本发明关于制备5，10-甲川-（6R）-四氢叶酸[5，10-CH-（6R）-THF，“6R-I”]生物活性四氢叶酸的方法，尤其是5-甲酰-[5-CHO-（6S）-THF]和5-甲基-6S-四氢叶酸[5-Me-（6S）-THF]及其盐，尤指在生理上有很好耐受性的钙、镁、钠和钾盐。 所说的（6S）-四氢叶酸盐[（6S）-5，6，7，8-四氢蝶酰-L-谷氨酸盐是叶酸的充分稳定的自然生物活性形式（叶酸辅助因素）。
5-CHO-（6S）-THF是亚叶酸（＝柠胶链球菌的生长因子）。
在有机体中5-CHO-（6S）-THF借助5，10-亚甲基-（6R）-THF被转化成5-Me-（6S）-THF。
四氢叶酸盐含2个不对称中心，当它们由叶酸[N-（蝶酰）-L-谷氨酸]合成时，谷氨酸剩余物中所含的手性碳原子呈L形式，而通过蝶酰根5，6位上的双链氢化作用在6位[C（6）]上生成的手性碳柱呈外消旋的（6R，S）形式。因此，所有合成的四氢叶酸盐是由两种非对映体的1∶1混合物构成。
人们发现，天然存在的四氢叶酸盐（例如存在于肝中的）只呈一种非对映形式，即：5-CHO-THF呈5-CHO-（6S）-THF形式，5-Me-THF呈5-Me-（6S）-THF形式。
按照以下文献[J.C.Fonteciua-Camps etal，J，Amer、Chem.Soe.101（20）、6114/5（1979）〕所述，在天然的四氢叶酸C（6）位绝对构型根据顺序法则规定为S，在天然5，10-亚甲基-四氢叶酸和5，10-甲川-四氢叶酸的C（6）位，绝对构型规定为R（R、Kalber-matten et al.Helv.Chin Acta64（8），2627（1981），注脚4）。
5-CHO-（6R、S）-THF（亚叶酸）以其钙盐形式（甲酰四氢叶酸）作为一种药物用于治疗Megaloblastic-缺乏的贫血症，作为一种解毒药来增加叶酸对抗物的耐受性，尤其是治疗癌症中的氨基蝶呤、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶（血癌抢救）和治疗自身免疫疾病诸如PsoHasis和类风湿关节炎并且在化学处治中可提高某种杀寄生虫药的耐受性诸如三甲氧苄二氨嘧啶-硫代甲氧基吡咯。
类似地可使用5-甲基-（6R、S）-四氢叶酸钙。
施用5-CHO-（6R、S）-THF之后这种非对映异构体混合物（6S）部分迅速转变成5-Me-（6S）-THF，而（6R）部分未代谢（见J.A.Staw等人，癌症研究44，3114-3119（1984））。
此外，5-CHO-（6R）-THF抑制了某种引起C1转变的酶和并由此抑制了四氢叶酸的生化作用[见R.Pleary etal.，Biochem、Biophys.Res、Conmun.56，484（1973）;V.F.Scott等人，ibid.14，523（1964）：G.K.Smith et al.，生物化学，20，4034，（1981）〕。因此，用（6S）-四氢叶酸盐替代（6R、S）-四氢叶酸也应该有同样的治疗优点。
所以，需要用天然地（6S）形式来替代非对映体混合物，这种混合物在每种情况下都含（6S）和（6R）形式，而且迄今一直在使用着。
已经做了许多偿试来分解四氢叶酸并进行了非对映体的合成和拆分成生理活性形式。
例如D.Cosulioh et al.，J.Amer.Chem.Soe.74，4215-16（1952），美国专利说明书2，688，018（1954年8月31日）已经试图用一种水溶液分级结晶5-CHO-（6R.S）-THF碱土金属盐（如钙和锶盐）从而拆分[亦见J.C.Fonteciua-Camps-et al.J.Amer.Chem.Soc 101，6114（1979）]。
在D.Cosulich等人公开的条件下是不能完成所要求的拆分的，例如，从PH值为7-8的水中结晶出的5-CHO-（6R.S）-THF的钙盐总是得到6R.S形式，利用手性HPLC柱中的色谱分析以及根据旋光性也能定量地证明这一点。在这方面，是用5-CHO-（6R.S）-THF的粗钙盐还是用纯的钙盐来进行结晶无关紧要，总能得到（6R.S）形式。不能通过用5-CHO-（6S）-THF的可信的碱土金属盐引晶5-CHO-（6R.S）-THF的碱土金属盐的过饱和水溶液的方式拆解和富集（6S）形式。
已试图用色谱法对非对映体对拆分[见J，Feeney等人，生物化学20，1837（1981）]，此外，在二氢叶酸盐还原酶存在时，通过二氢叶酸盐的立体有择还原进行（6S）异构体的制备「见L.Rees等人，Tetrahedron42，117（1986）L.Rees等人，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1987，470和EP-A20，266，042已经描述了一种能产生少量的5-CHO-（6S）-THF和5-CHO-（6R）-THF的（6R.S）-THF的分离方法。该方法包括使（6R.S）-THF与例如（-）-氯甲酸基酯反应从而得到非对映的5-（-）-基氧基羰基四氢叶酸，用正丁醇重复处理分离这些物质，在甲酸和乙酸混合物中加热溴化氢饱和溶液所得非对映体，水解之后形成5-甲酰-（6S）和-（6R）-THF，最后从钙盐形式分离出后者。
此方法既费力又困难，而且需要用毒性很大的碳酰氯来制备手性试剂。另外，起始物质（6R，S）-THF极不稳定。由于在大于50℃时消除了ACDH中HBr辅助基，部分消除了谷氨酸，并形成了很难除掉但又能除掉的副产品。用这种方法制成的（6S）-亚叶酸往往成本很高以致于几乎不能用它来替代（R.S）-四氢叶酸盐。
用工业上可用的方法来获得（6S）-四氢叶酸迄今尚未披露，因此，本发明的目的仍要找出一种既简单易行又适用于工业过程制备5-CHO和5-Me-（6S）-THF的方法。
采用已知的方法，用叶酸能够制备5-CHO和5-Me-（6R.S）-THF。用甲酸甲酰化生产10-甲酰-叶酸（10-CHO-FA），后者可随后经催化氢化成10-甲酰-四氢叶酸（10-CHO-THF）。5，10-甲川-四氢叶酸（I：5，10-CH-THF;脱水四氢叶酸）能用后者通过脱水得到。
在此式中，×是任何所要求的一价阴离子，例如Cl或Br。I也可以是酸加成盐的形式，例如，缩写式为（5，10-CH-THF）Cl.HCl的氯化物氢氯化物。借助于阴离子的交换剂，相应的内盐（I，无X，Coo代替CooH）能用后者形式得到。
所需的四氢叶酸能很容易用I制备：水解/转甲酰化得到了可以钙盐形式分离出的5-甲酰-四氢叶酸（5-CHO-THF）[见瑞典专利说明书305，574（CYANAMID）]。用硼氢化钠还原得到了5-甲基-四氢叶酸（5-Me-THF;甲亚叶酸），它可以钙盐或镁盐形式分离出（见瑞典专利说明书649，550（EPROVA）。
业已惊奇地发现，（6R，S）-I或其盐（6R-I）或其酸加成盐（缩写式为5，10-CH-（6R）-THFJ+X-·HX）或其内盐的溶液分级结晶可导致以这样的方式进行结晶以使晶体含大于90%的（6R）-I。（6R）-I又非常适用于制备所需的四氢叶酸盐：用它水解可获得5-CHO-（6S）-THF，还原能得到5-Me-（6S）-THF。
因此，关键问题是在Ⅰ阶段中进行非对映体的分离。
由于Ree等人，J.Chem.Soc.Chem.Commune.1987.470，在THF分子中引入额外的手性中心，使得这种拆分成为可能，所以这种分级结晶的成功使人意想不到，并且由此引入一个相当复杂的情况。
因此本发明涉及一种制备5，10-甲川-（6R）-，5-甲酰-（6S）-和/或5-甲基-（6S）-四氢叶酸及其盐的方法，其特征在于5，10-甲川-（6R，S）-四氢叶酸，及其内盐和/或它的强酸盐之一通过分级结晶进行非对映体的分离，需要的话，所得的5，10-甲川-（6R）-四氢叶酸用一种水解剂处理转化成5-甲酰-（6S）-四氢叶酸或用一种还原剂处理转化成5-甲基-（6S）-四氢叶酸，和/或所得的游离酸用一种碱处理转化成它的一种盐。
本发明的非对映体的分离最好用至少一种极性溶剂通过分级结晶来进行。
适宜的极性溶剂的实例是：低级脂族羧酸，尤其是甲酸以及乙酸，挥发性水溶性酰胺，如甲酰胺，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，1-甲基吡咯烷酮，2-哌啶子基，4-甲酰马啉，1-甲酰吡咯烷酮，1-甲酰哌啶和四甲基脲，亚砜或砜如二甲基亚砜，二甲基砜或砜（1，4-亚丁基砜）浓强酸水溶液如20～35%的强盐酸或其它无机酸水溶液，诸如，氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸或磷酸，或强有机酸溶液如草酸、马来酸、三氯乙酸、三氟乙酸、甲烷磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸和樟脑磺酸。最好是甲酸。
然而，上述溶剂的混合物是适宜和推荐的，特别是一种上述有机溶剂与一种无机酸的水溶液或水（结晶剂）的混合物。也可以使用一种浓无机酸水溶液（例如浓盐酸）作为溶剂，少量的水作为结晶剂。如果水量接近或甚至等于浓无机酸水溶液的量，则[5，10-（6R，S）-THF]+X-·HX就会析出，这就是说未发生溶解。优选的溶剂是甲酸，优越的结晶剂是强酸水溶液，特别是稀释的盐酸，氢溴酸、硫酸、磺酸、硝酸、也可用冰醋酸代替强酸水溶液作为结晶剂。
通常，得到的最终产物是一种5，10-甲川-（6R）-四氢叶酸盐Ⅰ与相应的酸HX的酸加成盐。例如，如果浓盐酸（结晶剂）加到一种（6R，S）-I（X＝Cl）的氢氯化物与甲酸（溶剂）的浓酸液中，则（6R）-I就会以氯化物氢氯化物形式析出，其缩列式为5，10-CH-（6R）-THFJCl·HCl，其中（6R）含量约为90%。这种（6R）含量可通过进一步再结晶（例如用甲酸/盐酸进一步再结晶）而得到提高。例如，如果将氢溴酸加到一种（6R·S）-I（X＝Br）的氢溴化物溶液中或加到（6R·S）-Ⅰ与甲酸的内盐溶液中，（6R）-I（X＝Br）的氢溴化物也可用类似的方法获得。
酸的浓度和溶剂和结晶剂的量的比率可以在很宽的范围内变化。推荐5，10-CH-（6R·S）-THF的浓度在10～40（重量）之间，溶剂与结晶剂之间的比率在10∶1和1∶1之间。结晶剂中的酸的浓度可以在0～12当量之间。一般来说，如果结晶剂的用量相当大，拆分效果很差的情况下，达到很高的产量。另一方面，如果结晶剂的用量很低，尽管产率降低了而拆分效果会更高。最佳的反应条件取决于预期的目标、具体地原料、溶剂和结晶剂，它们可通过系统试验不费力的测定出。
如果原料是[5，10-CH-（6R·S）-THF]X·HX形的酸加成盐，甚至可仅通过用一种溶剂如甲酸加水，甚至不加任何结晶剂的条件下进行分级结晶便会得到非对映体，形成[5，10-CH-（6R）-THF]X·HX。
通常，所需的（6R）化合物先结晶出来，非对应体（6S）化合物便浓缩在滤液中。在少数情况下，例如当5，10-CH-（6R·S）-THF内盐用甲酸/水结晶时或者当[5，10-CH-（6R·S）-THF]三氯乙酸酯用二甲亚砜结晶时，相比之下，（6S）非对映体先析出，而（6R）非对映体可以滤液中分离出。
本发明的一个特别优选的实施方案包括将-强酸水溶液（如盐酸水溶液）加入到一种通过叶酸甲酰化成10-甲酰基-叶酸然后催化氢化合脱氢原地制备的（6R·S）-I的甲酸溶液中，采用这种方法可以引导呈式[5，10-CH-（6R）-THF]X·HX的酸加成盐（如相应的氯化物盐酸盐）形式的（6R）非对映体结晶。
这种方法可简单容易特别是经济便利地制备出（6S）-四氢叶酸盐，特别是5-CHO-（6S）-THF和5-Me-（6S）-THF。
适用作生理上耐受性良好的盐主要是钙、镁、钠和钾盐。
一般来说，镁盐的特征在于与钙盐相比更溶于水。这便允许了采用镁盐时很宽的剂量范围。
完全没有必要从5，10-CH-（6R）-THF或其酸加成盐中除去半随物质（6S）形态。在每种情况下，残余量的“不正常”的非对映体可通过水解或还原转化成5-CHO-（6S）-THF或5-Me-（6S）-THF并被分离出从而得到消除。
实施例1、5-甲酰基-（6S）-四氢叶酸钙;1·1分级结晶5，10-甲川-（6R·S）-四氢叶酸
[脱水甲酰四氢叶酸，（6R·S）-I）〕
在35℃下，将300ml2N盐酸加到1000克[5，10-甲川-（6R·S）-四氢叶酸〕氯化物·盐酸化物·二水合物（[5，10-CH-（6R·S）-THF]Cl·HCl·2H2O）于2升甲酸的溶液中，并将混合物缓慢冷却到20℃任其结晶。几小时后分离出的产物被滤出，用2N盐酸洗涤，最后得到（6R）-I，使用手性柱通过HPl（测定（Resolvosil BSA7），它含有91.5%的[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl非对应体。
[α]35D＝+3.6°（C＝1，于DMSO/2NHCl8∶2）
1.2转化成5-甲酰基-（6S）-四氢叶酸钙（转甲酰化）
按1·1的方法得到的120克晶体溶解在氢氧化钠水溶液中，在PH为5.5～6.5缓和沸腾几小时然后冷却，加入过量的氯化钙。析出的5-CHO-（6S）-THF的钙盐用水重结晶。得到5-甲酰基-（6S）-四氢叶酸钙·5H2O。用手性柱，通过HPLC测定，5-CHO-（6S）-THF钙含量≥99%面积
[α]22D＝-15°（以无水Ca盐计：C＝1.5%于水中）
实施例2.5-甲基-（6S）-四氢叶酸和5-甲基-（6S）-四氢-叶酸钙
2·1分级结晶原地得到的（6R，S）-I
在甲酸中催化氢化10-甲酰叶酸得到的溶液经蒸发到含量约为30～35%得到提浓。在35℃下，约0.4重量份的提浓的（35%强度）盐酸加到1重量份的提浓液中。令混合物冷却到室温并在5～10℃静置过夜，滤出析出的晶体并用少量冰冷盐酸和丙酮洗涤，得到[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl];（6R）含量：90%。
2·1重结晶粗的[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl
于35℃，按2.2Kg晶体溶解在3升甲酸中，加入450ml2N盐酸，混合物逐渐冷却到室温并在0～5℃保温几小时。滤出形成的晶体并用稀盐酸和丙酮洗涤。得到[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl·2H2O，（6R）含量为98%。
2.3 5-甲基-（6S）-四氢叶酸「5-Me-（6S）-THF）
按2.2中得到的30克[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl，2H20引入25克氢硼化钠和3.4克tris试剂于300ml水构成的溶液中，混合物搅拌过夜。所得溶液用盐酸酸化到PH＝4，然后5-Me-（6S）-THF以二水合物的形式析出。
2·4 5-甲基-（6S）-四氢叶酸钙
按2.3中得到的一半5-Me-6S）-THF·2H2O溶解在最低含量的氢氧化钠稀溶液中，用活性炭和过滤助剂处理该溶液和过滤，加入过量的氯化钙。形成的5-甲基-（6S）-四氢叶酸钙水合物逐渐析出。在0～3℃下令产物结晶，然后滤出并用水重结晶。
[α]25D＝+40°（以无水化合物计;于水中C＝1.5%）
当按实施例1.1得到的[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl按实施例2.3/2.4进一步反应时也可得到同样的化合物。
实施例3、5-甲基-（6S）-四氢叶酸镁
按实施例2.3得到的另一半的5-Me-（6S）-THF逐渐溶解在所需最低含量的2N氢氧化钠溶液中，加入过量的氯化镁。加入乙醇诱导镁盐结晶。这种新化合物易溶于水。
实施例4、[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl
4·1 用甲酸分级结晶[5，10-CH-（6R，S）-THF]Cl·HCl
25克[5，10-CH-（6R，S）-THF]Cl·HCl2H20于35℃溶解在50ml甲酸中，溶液冷却到0℃并用按实施例2·2中得到的微量产物引晶。几小时后得到的「5，10-CH-（6R）-THF」Cl·HCl被滤出;（6R）含量为79%。补充的重结晶使（6R）含量提高到90%以上。
4·2 加水选择性结晶[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl
25克[5，10-CH-（6R，S）-THF]Cl·HCl·2H20于35℃溶解在50ml甲酸中，加入5ml水，并将混合物冷却到0℃并用可信的（6R）异构体引晶，静置过夜后得到的[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl被滤出;（6R）含量为：86.5%
4·3用盐酸水溶液选择性结晶[5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl
10克[5，10-CH-（6R，S）-THF]Cl·HCl·2H20于50℃溶解在90ml浓盐酸中，溶液用10ml水稀释，同时用可信物质引晶。[5，10-CH-（6R）-THF）Cl·HCl·2H2O结晶出;（6R）含量：87%
实施例5 制备5，10-CH-（6R，S）-THF内
盐，5，10-CH-（6R，S）-THF强酸
盐和[5，10-CH-（6S）-THF]Br·
HBr
5·1 5，10-CH-（6R，S）-THF的内盐
使200克[5，10-CH-（6R，S）-THF]Cl·HCl于100ml甲酸的溶液通过一个装有1000ml阴离子交换树脂（IRA-68）的柱。减压蒸发流出物。残物溶于甲酸中，并将溶液分成若干等分。
将乙醇加到一份溶液中，然后内盐析出，可见到这种盐是黄色，且在水中、有机溶剂、甚至在极性溶剂中（甲酸例外）溶解度相当小。
当加入一种低级醇（如乙醇）或酮（如甲基丙基酮）引导按实施例2·1原地得到的5，10-CH-（6R，S）-THF的溶液结晶时，也可得到5，10-CH-（6R，S）-THF内盐。
5·2 5，10-CH-（6R，S）-THF强酸盐
在甲酸中过量的所需酸加等份的5·1中得到的溶液中，加乙醇以便沉淀。滤出所得盐
用这种方法制备的下物质：
[5，10-CH-（6R，S）-THF]Br·HBr，
[5，10-CH-（6R，S）-THF]I·HI，
[5，10-CH-（6R，S）-THF]磷酸盐，
[5，10-CH-（6R，S）-THF]硫酸盐
[5，10-CH-（6R，S）-THF]硝酸盐
[5，10-CH-（6R，S）-THF]草酸盐
[5，10-CH-（6R，S）-THF]马来酸盐
[5，10-CH-（6R，S）-THF]甲苯-4-磺酸盐
[5，10-CH-（6R，S）-THF]苯磺酸盐
[5，10-CH-（6R，S）-THF]甲烷磺酸盐
[5，10-CH-（6R，S）-THF]三氯乙酸盐;和
[5，10-CH-（6R，S）-THF]三氟乙酸盐。
5·3[5，10-CH-（6R）-THF]Br·HBr
比计算量稍过量的6N氢溴酸水溶液加到20克[5，10-（6R，S）-THF]的内盐于30ml甲酸的溶液中，并在20～25℃下搅拌混合物。一段时间之后，[5，10-甲川-（6R）-四氢叶酸]溴化物氢溴化物析出，（6R）含量：89%
当[5，10-CH-（6R，S）-THF]Br·HBr溶于甲酸中并加入2N氢溴酸水溶液，或当“外消旋”溴化物氢溴化物用少量二甲亚砜（约4ml/克）分级结晶时，也可得到[5，10-CH-（6R）-THF]Br·HBr。
就氢卤酸，硝酸，硫酸和磺酸的酸加成盐而言，在成盐中可包含每摩尔5，10-CH-THF2当量的酸。对于中等强酸（如马来酸）的盐来说，在每种情况下只有1当量酸结合到盐中。
实施例6、[5，10-CH-（6R）-THF]I·HI
此化合物是按实施例5类似方法制得的。
按实施例5中制得的30克[5，10-CH-（6R，S）-THF]磷酸盐于50℃溶解在80ml二甲亚砜中，室温下搅拌溶液几小时。长时间后，[5，10-CH-（6R）-THF]磷酸盐结晶出并滤出和干燥。
6R 异构体含量：70%（HPLC）
当少量的2M磷酸加到外消旋磷酸盐于甲酸的溶液中时也可得到[5，10-CH-（6R）-THF]磷酸盐。
实施例8 [5，10-CH-（6R）-THF]马来酸盐
30克[5，10-CH-（6R，S）-THF]马来酸盐于50℃溶解在125ml1-甲基-2-吡咯烷酮中，然后在室温下搅拌溶液。长时间后析出的[5，10-CH-（6R）-THF]马来酸盐被滤出：R含量为78%。
实施例9[5，10-CH-（6R）-THF]甲苯-4-磷酸盐
15克[5，10-CH-（6R，S）-THF]甲苯-4-磺酸盐于40～50℃溶解在28ml甲酸中，加入100ml水，然后在室温下搅拌混合物，滤出析出的[5，10-CH-（6R）-THF]甲苯-4-磺酸盐：6R含量为85%（HPLC）。
当该RS化合物用1-甲基-2-吡咯烷酮（约4-6ml/g）或二甲基乙酰胺或二甲亚砜（约2～3ml/g，各例中）重结晶时，也可得到[5，10-CH-（6R）-THF]甲苯-4-磺酸盐。
实施例10 [5，10-CH-（6R）-THF]三氯乙酸盐
10克[5，10-CH-（6R，S）-THF]三氯乙酸盐于50ml二甲风的溶液搅拌几小时，然后过滤。过滤器上的残物主要由[5，10-CH-（6S）-THF]三氯乙酸盐构成。水或乙醇加到滤液中，然后[5，10-CH-（6R）-THF]三氯乙酸盐析出;6R含量：70%（HPLC）。
实施例11 5，10-CH-（6S）-THF内盐和5，
10-CH-（6R）-THF内盐
50ml水加到50克5，10-CH-（6R，S）-THF内盐于20ml甲酸的溶液中，于20℃搅拌混合17小时。滤出析出的晶体。它们主要是由5，10-CH-（6S）-THF内盐构成。6S含量：73%。重复操作，6S含量提高到90%。母液中加丙酮，而后第二批晶体析出。经过滤和检测。其75%是由5，10-（6R）-THF的内盐构成。
实施例12 [5，10-CH-（6R）-THF]Cl·HCl
500ml水加到100克5，10-CH-（6R，S）-THF内盐于200ml甲酸的溶液中，搅拌混合物20小时。滤出析出的5，10-CH-（6S）-THF内盐。滤液中加入强盐酸，或滤液中通入气态HCl。逐渐析出的物质由[5，10-H-（6R）-THF]Cl·2H2O构成，其6R含量为95%
实施例13～18
按实施例5～12描述的类似方式制备以下物质
13.[5，10-CH-（6R）-THF]硝酸盐，
14.[5，10-CH-（6R）-THF]硫酸盐
1.[5，10-CH-（6R）-THF]草酸盐，
16.[5，10-CH-（6R）-THF]甲烷磺酸盐，
17.[5，10-CH-（6R）-THF]苯磺酸盐，
18.[5，10-CH-（6R）-THF]三氯乙酸盐。