一种甲状腺疾病辅助诊断仪及其应用 【技术领域】
本发明涉及疾病诊断仪器，具体地说是一种甲状腺疾病辅助诊断仪及其应用。
背景技术
甲亢和甲减是最常见的两种甲状腺疾病，分别是由于体内的甲状腺激素分泌过多或严重不足而引发的内分泌疾病。甲亢较为常见，且多见于女性；有报告称，甲亢患病率占女性人口的2％，每年新发病率为2/1000-3/1000妇女人口，且有逐渐增加的趋势。甲亢使机体耗氧量增加，一方面是适应代谢过旺的需求，另一方面却引起了体内氧自由基的增加[文献1.Videla LA，SirT，WolffC；Free Radic Res Commun，1988，5：1-10]。辅酶Q10无论是作为细胞能量ATP生成过程中必不可少的质子转递介质，还是作为体内自由基清除剂，在甲亢期间，其在机体组织中的含量都会显著降低[文献2.Krishnamurthy S，Prasanna D；Acta Vitaminol Enzymol，1984，6：17-21；文献3.Pandolfi C，Ferrari D，Stanic I，Pellegrini L；Minerva Endocrinol，1994，Sep；19(3)，139-42，Italian.；文献4.Bianchi G，Solaroli E，Zaccheroni V，Grossi G，Bargossi A M，Melchionda N，Marchesini G；Horm Metab Res，1999，31：620-6242-4]。甲减的情况正好与之相反。正是由于辅酶Q10与甲状腺激素之间存在线性负相关的关系，因此可以把辅酶Q10作为甲状腺激素分泌的一个指标，通过检测辅酶Q10的含量来检测体内甲状腺激素的分泌状况，从而辅助诊断甲亢和甲减这两种常见甲状腺疾病。其次，通过动态监测病人体内Q10的含量变化可观察病人的恢复状况，监测整个治疗过程，从而指导病人更好的用药，选择更好的治疗方案。从这一点上看，检测血浆辅酶Q10的含量具有重要的医学意义。
对辅酶Q10的测定已有很多报道：光度法[文献5.Joanna K，Bozena M，JaninaP J；Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1998，17，1345-1350；文献6.Readlieu E，Nilsson I M，Farley T M，Folkers K；AnalBiochem，1968，23：132]、色谱法[文献7.Wang Q，Lee B L，Ong C N；Journal ofChromatography B，1999，726：297-302；文献8.Zhiri A，Belichard P；Journal ofLiquid Chromatograpy，1994，17(12)，2633-2640；文献9.Kommuru T R，Khan MA，Ashraf M，Kattenacker R，Reddy I K；Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis，1998，16：1037-1040；文献10.Grossi G，Bargossi AM，Fiorella P L，Piazzi S，Battino M，Bianchi G P；Journal ofChromatograpy，1992，593：217；文献11.Finckh B，Kontush A，CommentzJ，Hubner Ch，Burdelski M，Kohlschutter A；Anal Biochem，1995，232：210；文献12.Kaplan P，Sebastianova N，Turiakova J，Kucera I；Physiol Res，1996，45：39；文献13.Vadhanavikit S，Sakamoto N，Ashida N，Kishi T，Folkers K；AnalBiochem，1984，142：155-158]、伏安法[文献14.Simona C L，Iulia G D，GabrielL R，Hassan Y.A E；Instrumentation science & Technology，2001，29(2)，109-116]、化学发光法[文献15.Battino M，Ferri E，Girotti S，Lenaz G；AnalyticaChimica Acta，1991，255：367-371]、荧光法[文献16.Rokos J A S；AnalBiochem，1973，56：26]、电子磁共振法[文献17.Long Y T，Yu Z H，Chen H Y；Electrochem Commun.1999，1，194]等等，其中最成熟最常用地还是液相色谱法。血浆样品基体复杂，分析前常常需要经过繁琐的预处理[文献9，10，12，13]。Vadhanavikit等人[文献13]用TLC萃取和净化血样，该方法精度较差，回收率也有待提高。SPE集纯化和富集于一体，适用于复杂样品的预处理。Kommuru[文献9]将硅胶SPE柱引入血浆样品的纯化过程，很好地去除了萃取液中一些弱极性的脂溶性杂质，但强极性杂质的存在使得色谱图中溶剂前沿仍然很高。文献[文献10，12]利用两种不同极性的SPE柱(硅胶柱和C18柱)依次去除血浆中的弱极性和强极性杂质，使血样得到很大程度的净化，该方法出峰干净，有效地保护和延长了柱寿命；但是，两步固相萃取费时费力，而且，成本较高，很不适于临床上大批量分析。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种甲状腺疾病辅助诊断仪及其应用，其集样品处理与分析于一体的自动化程度较高的分析系统，准确高效地检测人体血浆辅酶Q10含量，为甲亢和甲减病人的诊断和治疗提供有益的指导。
为实现上述目的，本发明利用了柱切换技术，建立了一套两柱相连的液相色谱分析系统，该系统包括以下几个组件：三个高压泵、一个自动进样器、一个紫外-可见检测器、一个系统控制器、一个色谱工作站、一个六通阀、色谱分析柱A和色谱分析柱B；主要由高压泵A(1)、高压泵B(2)、高压泵C(3)、自动进样器(4)、六通阀(5)、十八烷基键合硅胶柱A(6)、混合器(7)、十八烷基键合硅胶柱B(8)和紫外-可见检测器(9)组成；六通阀(5)的⑥位通过自动进样器(4)与高压泵A(1)连接，六通阀(5)的①位和④位分别接亲和十八烷基键合硅胶柱A(6)两端，六通阀(5)的⑤位接废液排出管路，六通阀(5)的③位与混合器(7)出口相连，高压泵B(2)和高压泵C(3)与混合器(7)入口相连，六通阀(5)的②位与十八烷基键合硅胶柱B(8)一端相连，十八烷基键合硅胶柱B(8)的另一端通过紫外-可见检测器(9)与废液排出管路相连。
甲状腺疾病辅助诊断仪的应用，其通过对血浆中辅酶Q10含量高低的检测辅助诊断甲状腺疾病，具体步骤如下，
1)取血浆加入正丙醇离心脱脂除蛋白后，将上层清液直接上样分析；
2)将分析样品通过自动进样器直接上样，六通阀处于“LOAD”位置，选用纯甲醇淋洗十八烷基键合硅胶柱A，使得血浆中辅酶Q10保留在柱A上；
3)继续用纯甲醇冲洗柱A，血浆中残存的一些杂质经过柱A流入废液排出管路；
4)六通阀处于“INJECT”位置以甲醇和异丙醇作流动相，血浆中辅酶Q10组分从柱A上洗脱下来，经过六通阀到达十八烷基键合硅胶柱B的最上端，完成柱A和柱B间在线传递全过程；
5)六通阀重新回到“LOAD”位置，在柱B上实行甲醇和异丙醇等度淋洗程序，达到分离测定辅酶Q10的目的；
6)按照上述步骤便可对人体血浆辅酶Q10含量进行准确的测定，通过对正常人、甲亢及甲减三组人群体内Q10含量的监测，可掌握人体血浆含量的大致水平，并通过与正常人比较实现了是否患甲状腺疾病的辅助诊断(从而可辅助甲亢或甲减的准确诊断)；如果含量显著高于正常人平均值则很可能为甲减；如显著低于正常人平均值，则很可能为甲亢；否则则为正常。
类似上述的原理也适用于甲状腺疾病治疗效果的判断；按照步骤1)～5)通过对人体血浆辅酶Q10含量动态监测，可确切的掌握病人的恢复状况，为选择和确定新的治疗方案提供辅助依据。
所述柱A为预处理柱，长度10～30mm，内径4～4.6mm；柱B为分析柱，长度100～250mm，内径4～4.6mm；纯甲醇的流量为0.3～1ml/min，所述甲醇和异丙醇的体积比为15∶1～1∶1。
本发明具有如下优点：
1.方法简单。本发明简化了辅酶Q10的萃取过程，选用正丙醇既能脱脂去蛋白又能定量萃取辅酶Q10，避免了以往常采用的先用醇脱脂后再用正己烷萃取的繁琐过程。血浆基体成分复杂，若不经任何处理直接将萃取液进样分析，常存在以下问题：溶剂前沿高，杂质颗粒易堵塞柱子，强保留物质使柱寿命大大降低，此外，杂质往往干扰Q10的测定。文献多采用TLC技术[文献13]或SPE技术[文献9，文献10，文献12]净化和富集血样。这些方法操作繁琐，费时费力，并且测定精度较差。本发明的样品预处理过程只需用正丙醇脱去血浆脂蛋白，离心分离后便可直接进行分析；采用液相色谱自动在线分析系统用于血浆中辅酶Q10的测定，实现了从样品的自动预处理、自动进样和自动分离分析几大功能，大大简化了整个分析过程，特别适宜于临床上大批量分析；由于该方法全由计算机自动控制，保证了样品测定间条件的完全一致，因此可直接用外标法准确定量，免去了寻求合适内标的麻烦。
2.检测精度高。本发明利用柱切换技术，研制出一种新型的自动在线系统，该系统分离分析血浆辅酶Q10实现了从样品预处理到分离分析全过程的自动化，避免了费时费力的样品预处理步骤，同时也避免了在样品预处理过程中产生的人为操作误差，大大提高了分析结果的准确度和精确度；所有操作过程通过一个系统控制器，由计算机控制，自动化程度较高，适于临床大批量检测；此外，该系统有效地避免了实验过程中带来的人为误差，保证了测定过程的准确度和精确度(测定精度较高，日内RSD为0.4％，日间RSD为3％)。用该方法测得的正常人血浆辅酶Q10的含量水平与甲亢病人的含量水平有显著性差异(P＜0.05)，因而在临床上可辅助甲亢及甲减病历的诊断。
3.成本低。该系统采用自动在线装置净化血样，分析柱的使用寿命得到了保证，同时，该系统避免了用固相萃取小柱净化血样，成本大大降低。
4.应用效果好。本发明基于多维液相色谱和辅酶Q10，将辅酶Q10含量作为甲亢、甲减病例临床判据指标，可以弥补了FT3及FT4作判据的不足；本发明的甲状腺疾病辅助诊断仪，通过特定的缓冲液和分析方法，可自动准确高效地检测人体血浆辅酶Q10的含量，从而有效地辅助甲亢和甲减两种常见甲状腺疾病的诊断；通过病人体内血浆辅酶Q10的动态监测，可及早地掌握病人的恢复状况，为选择和确定新的治疗方案提供可靠的依据。
【附图说明】
图1为本发明辅助诊断仪的流程示意图。
图2为本发明辅助诊断仪中六通阀处于“LOAD”切换位置示意图。
图3为本发明辅助诊断仪中六通阀处于“INJECT”切换位置示意图。
图4为血浆辅酶Q10的液相色谱在线系统分离谱图。峰1.辅酶Q10.操作条件：色谱分析柱1(4.6mm i.d×20mm)、色谱分析柱2(4.6mm i.d×150mm)、检测波长：275nm，进样量：400ul，其余条件见表1。
【具体实施方式】
实施例1
1.本发明的仪器可实现血样的自动预处理、自动进样和辅酶Q10组分的自动分离和定量；它主要通过如下步骤来完成；
1)取体积0.3ml的新鲜血浆样品，加入1ml的正丙醇(两者的体积比可为0.2∶1至0.4∶1均可)离心脱脂除蛋白后，将上层清液直接上样分析；
2)当六通阀处于“LOAD”位置(图2)，通过自动进样器将分析样品直接进样，选用纯甲醇淋洗十八烷基键合硅胶柱A，使得血浆中辅酶Q10保留在柱A上；
3)继续用纯甲醇冲洗柱A，血浆中残存的一些杂质经过柱A流入废液排出管路废液瓶中至；
4)当六通阀处于“INJECT”位置时(图3)，以甲醇和异丙醇作流动相，血浆中辅酶Q10组分从柱A上洗脱下来，经过六通阀的3-4-1-2到达十八烷基键合硅胶柱B的最上端，完成柱A和柱B间在线传递全过程；
5)六通阀重新回到“LOAD”位置，在柱B上实行甲醇和异丙醇等度淋洗程序，达到分离测定辅酶Q10的目的；在进行下一轮血样分析之前，用纯甲醇重新活化色谱分析柱1。
6)按照上述步骤便可对人体血浆辅酶Q10含量进行准确的测定，通过对正常人、甲亢及甲减三组人群体内Q10含量的监测，可掌握人体血浆含量的大致水平，从而可辅助甲亢或甲减的准确诊断；通过动态监测，可确切的掌握病人的恢复状况，为选择和确定新的治疗方案提供可靠的依据。
2.在本发明构建的辅助诊断仪上，采用表1(其中，流动相A为纯甲醇溶液，流动相B为甲醇和异丙醇体积比9∶1的混合液)及图4所示分析条件，对血浆样品中的辅酶Q10组分进行分离测定(图4)。
表1 阀切换时间及流动相流速变化时间t(min) 0-4 4-6.5 ＞6.5流动相A(ml/min) 0.5 0 0.5流动相B(ml/min) 1.5 1.5 1.5
对6个甲减病人、39个甲亢病人及76个正常人血浆中的辅酶Q10进行测定，正常人体内的辅酶Q10含量为0.67±0.25mg/l(mean±SD)，甲亢病人为0.42±0.17mg/l(mean±SD)，甲减为0.89±0.17mg/l(mean±SD)。对甲亢病人和正常人血浆辅酶Q10含量进行统计处理，二者的含量具显著性差异(P＜0.05)。
3.对比：甲状腺激素在体内代谢时间较长，因此它不能作为甲亢疾病的灵敏指标。有些病人已出现甲亢症状，体内FT3，FT4值仍保持正常，比如：有一例病人，已出现甲亢症状，经医学检测FT3＝6.1，FT4＝22，TSH＝0.596，单从这组数据无法断定他是否甲亢。通过检测血浆辅酶Q10含量，其值为0.33mg/l，明显低于正常人，因而可辅助确诊为甲亢。
4.检测血浆辅酶Q10的含量可尽早地了解病人的恢复状况。有一例病人，其在甲亢时和治疗一段时间后的检测情况见表2，从该病人的FT3，FT4，TSH很难判断他是否恢复，但从辅酶Q10的含量变化就非常清楚了，事实上，该病人复查时已无任何不适症状。
表2 一病人甲亢前后的生理数据比较