： 合成2′-[N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]-紫杉醇(·7AcOH)41
向61.8mg(56.1μmol)的化合物40的5％乙酸/甲醇溶液中，加入催化量的10％Pd-C。将此混合物在氢气氛中搅拌1小时。离心除去Pd-C，真空蒸发掉甲醇并加入乙酸乙酯。将有机层用水萃取。将水层冻干得到78.0mg(100％)的所需产物41。
步骤d：合成
2′-[Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]-紫杉醇42
在氩气氛中向152mg(95.8μmol)的紫杉醇-间隔基化合物41和80.7mg(101μmol)的碳酸酯16的干燥的四氢呋喃溶液中，加入三乙胺(200μl，1.44mmol)。24小时后，将此溶液浓缩至干，并将残余的产物溶解于二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥并真空蒸发。粗产物用柱色谱纯化(SiO2-EtOAc/Hex/MeOH5/5/1)得到113mg(72％)的所需被保护的药物前体42。M.P.127-128℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.13(s，3H，17)，1.22(s，3H，16)，1.27(d，3H，3J＝5.6Hz，CH3-Ala)，1.04-2.00(m，6H，CH2-Lys)，1.69(s，3H，19)，2.00(s，3H，18)，2.22(s，3H，10-OAc)，2.59(s，3H，4-OAc)，2.90(s，3H，CH3-间隔基)，2.91(s，3H，CH3-间隔基)，2.76-3.46(m，6H，CH2-间隔基，苄基和N-CH2-Lys)，3.54(m，1H，CH2-间隔基)，3.74(m，1H，CH2-间隔基)，3.84(d，1H，3J＝7.0Hz，3)，4.00-5.00(m，3H，3 Hα)，4.23(d，1H，2J＝8.4Hz，20b)，4.32(d，1H，2J＝8.4Hz，20a)，4.48(m，1H，7)，4.62(d，1H，2J＝12.3Hz，苄基)，4.83(d，1H，2J＝12.4Hz，苄基)，4.30-4.73(m，4H，Aloc)，4.93-5.39(m，5H，Aloc和5)，5.48(d，1H，3J＝2.9Hz，2′)，5.69(d，1H，3J＝7.0Hz，2)，5.54-5.78(m，1H，Aloc)，5.88(m，1H，Aloc)，6.18(bd，1H，3′)，6.30(s，1H，10)，6.33(m，1H，13)，7.05-7.78(m，20H，芳疾)，7.82(d，2H，3J＝7.4Hz，芳族)，8.16(d，2H，3J＝7.2Hz，芳族)ppm；MS(FAB)m/e1653(M+Na)+；C86H102N8O24理论值C 62.61％，H 6.35％，N 6.79％，实测值C 62.40％，H 6.31％，N 6.36％。
步骤e： 合成2′-[H-D-Ala-Phe-Lys-PABC-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]紫杉醇(·2HCl)43
在氩气氛中向83.0mg(50.9μmol)的被保护的药物前体42的干燥的四氢呋喃溶液中，加入冰醋酸(12μl，4.0eq.)以及三丁基氢化锡(41μl，3.0eq)和催化量的Pd(PPh3)4。30分钟后，通过加入乙醚沉淀产物。离心收集所得白色沉淀，并用乙醚洗涤多次。加入叔丁醇并再次蒸发以除去过量的HCl，将所得产物溶解于水/二噁烷中并冻干，得到56mg(70％)的药物前体43。M.P.142℃；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.13(s，3H，17)，1.21(s，3H，16)，1.26(d，3H，3J＝6.6Hz，CH3-Ala)，1.05-2.00(m，6H，CH2-Lys)，1.69(s，3H，19)，2.00(s，3H，18)，2.22(s，3H，10-OAc)，2.58(s，3H，4-OAc)，2.89(s，3H，CH3-间隔基)，2.91(s，3H，CH3-间隔基)，2.67-3.64(m，3H，CH2-间隔基)，2.95(m，1H，苄基)，3.07(m，2H，N-CH2-Lys)，3.15(m，1H，苄基)，3.78(m，1H，CH2-间隔基)，3.83(d，1H，3J＝7.1Hz，3)，4.10-5.05(m，2H，2 Hα)，4.22(d，1H，2J＝8.4Hz，20b)，4.32(d，1H，2J＝8.4Hz，20a)，4.46(m，1H，7)，4.60(m，1H，Hα)，4.65(d，1H，2J＝12.3Hz，苄基-间隔基)，4.80(d，1H，2J＝12.4Hz，苄基-间隔基)，4.99(bd，5H，2J＝7.4Hz，5)，5.47(d，1H，3J＝2.9Hz，2′)，5.68(d，1H，3J＝6.9Hz，2)，6.17(bd，1H，3J＝2.9Hz，3J＝9.6Hz，3′)，6.30(s，1H，10)，6.31(m，1H，13)，7.05-7.70(m，20H，芳族)，7.82(d，2H，3J＝7.5Hz，芳族)，8.16(d，2H，3J＝7.2Hz，芳族)，8.54(d，1H，3J＝9.6Hz，NH-紫杉醇)ppm；MS(FAB)m/e 1463(M+H)+，1485(M+Na)+；C85H97N7O22(·3AcOH)理论值C 61.04％，H 6.50％，N 6.71％，实测值C 60.91％，H 6.45％，N7.10％。
实施例32
合成2′-O-[D-Ala-Phe-Lys-PABC-PABC-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]-紫杉醇·2HCl
步骤a：合成
2′-O-[Aloc-D-Ala-Phe-Lys(Aloc)-PABC-PABC-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]-紫杉醇
向紫杉醇-间隔基轭合物41(50mg，48.6μmol)和肽-间隔基轭合物18(46.3mg，48.6μmol)的THF(3ml)溶液中，加入三乙胺(101μl，0.730mmol)。将此反应混合物在室温下搅拌15小时，然后在减压下浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷，并将该溶液用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤多次，用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。用柱色谱(SiO2-EtOAc/Hex/MeOH 5/4/1)纯化得到44(58.2mg，32.7μmol，67％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.12(s，3H，17)，1.21(s，3H，16)，1.26(d，3H，J＝6.6Hz，CH3-Ala)，1.05-2.00(m，6H，Lys的3×CH2)，1.69(s，3H，19)，2.22(s，3H，10-OAc)，2.58(s，3H，4-OAc)，2.90(s，3H，N-CH3)，2.91(s，3H，N-CH3)，2.80-3.85(m，9H，N-CH2-CH2-N和Phe的CH2及Lys的N-CH2和3)，4.00-5.38(m，19H，3×Hα和20和7和间隔基的2×CH2和5和2×CH2＝CH-CH2)，5.46(d，1H，J＝2.7Hz，2′)，5.60(m，1H，CH2＝CH-CH2)，5.69(d，1H，J＝6.9Hz，2)，5.89(m，1H，CH2＝CH-CH2)，6.16(dd，1H，J＝9.3Hz，J＝2.4Hz，3′)，6.30(s，1H，10)，6.31(s，1H，13)，7.09-7.81(m，26H，芳族)，8.16(d，2H，J＝7.2Hz，芳族)ppm。
步骤b：合成
2′-O-[D-Ala-Phe-Lys-PABC-PABC-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]-紫杉醇·2HCl
向被保护的药物前体44(50.0mg，28.1μmol)的干燥THF(3ml)溶液中，加入三丁基氢化锡(22.7μL)、Pd(PPh3)4(6.5mg，5.6μmol)和乙酸(6.5μL，0.112mmol)。30分钟后，将反应混合物缓慢加入到冷乙醚中。离心收集白色沉淀，并用乙醚洗涤两次。将残余物悬浮于乙酸乙酯中，并在剧烈搅拌下加入0.5M HCl的乙酸乙酯溶液(0.5ml)。离心收集白色沉淀，并用乙酸乙酯洗涤两次。向此残余物中加入叔丁醇，并随后蒸发以除去过量的HCl。将残余物溶解于水并冻干，得到45(32.0mg，19.0μmol，68％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.17(s，3H，17)，1.19(s，3H，16)，1.26(d，3H，J＝6.9Hz，CH3-Ala)，1.20-2.00(m，6H，Lys的3×CH2)，1.70(s，3H，19)，2.02(s，3H，18)，2.21(s，3H，10-OAc)，2.55(s，3H，4-OAc)，2.89-2.99(m，4H，Phe的CH2和Lys的N-CH2)，2.93(s，6H，2×N-CH3)，3.10-3.87(m，4H，N-CH2-CH2-N)，3.86(d，1H，J＝6.9Hz，3)，4.06(q，1H，J＝7.0Hz，Hα)，4.26-4.76 & 5.02(m，8H，2×Hα和20和7和间隔基的CH2和5)，5.16(s，2H，间隔基的CH2)，5.45(d，1H，J＝2.5Hz，2′)，5.72(d，1H，J＝7.1Hz，2)，6.10(m，1H，3′)，6.26(m，1H，13)，6.40(s，1H，10)，7.08-7.62(m，24H，芳族)，7.77(d，2H，J＝7.6Hz，芳族)，8.14(m，2H，芳族)ppm。
实施例33
合成2′-O-[D-Ala-Phe-Lys-PACC-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]-紫杉醇·2HCl 49
步骤a：制备NZ-D-Ala-Phe-Lys(NZ)-OH 9c
向三肽8(506mg，1.39mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中，加入三甲基甲硅烷基氯(0.568ml，4.44mmol)和DIPEA(0.509ml，2.92mmol)。将此反应混合物在回流温度下搅拌1.5小时。然后，将此反应混合物冷却至0℃，此后加入DIPEA(776μl，4.44mmol)和对硝基苄基氯甲酸酯(NZ-C1)(629mg，2.92mmol)。将此反应混合物在室温下搅拌5小时，并在减压下浓缩。将此残余物在乙酸乙酯和乙酸酯缓冲液(pH＝5)之间分配。将有机层用更多的乙酸酯缓冲液、水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。用柱色谱(SiO2-CH2C12/MeOH/AcOH 90/7/5)进行纯化，得到9c(620mg，0.858mmol，61％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.18(d，3H，J＝7.1Hz，Ala的CH3)，1.36-1.97(m，6H，Lys的3×CH2)，2.94(dd，1H，CH2-Phe)，3.12-3.23(m，3H，Phe的CH2和Lys的N-CH2)，4.12(m，1H，Hα)，4.42(m，1H，Hα)，4.63(m，1H，Hα)，5.17(m，4H，CH2-NZ)，7.17-7.25(m，5H，芳族)，7.51(d，4H，J＝8.2Hz，芳族)，8.19(d，4H，J＝8.0Hz，芳族)ppm。
步骤b：制备NZ-D-Ala-Phe-Lys(NZ)-PACA 46
在-40℃下向被保护的三肽9c(300mg，0.415mmol)的THF(10ml)溶液中，加入N-甲基吗啉(50.2μl，0.457mmol)和氯甲酸异丁基酯(62.4mg，0.457mmol)。将此反应混合物在-30℃下搅拌3小时。然后，加入溶于THF(5ml)中的间隔基10(77.3mg，0.498mmol)和N-甲基吗啉(55.0μl，0.498mmol)。将此反应混合物搅拌15小时，将反应温度缓慢升温至室温。将所述反应混合物在减压下浓缩，并将残余物溶解于二氯甲烷中。将所得溶液用饱和碳酸氢钠水溶液、0.5M硫酸氢钾水溶液和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。用柱色谱(SiO2-CHCl3/MeOH 93/7)纯化得到46(267mg，0.313mmol，75％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：δ1.22(d，3H，J＝7.2Hz，Ala的CH3)，1.40-2.04(m，6H，Lys的3×CH2)，2.96(dd，1H，J＝9.9，J＝14.4Hz，Phe的CH2)，3.15(m，2H，Lys的N-CH2)，3.30(dd，1H，J＝14.4Hz，J＝4.2Hz，Phe的CH2)，4.08(m，1H，Hα)，4.23(dd，2H，J＝1.1Hz，J＝5.6Hz，间隔基的CH2)，4.46(m，1H，Hα)，4.56(m，1H，Hα)，4.90(d，1H，J＝13.8Hz，NZ的CH2)，4.99(d，1H，J＝13.8hz，NZ的CH2)，5.17(s，2H，NZ的CH2)，6.26(dt，1H，J＝5.7Hz，J＝15.9Hz，CH＝CH-CH2)，6.52(d，1H，J＝15.9Hz，CH＝CH-CH2)，7.22-7.32(m，9H，芳族)，7.53(d，2H，J＝8.6Hz，芳族)，7.61(d，2H，J＝8.6Hz，芳族)，8.04(d，2H，J＝8.6Hz，芳族)，8.19(d，2H，J＝8.6Hz，芳族)ppm。
步骤c：制备NZ-D-Ala-Phe-Lys(NZ)-PACC-PNP47
向肽-间隔基46(244mg，0.286mmol)的THF(15ml)溶液中，加入DIPEA(0.216ml，1.24mmol)、对硝基苯基氯甲酸酯(187mg，0.927mmol)和吡啶(6.3μl，77.2μmol)。将此反应混合物搅拌48小时，然后用乙酸乙酯(50ml)稀释。将此溶液用10％柠檬酸水溶液、水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。用柱色谱(SiO2-CHCl3/MeOH95/5)纯化，得到47(291mg，0.286mmol，100％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD/DMSO-d6)：δ1.23(d，3H，J＝7.1Hz，Ala的CH3)，1.38-2.03(m，6H，Lys的3×CH2)，2.97(dd，1H，J＝9.9Hz，J＝14.0Hz，Phe的CH2)，3.14(m，2H，Lys的N-CH2)，3.28(dd，1H，Phe的CH2)，4.10(m，1h，Hα)，4.47(m，1H，Hα)，4.54(m，1H，Hα)，4.87-5.00(m，4H，间隔基的CH2和NZ的CH2)，5.17(s，2H，NZ的CH2)，6.27(dt，1H，J＝6.8Hz，J＝15.4Hz，CH＝CH-CH2)，6.70(d，1H，J＝15.4Hz，CH＝CH-CH2)，7.22-7.33(m，9H，芳族)，7.47(d，2H，J＝9.2Hz，芳族)，7.53(d，2H，J＝8.6Hz，芳族)，7.67(d，2H，J＝8.6Hz，芳族)，8.04(d，2H，J＝8.6Hz，芳族)，8.18(d，2H，J＝8.6Hz，芳族)，8.30(d，2H，J＝9.2Hz，芳族)ppm。
步骤d：制备
2′-O-[NZ-D-Ala-Phe-Lys(NZ)-PACC-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]-紫杉醇48
向紫杉醇-间隔基轭合物41(50mg，48.6μmol)和肽-间隔基轭合物47(54.5mg，53.5μmol)的THF(3ml)溶液中，加入三乙胺(101μl，0.730mmol)。将此反应混合物在室温下搅拌15小时，然后在减压下浓缩。将此残余物溶解于二氯甲烷，然后用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。用柱色谱(SiO2-EtOAc/Hex/MeOH 5/4/1)提纯，得到48(65.7mg，35.6μmol，73％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.12(s，3H，17)，1.21(s，3H，16)，1.30(d，3H，J＝7.0Hz，Ala的CH3)，1.20-2.10(m，6H，Lys的3×CH2)，1.68(s，3H，19)，2.00(s，3H，18)，2.22(s，3H，10-OAc)，2.58(s，3H，4-OAc)，2.91(s，3H，N-CH3)，2.95(s，3H，N-CH3)，2.90-3.90(m，8H，N-CH2-CH2-N和Phe的CH2及Lys的N-CH2)，3.83(d，1H，J＝6.6Hz，3)，4.10-5.00(m，11H，3×Hα和20和5和7和CH2＝CH-CH2和NZ的CH2)，5.16(s，2H，NZ的CH2)，5.46(d，1H，J＝3.3Hz，2′)，5.68(d，1H，J＝7.5Hz，2)，6.01-6.17(m，2H，3′和CH＝CH-CH2)，6.31(s，1H，10)，6.32(m，1H，13)，6.40(d，1H，J＝15.9Hz，CH＝CH-CH2)，7.19-7.70(m，24H，芳族)，7.83(d，2H，J＝7.2Hz，芳族)，8.01(d，2H，J＝8.7Hz，芳族)，8.15-8.19(m，4H，芳族)ppm。
步骤e.2′-O-[D-Ala-Phe-Lys-PACC-N(Me)-(CH2)2-N(Me)CO]-紫杉醇·2HCl 49
向被保护的药物前体48(50.0mg，27.1μmol)的甲醇(5ml)溶液中，加入乙酸(1.5ml)和锌(88.5mg，1.35mmol)。将所得悬浮液在室温下搅拌24小时。然后，将此反应混合物通过HYFLO过滤。加入水，在减压下蒸发甲醇。将所得溶液冻干得到淡黄色固体，将其溶解于二氯甲烷和甲醇(2ml，1∶1 v/v)的混合物中。将此溶液加入到冷的二异丙基醚中。离心收集白色沉淀，用异丙基醚洗涤两次，得到药物前体49(27.8mg，17.3μmol，64％)。
实施例34
含双间隔基的紫杉醇药物前体22和43的稳定性
将药物前体以150μM的浓度加入0.1M Tris/HCl缓冲液(pH7.3)中，3天后并没有形成降解产物(TLC，RP18；CH3CN/H2O/AcOH 19/19/2)。
含双间隔基的阿霉素药物前体20的稳定性
将药物前体以100-270μM的浓度加入0.1M Tris/HCl缓冲液(pH7.3)中，90小时后并没有发现降解产物的形成(TLC，RP18；CH3CN/H2O/AcOH 19/19/2)。
实施例35
纤溶酶对含双间隔基的药物前体的酶解
通过将阿霉素药物前体以100μM的浓度加入0.1M Tris/盐酸缓冲液(pH7.3)中，其中存在50或20μg/mL的人纤溶酶(Fluka)，来研究阿霉素药物前体的水解。用HPLC系统进行分析，使用ChrompackMicrosphere-C18柱(3μm，2×100×4.6mm)。用7∶3甲醇/50mM Et3N-甲酸酯缓冲液(pH3.0)进行该分析柱的洗脱。用UV-检测仪(λ＝500nm)进行检测。 [药物前体](μM) [纤溶酶](μg/mL) T1/2活化(分钟)药物前体44 100 50 19药物前体44 200 20 ＞75药物前体20 200 20 12
通过将紫杉醇药物前体以200μM的浓度加入0.1M Tris/盐酸缓冲液(pH7.3)中，其中存在100μg/mL的人纤溶酶(Fluka)，来研究紫杉醇药物前体的水解。含双间隔基的紫杉醇药物前体全部转变为相应的母体药物。进行毛细管电泳，用CE Ext.光路毛细管(Light PathCapillary)(80.5cm，50μm)，用1∶1甲醇/0.05磷酸钠缓冲液(pH7.0)作为洗脱剂。在200和254nm进行检测。[药物前体](μM)[纤溶酶](μg/mL)T1/2活化(分钟)T1/2环合(分钟)药物前体45药物前体43药物前体22 200 200 200 100 100 100 42 4 7.5 47
实施例36
毒性
在体外采用7个很好定性的人肿瘤细胞系和微培养sulphorhodamine B(SRB)试验来检测药物前体和母体药物的抗增生作用。检测抗增生作用并以IC50值来表示，其是经过5天培养后，对对照细胞产生50％抑制的药物(药物前体)浓度。
表1.药物前体和母体药物的ID50值a，b(ng/ml) 细胞系 MCF-7 EVSA-T WIDR IGROV M19 A498 H226药物前体20 242 546 627 896 302 2303 503药物前体43 60 119 117 499 96 681 62药物前体22 11 5 5 22 7 25 7紫杉醇 ＜3 ＜3 ＜3 10 ＜3 ＜3 ＜3阿霉素 10 8 11 60 16 90 199
a与未处理的对照培养物相比能够对细胞生长产生50％抑制的药物剂量。
bSRB细胞生存能力试验。
细胞系：MCF-7；乳腺癌。EVSA-T；乳腺癌。WIDR；直肠癌。IGROV；卵巢癌。M19；黑素瘤。A498；肾癌。H226；非小细胞肺癌。