一种优化的乳酸菌和益生菌冷冻保护剂组合物 【技术领域】
本发明涉及乳酸菌和益生菌冷冻保护剂的一种最佳配方。具体来说，本发明对蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糊精等冷冻保护剂进行筛选，研究其保护效果，从而设计出一种最佳的冷冻保护剂配方，属于食品工程领域。
背景技术
发酵乳制品在乳制品中占有重要的地位，随着我国人民消费水平的提高，对发酵乳制品中的酸奶有了新的认识，使得酸奶的产量以年平均25％的速度增长，同时对乳制品的质量提出了新的要求。
冷冻保藏和冻干技术是生物学的一个重要应用技术，近年来这一技术因为“功能性食品”的快速发展而被应用于食品生产中，酸奶中的乳酸菌发酵剂的制备也常用该技术。然而，要想获得理想的冷冻及冻干效果，除工艺外，主要是筛选和使用适宜的冷冻保护剂。适宜的冻干保护剂能够使益生菌在冻干过程中保藏最小限度死亡，减轻冷冻干燥所引起的对菌体的损伤，在保存时耐受较高的温度不损害菌体的活力。因而，冻干保护剂的种类、浓度和配置方法对益生菌的保存效果有明显地影响。Harrison(1963)推荐冻干保护剂应具有以下条件：1)保护剂应含有能形成骨架的物质；2)它应含有限制剩余水分的缓冲物质；3)应含有中和羧基活性的物质；4)电解质的含量应少。
目前，有关冻干保护剂的研究主要集中在医学、生物学领域，是冻干生物学分支的主要内容之一。但是，用于生产发酵剂的冻干保护剂的研究大多属于已有的专利技术资料，而且，许多研究报告的结果差异很大。本发明对蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糊精等冷冻保护剂进行筛选，研究其保护效果，从而设计出一种最佳的冷冻保护剂配方。
【发明内容】
在选定了益生菌优良菌种之后，益生菌产品的冷冻保护剂是影响其品质与活力的重要因素。为了保证产品能经受产品制备过程中冷冻、干燥(冻干、喷雾干燥等)不良处理条件(迫协条件)的作用，使用适宜的冷冻或干燥保护剂可减少环境对菌体的损伤，从而最大限度地保证活菌数和菌活力。本发明对蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糊精、山梨醇、甘油、侧金盏花醇等13种材料对乳酸菌的冻干保护效果进行了比较研究，结果表明，海藻糖、侧金盏花醇为最佳保护剂，其次为蔗糖、麦芽糊精、山梨醇、谷氨酸钠、脱脂奶粉，以水和增菌液为基质中冻干保护效果显著，对乳球菌的保护效果优于乳杆菌，冻干菌物菌落总数与菌体产酸力有一定关系，但与乳糖酶关系不明确。根据上述结果，采用L16(45)正交试验表设计试验，(见表4)，得出冷冻保护剂最佳配方组合，该组合为蔗糖、麦芽糊精、山梨醇和谷氨酸钠，其最佳的浓度比为4∶4∶3∶4。利用该最佳配方的冷冻保护剂，测定其对菌体活力的影响(主要是产酸力的乳糖酶活力)，得到理想的效果。若在实际中使用11％的脱脂乳作为悬浮基质，则保护剂的配合水平还可下调，但同样可以达到保护效果。
【具体实施方式】
1材料与方法
1.1材料
(1)悬浮基质：生理盐水、CMR增菌液、11％脱脂乳，经105℃灭20min。
(2)供试菌种：ST-1，LB-1，LA-1，SL.
(3)冷冻保护剂：蔗糖、乳糖，葡萄糖、麦芽糊精、山梨醇、甘露醇、甘油、三聚磷酸钠、焦磷酸钠、偏磷酸钠、β-磷酸甘油二钠、谷氨酸钠、右旋糖苷，均为分析纯试剂或生化试验，谷氨酸钠为食品级，含量为99％。
(4)真空冷冻于燥机：ALPHI-5型，德国造。
(5)菌落计数培养基：CMR
(6)真空封口器与真空泵：本所自备。
1.2方法
(1)冷冻干燥方法：将添加有不同冷冻保护剂的菌悬液分装于小冻干瓶中，每瓶0.5ml，在冰柜中速冻12小时以保证形成小的冰晶和冻结完全。冻干5-6小时后逐渐升高加热板温度至15℃，以排出剩余的水分，使其冻干制品的水分含量为1.5-2.5％，然后用于测定菌落总数，水分活度，扫描和透视电镜观察菌体。
(2)菌落总数测定：按国际GB4789.2-84.测定、培养基为CMR[22]。
稀释液为灭菌
生理盐水.于37℃下，CO2浓度为10％培养36-72小时。
(3)水分活度测定：将冻干基质加于测定平皿内按上述工艺冻干后，采用Novasina
表1冷冻保护剂的筛选试验结果冷冻保护剂Cryoprotectants 浓度(W/W) Concentration Of cryoprotectants 冻干前菌数cfu /ml Total viable counts (bcforefreeze -drying) 冻干后菌数cfu/ ml Total Viable Counts (afterFreeze-drying) 存活率 (％) Survival rate(％) 水分活度 AwWater Activity海藻糖 5％ 3.5×109 4.2×109 62.0 10％ 3.5×109 2.85×109 81.34 0.423乳糖 5％ 3.5×109 1.5×109 42.00 10％ 3.5×109 1.8×109 51.00 0.450 5％ 3.5×109 1.87×109 53.00蔗糖 10％ 3.5×109 1.86×109 52.1 0.427 20％ 3.5×109 2.1×109 60.00 5％ 3.5×109 1.42×109 40.57麦芽糊精 10％ 3.5×109 1.93×109 55.14 0.462 20％ 3.5×109 2.36×109 67.43侧金盏花醇 5％ 3.5×109 2.35×109 67.14山梨醇 5％ 3.5×109 1.89×109 54.00甘露醇 5％ 3.5×109 1.22×109 35.14甘油 5％ 3.5×109 1.56×109 44.57多聚磷酸钠 5％ 3.5×109 1.36×109 38.86焦磷酸钠 5％ 3.5×109 1.29×109 36.86偏磷酸钠 5％ 3.5×109 1.15×109 32.85β-磷酸苷油钠 5％ 3.5×109 1.87×109 54.43右旋糖苷 5％ 3.5×109 1.24×109 35.43谷氨酸钠 5％ 2.5×109 1.95×109 55.71精氨酸 5％ 3.5×109 1.68×109 48增菌液 3.5×109 4.28×109 12.23生理盐水 3.5×109 7.52×109 0.22
水分活度测定仪测定。
(4)菌种活力测定：通过测定菌种产酸力来评价菌种的活力.酸度测定按GB5409-89方法测定[22]，每一冻干管中加入5ml灭菌脱脂乳(11％)于37℃培养5.5hr后测定滴定酸度OT。乳酸酶活力测定：参照潘道东论文，加入1ml缓冲液，溶解出菌粉，离心6000rpm 10min，取上清0.5ml加入ONPG3ml，混匀，于37℃水浴上反应15mln，再加入3ml1MN2CO3中止反应在420nm处测定吸光度值。
(5)冻干菌物电镜观察
A.透射电镜观察冻干菌体：挑取冻干菌物，用过滤除菌的蒸馏水浸溶，然后按3.8节的方法观察。
B.扫描电镜观察：将样品用双面胶带贴于扫描电镜样品台上，放人IB一5型离子溅射仪中，在样品表面镀一层厚度约为150A的钯一铂合金(Pd-Pt)膜，用kyky一1000B扫描电镜观察并拍摄电镜照片。
2.2结果与讨论
1.冷冻保护剂(单因素多水平)筛选试验[5-16]：
将供试菌株ST-1在CMR增菌液中培养24小时离心(3000rpm×5min)，弃上清，生理盐水洗二次后，加人灭菌的CMR培养基25ml，使其最后的菌落数为6.360×109，然后，分装为25份菌液，每份菌液加人二倍浓度的保护剂溶液，充分混匀，置于冰柜冷冻及真空干燥。其菌落计数结果见表1。
从表1发现：海藻糖对ST-1的冷冻保护作用与侧金盏花醇的保护作用相近，为最佳保护剂，但因这两种材料均是十分昂贵的糖、醇类，无法应用工业生产之中.保护作用较好的蔗糖、乳糖、麦芽糊精、山梨醇、甘油、谷氨酸钠均可用于工业生产乳酸菌发酵剂的制备。这一结果与国外许多学者的研究相近，然而测定值却低于国外的有关报导数值，究其原因，可能是菌悬液的冻结速度低，冻结温度高有关.从水分活度值可见，海藻糖与蔗糖的值较低，说明两种糖水化能力强，与细胞膜表面易形成较稳定水化保护层，使水分冻结时形成小的冰晶，提高其冷冻保护效果，这一测值与冷冻保护的结果相吻合。
2.不同悬浮基质对冷冻保护效果的影响：
牛乳(通常是脱脂乳)是一种应用较广、保护效果好的保护剂.许多冷冻保护剂添加于脱脂乳中表现的保护效果不显著，为此本试验比较了不同悬浮基质水、增菌液与11％脱脂乳的保护效果，结果见表2。
从上表可以看出，悬浮质不同，冷冻保护剂的保护效果也不同，其保护效果在以水和增菌液为基质时表现的十分显著，可以增加118-268倍(水)，5.7-13.91倍(增菌液)，1.56-3.9倍(脱脂乳)。主要原因是脱脂乳为良好的冷冻保护剂，而且测定结果是在冻干之后就测定的菌落总数。若再延长保存时间后测定菌落数可能还会表现的更为突出.因此，制备商品化发酵剂最好的悬浮基质仍是脱脂乳。应用时可适当提高脱脂乳的NFS的含量达15％-20％为宜。
表2不同悬浮基质保护效果的比较(试验菌为ST-1) 保护剂 cryoprotectanI 悬浮基质Suspension medium 生理盐水 (Saline) 增菌液 (CMRbroth) 脱脂乳(11％) Skimmilk 海藻糖(10％) 3.25×106 6.4×106 7.3×107 蔗糖(10％) 1.87×106 3.1×106 6.2×107 麦芽湖精(10％) 1.60×106 3.25×106 4.1×107 山梨醇(100％) 1.72×106 3.40×106 3.6×107 谷氨酸钠(10％) 1.43×106 2.64×106 3.12×107 空白 1.2×104 4.6×105 2.0×107
3.保护剂对不同菌种的保护作用
选取12％脱脂乳为悬浮基质，将菌浓缩悬浮液加入灭菌脱脂乳中，使其最后的菌落总数为108，然后将上述四种脱脂乳菌悬液按0.25ml的量分别分装12管(冻干管)，再加入二倍浓度的冷冻剂溶液(过滤灭菌)，涡流混合后置冰柜冻结，真空冻干后立即测定菌落总数，具体试验结果见表3。
表3保护剂对不同乳酸菌的保护作用(cfu/mi) 冷冻保护剂 Cryoprotectants ST-1 LB-1 LA-1 SL 海藻糖(10％) 8.1×108 9.8×107 5.7×108 6.6×108 (94.2％) (79.67％) (85.07％) (90.41％) 麦芽糊精(10％) 7.3×108 7.9×107 5.2×108 4.4×107 (84.9％) (64.22％) (77.61％) (60.27％) 山梨醇(10％) 6.7×108 6.7×107 3.7×108 6.1×108 (77.9％) (54.47％) (55.22％) (83.56％) 蔗糖(10％) 7.2×108 8.7×107 5.3×108 5.9×108 (83.72％) (70.73％) (79.10％) (80.82％) 谷氨酯钠(5％) 6.4×108 5.1×107 3.4×108 4.3×108 (74.4％) (41.46％) (50.75％) (58.9％) 侧金盏花醇(5％) 7.9×109 9.3×107 4.5×108 5.4×108 (91.8％) (？5.61％) (67.16％) (73.97％) 脱脂乳(12％) 4.6×108 2.96×107 2.21×108 3.24×108 (53.48％) (24.06％) (32.98％) (44.38％) 未冻干前菌落数 8.6×108 1.23×108 6.7×108 7.3×108
注射器：括号内的数据为冷干后菌体存活率(％)
表3的实验数据可以看出，各冷冻保护剂对不同菌保护作用有一定差异，其中海藻糖与侧金盏花醇对各菌种的保护作用均保持较高的水平(存活率).麦芽糊精对SL的保护效果稍差，仅为60.27％，与脱脂乳的水平相近.谷氨酸钠与其它同水平的保护剂相比其效果最差.另外，六种冷冻保护剂对嗜热链球菌和乳酸链球菌冷冻保护作用优于对乳杆菌的保护，这一结果同其他研究报导相比虽在趋势方面是相同的，但各保护剂对保加利亚乳杆菌的保护效果要高于同类研究报告的数据[12]，这可能与该菌对冷冻及真空干燥的应激处理抗性较强有关。有关乳酸菌对热、冷刺激抗性在本试验未做更详细的比较研究。但本项试验中选用的ST-1与SL均为粘性较大的菌株，其生长中产生的胞外多糖对菌体抗冷，热抗性可能发挥看一定的促进作用。
4.最佳保护剂优化配方设计
根据菌体冻伤及冷冻保护机理，结合各保护剂的保护效果与作用特点、保护剂的来源、性状，选取A、B、C、D四种保护剂为试验因素，设立四个浓度水平，采用L16(45)正交试验表安排实验，具体的试验设计、实验结果及统计分析见表4。
从表4的分析可见，A、B、C三因素的极差大于误差项的极差，而C因素的极差值却小于误差极差值，说明A、B、D项对菌落总数的影响是显著的，而C因素的影响在实验水平内不显著，但仍然有一定的保护作用.四因素影响程度大小依次为A-D-B-C，最佳配方组合为A4B4C3D4，本实验为了使实验结果及各因素的影响更显著，选取的悬浮基质为生理盐水，若在实际中使用11％脱脂乳，则各保护剂的配合水平还可下调，同样可以达到保护效果。
5.冷冻保护剂对菌体生物学特性的保护作用
在筛选保护剂时，一般均采用菌落总数为最为可靠的评价指标，但是菌落总数的测定工作繁杂，极易造成污染而使菌落无法计数，因而本试验测定了保护剂对菌体活力的影响(主要是产酸力和乳糖酶活力)具体结果见表5。
表4冷冻保护剂优化配方正交试验设计与结果分析表 A 蔗糖 B 麦芽糊精 C 山梨糖 D 谷氨酸钠 E 菌落总数 TotalviablecountsX ×10(cfu/ml) 1 1 1 1 1 1 7.8 2 2 2 2 1 2 12.4 3 3 3 3 1 3 32.5 4 4 4 4 1 4 33.4 5 3 2 1 2 4 24.5 6 4 1 2 2 3 16.8 7 1 4 3 2 2 5.6 8 2 3 4 2 1 17.6 9 4 3 1 3 2 35.6 10 3 4 2 3 1 38.4 11 2 1 3 3 4 24.0 12 1 2 4 3 3 6.5 13 2 4 1 4 3 26.8 14 1 3 2 4 4 18.3 15 4 2 3 4 1 36.5 16 3 1 4 4 2 24.5 K1 38.2 73.1 94.7 86.1 100.3 K2 80.8 79.9 85.9 64.56 78.1 K3 119.9 104 98.6 104.5 82.6 K4 122.3 104.2 82 106.1 100.2 k1 9.55 18.28 23.68 21.53 25.08 k2 20.2 19.98 21.48 16.14 19.53 k3 29.88 26 24.65 26.13 20.65 k4 30.58 26.05 20.5 26.53 25.05 R 21.03 7.77 4.15 10.39 5.55
表5的结果表明，冷冻保护剂对乳酸菌ST-1的产酸力、乳糖酶释放量有一定影响。本试验曾选取发酵8.5hr为测定时间，结果使各试验组的酸度无明显差异，其原因是受伤的菌体在短时间得以修复而恢复了产酸力。以5.5hr发酵时间则可揭示各试验组的活力差异，产酸效果与菌落总数测定值基本一致。但是，冷冻保护剂对菌体乳糖酶的影响不大，酶活性与产酸力，菌存活率相差较大。从另一侧面也说明真空冷冻干燥法对菌体破裂性损伤很小.产酸力与菌存活率之间虽有一定相关性，但目前尚难以确定精确的相关关系。因此，在评价冷冻保护剂保护效果时仍以菌落总数值为判定标准。产酸力仅可作为参考指标。
表5冷冻保护剂对菌体产酸力与乳糖酶活力的影响 保护剂 Cryoproteetant 浓度 Concentration 滴定酸度 OTTiratableacidity 乳糖酶活力(A420)Activity of Lactase(ONPG A420) 蔗糖 10％ 28 0.008 海藻糖 10％ 31 0.041 侧金盏花醇 1.4％ 27 0.040 山梨醇 1.4％ 26 0.007 甘露醇 1.4％ 25 0.023 三聚磷酸钠 2.0％ 26 0.027 焦磷酸钠 2.0％ 21 0.040 β-磷酸甘油钠 2.0％ 28 0.027 麦芽糊精 10％ 31 0.010 乳糖 10％ 25 0.027