广升麻提取物、其制备方法及其用途 【技术领域】
本发明涉及天然药物领域，具体涉及天然药物广升麻的提取物、其制备方法、含其的药物组合物及其医药用途。
背景技术
广升麻全称广东升麻，为菊科植物麻花头Serratula chinensis S.Moore的干燥块根。本品呈长纺锤形，稍扭曲，两端稍尖，中部稍粗，长10～20cm，直径0.5～1cm，表面灰黄色、棕褐色或黑褐色，有粗纵皱纹和少数须根痕。质坚硬而脆，易折断。断面暗蓝色或灰黄色，略呈角质状。气特殊，味淡，微苦涩。主治：升阳，散风，解毒，透疹。用于风热头痛，咽喉肿痛，斑疹不透，中气下陷，久泻脱肛，子宫下坠(中华人民共和国卫生部《药品标准中药材》第一册，一九九二年)。
广升麻是两广及福建等地升麻的习惯用药，其饮片仅作中药配方使用，由于是地方性的习惯用药，故受关注的可能性小，有关本品的现代研究极少，有关本品的主要化学成分研究又未见有报道，因此该药材没有得到进一步的开发，本品的植物资源较丰富，主要分布于华南地区，在湖南等地已有大面积栽培，只是在中药组方中作为饮片使用。
【发明内容】
本发明的目的之一是公开一种广升麻的提取物及其制备方法。
本发明的另一个目的是公开一种含有该提取物的药物组合物。
本发明的还有一个目的是公开这种组合物的治疗用途，即治疗脑血管疾病的用途。
本发明的提取物由以下方法制备得到：将广升麻粉碎，用有机溶剂回流提取，过滤，滤液经回收溶媒得浸膏，干燥，即得粗提物，所述有机溶剂是丙酮或醋酸乙酯或C1-4的直链或支链的脂肪族醇。
优选的有机溶剂是乙醇。
乙醇的浓度优选95％。
上述制备方法进一步可包括：将粗提物加水溶解，必要时可加热，滤过，滤液调pH至8～10，用醋酸乙酯或正丁醇萃取，减压回收溶媒，萃取物减压干燥即得精提物。
pH调节剂优选石灰乳。
本发明提取物中含有蜕皮甾酮和其它物质，一般地，粗提物中含有蜕皮甾酮的量为5-10％，精提物中含蜕皮甾酮地量为30-60％，因此在质量控制中可用蜕皮甾酮的含量作为一个质量指标。
本发明还公开了一种药物组合物，其含有治疗有效量的广升麻提取物和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是指一种或几种惰性的、非毒性的固体或液体填充物、稀释剂、助剂等，它们不逆向与活性化合物或病人发生作用。
所述的广升麻提取物可以是粗提物，也可以是精提物，其都有一定的药理功效。本发明组合物的剂型可以是片剂、胶囊、丸剂、栓剂、软胶囊、口服液、混悬剂、注射液等药剂学上常用的剂型。
口服用药片和胶囊含有传统的赋形剂如填充物、稀释剂、润滑剂、分散剂以及粘合剂。可按照本领域中熟知的方法进行制备。
以上活性剂的剂量将因配方而异。一般的剂量为每单位制剂中含提取物3mg～2000mg。也可根据不同的剂型选用不用的剂量。
本发明的提取物可用于制备治疗脑血管疾病的药物。其中的脑血管疾病优选脑缺血或脑缺氧。在药理试验中，发明人惊奇地发现，广升麻提取物中尽管含有蜕皮甾酮，并可用此作为质量控制指标，但是本提取物与蜕皮甾酮单体的药理功效相当甚至更好，而蜕皮甾酮为天然植物中的单体，提取工艺复杂，收率低，制备成本高。而本发明的广升麻提取物不仅工艺简单，成本低，而且疗效更好，这说明广升麻提取物中起药理活性作用的并不仅仅是蜕皮甾酮，而是有其它多种成分在同样起药理作用，它们或相加或协同，达到很好的疗效。
以下是部分药效学试验及数据：
一、对急性实验性不完全脑缺血小鼠的保护作用
试验结论：广升麻粗提物、精制物大、中剂量组均可延长急性不完全脑缺血小鼠的存活时间，与空白对照组比较差异性显著(P＜0.05)，(P＜0.01)，与蜕皮甾酮组比较好于蜕皮甾酮组。
二、对插线法所致大脑中动脉缺血再灌注大鼠的保护作用
试验结论：广升麻精制物可改善动物的神经行为学评分，降低动物的脑梗塞率、脑含水量和脑指数，与模型组比较差异性显著(P＜0.05)。与蜕皮甾酮组比较好于蜕皮甾酮组。
1统计学处理
计数资料数据以均数±标准差表示(x±S)，采用Student’s-t检验。计量资料数据采用秩和检验。
2实验方法和结果
2.1小鼠急性全脑缺血实验
2.1.1实验分组小鼠急性全脑缺血实验共分7组：模型组，给予0.9％氯化钠注射液，广升麻精制物低(0.75mg/kg)、中(1.5mg/kg)、高(3mg/kg)三个剂量组、广升麻粗提物(20mg/kg)蜕皮甾酮(3mg/kg)组、阳性药对照组尼莫地平(20mg/kg)。给药容积为10ml.kg-1。
2.1.2实验方法取ICR小鼠，体重18～22g，雌雄兼备，随机分为7组，1-3组给予广升麻精制物三个剂量，第4组给予广升麻粗提物，第5组给予蜕皮甾酮，第6组给予尼莫地平，第7组模型组给予生理盐水，给药三天，第三天给药后，将小鼠固定，分离左右两侧颈总动脉合并迷走神经，于给药半小时后结扎双侧颈总合并迷走。记录小鼠的呼吸维持时间，结果见表1。
2.2大鼠大脑中动脉阻断再灌注实验
2.2.1实验方法
2.2.1.1尼龙栓子的制备参考Zea longa方法，将一长40mm，直径0.2mm的尼龙线的一端加热为光滑的球形。用酒精擦干净并于距球端18.5mm处标记，置于0.9％的生理盐水中备用。
2.2.1.2大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)脑缺血再灌注(IR)模型的制作取体重250～350雄大鼠，随机分七组，假手术组，模型组(给予同等容积的生理盐水)，阳性药组(尼莫地平20mg/kg)，广升麻精制物高剂量组(3mg/kg)，广升麻精制物中剂量组(1.5mg/kg)，广升麻精制物低剂量组(0.75mg/kg)，蜕皮甾酮组(3mg/kg)，给药体积10ml/kg，给药三天后，用10％水合氯醛麻醉(30mg/100g)。采用改良Zea longa法，将大鼠仰卧于手术台上，颈正中切开，分离右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，用0号线接扎并剪断ECA的分支，接扎(两道以利于剪断)并游离ECA主干一段，沿ICA向下分离。用动脉夹夹住CCA及ICA。在ECA剪一小口，将制备好的尼龙线插入ECA，经CCA分叉处通过ICA入颅至大脑前动脉(ACA)，尼龙线插入深度约为18mm。再灌注时外拉尼龙线使其球端回至ECA内即可恢复大脑中动脉的供血。分别于手术3小时，24小时后给予再灌注。
2.2.2检测指标
2.2.2.1神经行为学评分手术后参照Bederson方法进行行为学评分(1)提鼠尾离地面约1尺，观察前肢情况。正常大鼠两前肢对称地伸向地面。手术对侧前肢出现腕肘屈曲，肩内旋，左前肢内收，紧贴胸臂计4分，否则0分。(2)将鼠置平滑地面上，分别推左/右肩向对侧移动，检查抵抗推动的阻力。正常大鼠双侧阻力明显对称。当右肩向左侧移动时，发现阻力下降者，根据下降程度的不同，评为1～3分。(3)将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力，正常大鼠两前肢肌张力明显对称。发生左前肢肌张力明显下降者，根据下降的程度，评为1～3分。根据以上标准评分，满分10分，分数越高，说明动物的行为障碍越严重。评分采用单盲法。
2.2.2.2TTC染色测量脑梗塞面积手术24小时后将大鼠断头取脑，将脑置冰冷的生理盐水中10min，去除嗅球、小脑和低位脑干后，将其余部分冠状切四刀，切成五片。第一刀在脑前极与视交叉连线中间；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。然后迅速将脑片置5ml含有1％TTC的磷酸缓冲液中，避光温孵30min，其中每隔7～8min翻动一次，经染色后，正常组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈白色，且界限分明。温孵完毕后将脑切片照相，剪下红白颜色区称重。根据“重量求面积法”分别计算出五个脑片共10个平面的总面积和梗塞去区域的面积，求出梗塞区面积占一侧大于半球总面积的百分比，即梗塞范围。
2.2.2.3测定脑指数及脑含水量MCAO后24小时断头取脑，称湿重；106℃烘干至恒重，即干重，按下列公式计算脑指数和脑含水量。
脑指数＝脑湿重(g)/体重(100g)
脑含水量(％)＝【脑湿重(g)-脑干重(g)】/脑湿重(g)×100％
2.3结果
2.3.1广升麻粗提物、精制物对小鼠急性全脑缺血的影响 结果显示，广升麻精制物大、中剂量组均能延长急性脑缺血小鼠的存活时间，与模型组比较差异显著(P＜0.05)，(P＜0.01)，蜕皮甾酮组(3mg/kg)与广升麻中剂量组(1.5mg/kg)作用相当。
表1广升麻粗提物、精制物对小鼠急性全脑缺血的保护作用(X±SD)
组别 剂量(mg/kg) 动物数(只) 呼吸维持时间(min)
模型组 - 15 1.3±0.39
尼莫地平组 20mg/kg 15 2.45±0.89**
蜕皮甾酮组 3 15 1.89±0.73*
精制物低剂量组 0.75 14 1.48±0.34
精制物中剂量组 1.5 15 1.95±0.84*
精制物高剂量组 3 16 2.16±0.81**
粗提物组 20 15 1.82±0.63*
与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
2.3.2广升麻精制物对局灶性脑缺血大鼠行为缺陷程度的影响大脑中动脉阻断后，所有动物出现神经运动功能障碍。广升麻精制物三剂量组对此均有不同程度的改善作用，其中大剂量组与模型组比较，差异显著(P＜0.05)。见表2。
表2广升麻精制物对缺血再灌注大鼠神经行为学评分及脑梗塞率的影响(n，x±s)
组别 样本数(n) 行为学评分 脑梗塞率(％)
4h 24h
假手术组 10 2.67±1.75** 1.80±0.45* 0.00±0.00**
模型组 8 6.57±1.72 5.17±2.40 12.71±5.89
尼莫地平组 10 3.80±1.79* 2.40±0.55* 6.40±2.07*
蜕皮甾酮组 9 6.27±1.30 4.75±2.10 7.78±4.28
广升麻精制物低剂量组 8 5.80±1.10 4.00±2.35 6.41±4.57*
广升麻精制物中剂量组 8 6.40±0.55 4.80±2.28 8.54±3.98
广升麻精制物高剂量组 9 5.25±2.12 2.88±1.13* 7.86±2.30*
与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
2.3.3广升麻精制物对大鼠局灶性脑梗塞范围的影响MCAO模型组大鼠脑冠状切面可见较大苍白区，与正常组织界面较明显。广升麻精制物可缩小局灶性脑缺血大鼠梗塞范围，其中广升麻精制物大剂量组与模型组相比，差异性显著(P＜0.05)。见表3。
2.3.4广升麻精制物对大鼠局灶性脑梗塞范围的影响MCAO后模型组大鼠的脑含水量及脑指数与假手术组比较均有所上升，且差异显著(P＜0.05)；广升麻精制物三剂量组均可降低造模后大鼠脑含水量和脑指数，与模型组比较有显著性的差异(P＜0.05)，(P＜0.01)。蜕皮甾酮组与模型组比较无显著性的差异。
表3广升麻精制物对缺血再灌注大鼠脑指数及脑含水量的影响(n，x±s)
组别 样本数(n) 脑指数(g/100g) 脑含水量(％)
假手术组 10 0.51±0.08* 70.64±3.25*
模型组 8 0.58±0.04 74.33±1.80
尼莫地平组 10 0.51±0.07* 70.40±2.89*
蜕皮甾酮组 9 0.55±0.07 72.78±3.28
广升麻精制物低剂量组 8 0.56±0.09 71.89±1.49*
广升麻精制物中剂量组 8 0.52±0.06* 72.17±4.05
广升麻精制物高剂量组 9 0.55±0.09 71.48±1.82**
与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
三、广升麻提取物抗脑缺氧作用的实验研究
1.试验材料
1.1供试品
广升麻粗提取物，广升麻精提物。
1.2药物配制：
取广升麻粗提取物加蒸馏水配制成每ml含20mg的溶液；取广升麻精提取物加蒸馏水配制成每ml含4mg的溶液；
取亚硝酸钠4g，加蒸馏水至200ml(2％的亚硝酸钠溶液)
1.3动物：
SD大鼠，体重180-200g。
2.实验方法与结果
2.1大鼠对脑缺氧的影响
取大鼠50只，随机分为5组，每组10只，即(1)对照组：蒸馏水；(2)广升麻粗提取物高剂量组：40mg/kg；(3)广升麻粗提取物低剂量组：20mg/kg(4)广升麻精提取物高剂量组：8mg/kg；(5)广升麻精提取物低剂量组：4mg/kg；各组按上述剂量给药，于给药后一小时，腹腔注射3％的亚硝酸钠溶液，记录其死亡时间，观察大鼠脑缺氧的情况。实验数据进行t检验。结果见表4
2.2实验结果：
表4：广升麻粗提取物对大鼠脑缺氧的影响
组别 动物数 剂量 死亡时间(min)
(只) (mg/kg)
对照组 10 ---- 18.3±2.2
粗提物大剂量组 10 40 22.6±4.3
粗提物小剂量组 10 20 20.0±1.7
精提物大剂量组 10 8 22.1±5.3
精提物大剂量组 10 4 21.1±1.0
3.实验结论：
广升麻粗、精提取物均能提高机体的耐缺氧能力，与对照组比较有显著性差异。
【具体实施方式】
实施例1
广升麻精制物的制备
取广升麻细粉200克，加丙酮2000ml回流提取3次，每次1.5小时，合并滤液，减压回收丙酮至无丙酮味，残液加150ml水加热至60℃溶解，趁热滤过，滤液加石灰水调节pH＝8，加醋酸乙酯萃取3次，每次50ml，合并萃取液，加醋酸乙酯饱和的水洗涤3次，每次10ml，减压回收醋酸乙酯至无醋酸乙酯味，萃取物80℃减压干燥2小时，得2.5克广升麻精制物。
实施例2
广升麻精制物的制备
取广升麻细粉200克，加甲醇2000ml回流提取3次，每次1.5小时，合并滤液，减压回收甲醇至干，残渣加200ml水加热至60℃溶解，趁热滤过，滤液加石灰水调节pH＝9，加醋酸乙酯萃取3次，每次60ml，合并萃取液，加醋酸乙酯饱和的水洗涤3次，每次10ml，减压回收醋酸乙酯至无醋酸乙酯味，萃取物80℃减压干燥2小时，得3.2克广升麻精制物。
实施例3
广升麻精制物的制备
取广升麻细粉200克，加95％乙醇2000ml回流提取3次，每次1.5小时，合并滤液，减压回收乙醇至干(8％得率)，残渣加160ml水加热至70℃溶解，趁热滤过，滤液加石灰水调节pH＝10，加水饱和的正丁醇萃取3次，每次50ml，合并萃取液，加正丁醇饱和的水洗涤3次，每次10ml，减压回收溶剂至干，萃取物80℃减压干燥2小时，得3克广升麻精制物。
实施例4
广升麻精制物的制备
取广升麻细粉200克，加醋酸乙酯1000ml回流提取3次，每次1.5小时，合并滤液，减压回收醋酸乙酯，残液加200ml水加热至65℃溶解，趁热滤过，滤液加石灰水调节pH＝8.5，加水饱和的正丁醇萃取3次，每次50ml，合并萃取液，加正丁醇饱和的水洗涤3次，每次10ml，减压回收溶剂至干，萃取物80℃减压干燥2小时，得2克广升麻精制物。
实施例5
药物片剂
取2克广升麻精制物，粉碎过100目筛，另取淀粉25.6克、微晶纤维素6.4克、吡咯烷酮1.6克，分别粉碎过100目筛，上述原辅料混匀，加水制成软材，过30目制粒，60℃干燥2小时，30目整粒，加0.3克硬脂酸镁，混匀，压片，即得185片。