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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201380038217.5(22)申请日 2013.07.181212775.9 2012.07.18 GBC12Q 1/68(2006.01)(71)申请人 DNA 电子有限公司地址 英国伦敦(72)发明人 Z安萨里 K阿明 G乔根森K科尔布 D摩尔利 A帕特尔S里德 L涉泊德 C陶马祖(74)专利代理机构 北京润平知识产权代理有限公司 11283代理人 严政 李婉婉(54) 发明名称传感装置及方法(57) 摘要本发明提供一种传感装置，该传感装置包括芯片，该芯片用于样品中的模板多核苷酸的集成扩增和测序。该装置包括具有在一个阱或室中至少。
2、一个 ISFET 的芯片，扩增装置，该扩增装置用于在所述芯片的表面上扩增所述模板多核苷酸并且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增，以及测序装置，该测序装置用于对在所述阱或室中的扩增模板寡核苷酸进行测序。还提供了使用方法。(30)优先权数据(85)PCT国际申请进入国家阶段日2015.01.16(86)PCT国际申请的申请数据PCT/GB2013/051930 2013.07.18(87)PCT国际申请的公布数据WO2014/013263 EN 2014.01.23(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2。
3、页 说明书24页 附图11页(10)申请公布号 CN 104471076 A(43)申请公布日 2015.03.25CN 104471076 A1/2 页21.一种测定多个模板多核苷酸的序列的方法，该方法包括 ：向多个阱中提供模板，每个阱与 ISFET 相接触 ；扩增所述模板 ；在每个阱中固定至少一个模板 ；然后在每个阱中创建无性系种群 ；以及然后对所述阱中的目标菌落测序。2.一种测定多个模板多核苷酸的序列的方法，该方法包括 ：向多个阱提供多个模板，每个阱与 ISFET 相接触 ；在每个阱中的固体衬底上进行无性系扩增所述模板 ；以及测序所述阱中扩增模板。3.根据权利要求 1 或 2 所述的方法。
4、，进一步包括监控来自 ISFET 的输出信号以检测涉及所述阱中的所述模板的水解反应的副产物。4.根据权利要求 1 或 2 所述的方法，其中在扩增之前断裂样品中的核酸以创建多个模板多核苷酸。5.根据权利要求 1-4 中所述的方法，包括以下步骤 ：向所述阱提供所述模板，模板与阱的比率为 1:0.4-2，优选约为 1:1 ；在所述模板的扩增期间向隔离的相邻的阱提供密封 ；以及在扩增模板的测序前去除所述密封。6.根据权利要求 1-4 中任意一项所述的方法，包括以下步骤 ：在每个阱中提供单个模板结合位点以固定单个模板 ；在模板扩增期间向所述阱提供密封以隔离相邻的阱 ；以及在扩增模板的测序前去除所述密封。。
5、7.根据权利要求 6 所述的方法，其中，所述单个模板结合位点在微珠上，优选其中 (a)通过仅足够大到结合一个微珠的结合位点，将所述微珠结合到每个阱的表面，或者 (b) 改变所述微珠尺寸以便于仅一个这样的微珠能够适合进入每个阱。8.根据权利要求 1-4 中任一项所述的方法，还包括在与每个阱相接触的电极上控制电荷以吸引模板到每个阱的步骤，优选其中在检测结合到该阱的表面的模板时，去除或反转在每个阱中的单个电极上的电荷。9.根据权利要求 1-4 中任一项所述的方法，其中在阱中固定的序列特别的寡核苷酸将一个以上链的靶向模板类型结合到单个固体衬底。10.根据任意前述权利要求所述的方法，其中隔离位于阱中的固。
6、定的寡核苷酸，优选通过用蜡覆盖所述寡核苷酸，优选其中通过加热蜡去除固定的寡核苷酸的隔离，优选在清洗来自所述阱的未结合的模板之后。11.根据权利要求 1-10 中任一项所述的方法，还包括向每个阱提供多个具有进一步结合位点的微珠的步骤，用于结合在阱中的模板的无性系扩增，优选在清洗来自所述阱的未结合的模板后执行所述步骤。12.一种用于多个模板多核苷酸的扩增和测序的传感装置，该装置包括 ：- 半导体芯片，所述半导体芯片具有多个 ISFET ；- 微流体结构，所述微流体结构定义多个阱，其中每个阱与 ISFET 中的至少一个相接权 利 要 求 书CN 104471076 A2/2 页3触；- 扩增装置，所。
7、述扩增装置用于扩增模板多核苷酸，且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增 ；以及- 其中设置所述阱以在每个阱中创建无性系种群 ；- 测序装置，所述测序装置用于在每个阱中测序模板菌落。13.一种用于多个模板多核苷酸的扩增和测序的传感装置，该装置包括 ：- 半导体芯片，所述半导体芯片具有多个 ISFET ；- 微流体结构，所述微流体结构定义多个阱，每个阱与 ISFET 中的至少一个相接触 ；- 扩增装置，所述扩增装置用于固定和扩增所述阱中的所述模板多核苷酸，且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增 ；以及- 测序装置，。
8、所述测序装置用于测序所述阱中的所述扩增的模板多核苷酸。14.根据权利要求 12 所述的传感装置，其中，在每个阱中有至少一个固定的寡核苷酸，该寡核苷酸与多核苷酸不结合但适应于结合到所述模板多核苷酸。15.根据权利要求12或13所述的传感装置，进一步包括设置的可拆卸密封以覆盖微流体结构表面，这样本质上使每个阱与相邻的阱隔离。16.根据权利要求 15 所述的传感装置，其中所述可拆卸密封为液体，例如矿物油。17.根据权利要求 15 所述的传感装置，其中所述可拆卸密封为固体，例如柔性膜，优选其中所述密封包括粘合剂，例如压敏材料粘合剂。18.根据权利要求 12-17 中任一项所述的传感装置，其中，每个阱中。
9、的表面用装置改性以固定寡核苷酸。19.根据权利要求 12 或 13 所述的传感装置，其中，在每个所述阱中仅单个寡核苷酸是可得的以与样品中的模板多核苷酸杂交。20.根据权利要求18或19所述的传感装置，其中，微珠提供用于寡核苷酸固定的表面，优选其中所述微珠为链霉亲和素涂覆的聚苯乙烯微珠。21.根据权利要求 12-20 中任一项所述的传感装置，其中所述加热装置包括在芯片上的加热元件和，任选地，还有在芯片上的温度传感器和 / 或在芯片上的温度控制线路，优选其中所述在芯片上的加热器为集成在所述芯片中的耐加热元件，优选作为源自所述芯片中的一个以上的金属层的路径形成的所述元件。权 利 要 求 书CN 10。
10、4471076 A1/24 页4传感装置及方法背景技术0001 在过去的二十年中，伴随着现有可获得的装置仪器的测量范围的增加，在核酸分析，特别是核酸扩增和 DNA 测序技术领域已有了快速发展。检测和分析核酸序列的传统方法主要依赖于荧光核酸染料、荧光标记的寡核苷酸探针、荧光或放射性标记的核苷酸。0002 随后，一种利用基于半导体的检测系统，例如离子敏场效应晶体管(ion sensitive field effect transistor)(ISFET) 分析核酸合成和测序的新方法已被开发，参见例如我们的 PCT 公布文本 WO 03/073088。一种离子敏场效应晶体管为基础的平台，不同于传统的。
11、基于荧光的核酸分析系统，检测不需要昂贵的光学仪器或危险的放射性同位素，因此使得该平台低成本、安全和简单替换 (simple alternative) 以用于测序和核酸扩增分析。0003 具体地，已经采用测量溶液中离子浓度的 ISFTE 通过检测由反应引起的氢离子(H+，质子 ) 浓度变化以检测核苷酸结合到核酸链中。0004 在核酸聚合反应过程中释放出氢离子。例如，如下化学式 I 显示通过 DNA 聚合酶调解单个核苷酸水解促进氢离子释放 ：0005 dNTP dNMP+PPi+ZH+( 化学式 I)0006 其中dNTP为三磷酸核苷，dNMP为一磷酸核苷，z为描述每个核苷酸转交(nucleoti。
12、de turnover)产生质子的平均数的整数或分数，H+为质子和PPi为焦磷酸盐(离去基团或反应产物 )0007 可以通过将焦磷酸盐水解形成两个正磷酸盐 (Pi) 驱动所述反应以进一步产生更多的氢离子。焦磷酸酶促进这种二次化学反应，且描述于化学式 II 中 ：0008 PPi 2Pi+zH+( 化学式 II)0009 现有的“合成测序 (sequencing-bysynthesis)”方法的工作流程可以大体上分为模板制备、测序和检测，以及数据分析。所述第一步骤，模板制备，通常包括无性系扩增所述模板以获得足够数量的扩增模板以确保在测序步骤中检测核苷酸合并信号(incorporation sig。
13、nal)。目前，这种无性系扩增步骤通常在与测序反应相分离的隔间中进行，典型的在分隔装置 (separate machine) 中进行。然而，这种两个步骤的空间上的分离需要熟练技工，按时安排大量人手(high levels of hands on time)，引入增加误差并可能增加样品损失，因此降低了对测序的检测敏感性并提高成本。0010 通常练习 (standard practice) 是用来扩增所述核酸以方便准确的测序。公知各种各样扩增核酸的方法。实际上，PCT 公布文本 (WO2008/107014) 披露了一种使用固态(Solid-State)pH 传感器，例如 ISFET，监测 qPC。
14、R 的方法。反应监测是在靶向 ( 核酸 ) 序列存在下，当扩增进行超过了用于克服样品的缓冲能力的循环阈值时，借助检测质子释放所引起的 pH 变化。其并没有披露通过合成测序 (sequencing-by-synthesis) 进行序列检测，仅检测了扩增的自身活性 (amplification activity)。WO2008/076406A2 也公开了在ISFET 背景下的各种各样的扩增方法，例如桥式扩增。0011 使用 ISFET 用于测定的测序方法也是公知的。US2010/031398A1 披露了一种在测说 明 书CN 104471076 A2/24 页5序方法中使用的装置，该装置包括一组微。
15、孔和传感器，其可以是 ISFET，所述传感器具有浮栅结构(floating gate structure)，该浮栅结构相应地(in turn)具有与分析物分离的设置在浮栅上方的保护材料层。保护材料具有达到约 的厚度。同时提供了制备方法。然而，这些测序方法和关于 DNA 的预制备 无性系 的特定过程 (distinct process) 一样操作。0012 因此，本发明一个目标是提供一种用于扩增和测序的离子敏感装置，以及用于核酸扩增和测序的方法，其克服了或减轻了现有测序方法中存在的不足。0013 本发明的进一步目标是提供用于扩增和测序的离子传感装置，其克服了来自于需要将扩增和随后的测序两者在没有。
16、任何空间隔离下相结合所引起的困难。发明内容0014 为此在本发明的第一个方面提供了一种传感装置，该传感装置包括用于集成样品中的模板多核苷酸的扩增和测序的芯片 (chip)，所述装置包括 ：0015 - 芯片，所述芯片在阱 (well) 或室 (chamber) 中有至少一个 ISFET ；0016 - 扩增装置，所述扩增装置位于所述芯片的表面上用于扩增所述模板多核苷酸，且该扩增装置包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增 ；以及0017 - 测序装置，所述测序装置用于测序位于所述阱 (well) 或室 (chamber) 中的所述扩增模板多核苷酸。0018。
17、 根据本发明的第二个方面，提供了一种测定多个模板多核苷酸的序列的方法，该方法包括 ：0019 向多个阱提供所述模板，每个阱与 ISFET 相接触 ；0020 任选地，扩增所述模板 ；0021 使每个阱中的至少一个模板固定 ；然后0022 在每个阱中创建无性系种群 ；以及然后0023 测序所述阱中的所述模板菌落。0024 根据本发明的第三个方面，提供了一种测定多个模板多核苷酸序列的方法，该方法包括 ：0025 向多个阱中提供所述多个模板，每个阱与 ISFET 相接触 ；0026 在每个阱的固体衬底上无性系地扩增所述模板 ；以及0027 测序所述阱中的所述扩增模板。0028 根据本发明的第四个方面。
18、，提供了一种用于多个模板多核苷酸的扩增和测序的传感装置，所述装置包括 ：0029 - 半导体芯片，所述半导体芯片具有多个 ISFET ；0030 - 微流体结构，所述微流体结构定义了多个阱，其中每个阱与 ISFET 中的至少一个相接触 ；0031 - 扩增装置，所述扩增装置用于扩增所述模板多核苷酸，且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增 ；以及0032 - 其中设置所述阱以在每个阱中创建无性系种群 (clonal population) ；说 明 书CN 104471076 A3/24 页60033 - 测序装置，所述测序装置用于在每个阱中测序模板菌落。
19、。0034 根据本发明的第五个方面，提供了一种用于对多个模板多核苷酸的扩增和测序的传感装置，该装置包括 ：0035 - 半导体芯片，所述半导体芯片具有多个 ISFET ；0036 - 微流体结构，所述微流体结构定义了多个阱，每个阱与 ISFET 中的至少一个相接触；0037 - 扩增装置，所述扩增装置用于固定和扩增所述阱中的所述模板多核苷酸，且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增 ；以及0038 - 测序装置，所述测序装置用于测序所述阱中的所述扩增的模板多核苷酸。0039 在阱内的扩增期间，特别优选提供可拆卸密封。这样有助于封闭 ( 例如抑制和隔离 )。
20、 在相邻的阱中发生的扩增反应。可拆卸密封帽防止了在扩增期间反应之间的蒸发和交叉污染，因此为最大化的扩增效率提供了最佳条件。可拆卸密封帽可以为液体或固体材料。液体密封帽可以是矿物油或硅油。固体密封帽可以为耐热硅垫或热塑性弹性材料 (TPE)。0040 此处提供用于扩增和测序两个阶段都适用的试剂并论述作为各扩增和测序装置的一部分用于递送它们的装置。尽管如此，应该理解的是，基础试剂包括所述模板多核苷酸、具有适当缓冲器的液体环境、核苷酸 ( 用于扩增和 / 或测序 ) 源和用于各反应的合适的聚合酶。0041 用于测序所述阱或室中的扩增模板多核苷酸的测序装置包括用作插入物的核苷酸源，例如dNTPs。而且。
21、本发明因此提供装置以实现这个目的。优选这些装置包括核苷酸源，优选三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(deoxynucleotide triphosphates)(dNTPs)。优选所述源包括 4 个以上的不同的供应物 (supplies)，每个 dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 dUTP) 有一个。在一个实施方式中，可以为每个dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP提供一个供应物，这样允许DNA或RNA模板通过相同的设备测序。优选源或供给物还包括用于所述核苷酸的泵。合适的路线 (routing) 和控制机制 (control mechanisms) 为已知 ；参见例如 US20。
22、10/031391A1中图 8 和附随的描述，特此纳入参考。0042 用于热循环和等温扩增的合适的扩增聚合酶包括但不限于 Taq 聚合酶、Pfu 聚合酶、Phusion 聚合酶、Vent 聚合酶、Bst 聚合酶、没有外切酶活性的 (exo-Klenow) 聚合酶、phi29 DNA 聚合酶，以及它们的突变体和衍生物。可以在添加所述样品或模板核苷酸之前，例如通过印刷或测定点位 (spotting) 在芯片上提供所述扩增 Pols( 聚合酶 )。优选地，在这种情况下，在所述扩增完全后还灭活它们。可选择地，在需要时可以添加它们到在所述芯片中 / 上的所述扩增位点。为此当需要时考虑合适的泵、路线和控制。
23、装置。0043 合适的测序聚合酶 ( 不限于 RNA 或 DNA 聚合酶两者 ) 包括但不限于没有外切酶活性的片段 DNA 聚合酶 I、T4 没有外切酶活性的 (exo-)、Therminator、Bst 聚合酶、phi29 DNA聚合酶以及它们的突变体和衍生物。可以在添加所述样品或模板核苷酸之前，例如通过印刷或测定点位(spotting)在芯片上提供所述测序Pols(聚合酶)。优选地，在这种情况下，在扩增期间还灭活它们并当扩增完成时恢复活性。可选择地，在需要时可以添加它们到测序位点 ( 例如所述阱 )。为此如果需要考虑合适的泵、路线和控制装置。0044 扩增可以是借助桥式扩增 (bridge。
24、 amlification)、聚合酶连锁反应、核酸依赖性说 明 书CN 104471076 A4/24 页7扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)(NASBA ；Deiman B等，2002)、链置换扩增 (Strand-displacement amplification)(SDA ；Andra S C，2001)、滚环扩增 (Rolling circle amplification)(US5714320)，和环介导等温扩增 (Loop Mediated Isothermal Amplification)(LAMP)，这些全是本领域所熟知的。
25、技术。0045 优选地，所述ISFET监控(momitors)所述扩增反应。在任何情况下放置所述ISFET 以便可能在阱处或在阱中检测测序，这样当在所述阱处也发生扩增时，还可以采用所述 ISFET 监控扩增。在另一个选择中，可以在扩增期间关闭所述 ISFET 以节省能量。监控所述扩增反应允许系统确定当在阱中出现合适的大量无性系模板时，可以向控制器反馈确定结果以改变或停止在阱或所有阱中的扩增过程。0046 在本发明的进一方面，提供了一种测定模板核酸的序列的方法，该方法包括扩增样品中的模板核酸和测序在现有装置中的扩增核酸。其他优选的方法步骤为本文中如上且一般性描述的，然而更优选的是，在扩增前断裂样。
26、品中的核酸以分解其为有效的尺寸部分(sized portions)。例如，可以按这种方式测序大的 DNA 分子，甚至整个基因组。0047 优选地，在同一个阱或室中扩增和接着测序样品中的核酸。0048 在一些实施方式中，所述传感装置具有至少一个固定在每个阱中的寡核苷酸，其中寡核苷酸与多核苷酸不结合但适合结合到模板多核苷酸。0049 在一些实施方式中，所述传感装置包括设置的可拆卸密封以覆盖微流体结构的表面，这样本质上使每个阱与相邻的阱隔离。0050 在一些实施方式中，固体可拆卸密封为柔性膜或粘合剂例如压敏材料粘合剂。0051 在一些实施方式中，设置所述装置，这样每个模板的扩增发生在与该模板测序相同。
27、的阱中。0052 在一些实施方式中，采取方法对所述传感装置的每个阱的表面修饰以固定寡核苷酸。还可优选的是一种传感装置，在该装置中在每个阱中仅可获得单一的寡核苷酸以与样品中的模板多核苷酸杂交。在一些实施方式中，可以使用微珠作为用于固定扩增核酸的表面。0053 所述装置可以包括加热装置，其中所述加热装置为集成在芯片中的电阻加热单元，在一些实施方式中从一个以上的金属层形成的路径。0054 在一些实施方式中，所述方法可以进一步包括步骤如下 ：0055 - 向所述阱提供所述模板，按照模板与阱的比率为 1:0.4-2，优选约为 1:1 ；0056 - 向所述阱提供密封以在所述模板的扩增期间隔离相邻的阱 ；。
28、0057 - 在所述扩增模板测序前去除所述密封。0058 在一些实施方式中，所述方法可以进一步包括以下步骤 ：0059 在每个阱中提供单一的模板结合位点 ；0060 向所述阱提供密封以在所述模板的扩增期间隔离相邻的阱 ；以及0061 在所述扩增模板测序前去除所述密封。0062 所述单一的模板结合位点可以在微珠上，在一些实施方式中，其中或者 (a) 通过仅足够大到结合一个微珠的结合位点，将所述微珠结合到每个阱的表面，或者 (b) 筛选所述微珠以便于仅一个这样的微珠可以适应进入每个阱。0063 在又一个实施方式中，所述方法可以进一步包括在与每个阱相接触的电极上控制说 明 书CN 104471076。
29、 A5/24 页8电荷，以吸引模板到每个阱的步骤，在一些实施方式中其中在每个阱中的单个电极上的电荷被去除或在检测结合到该阱表面的模板时被反转。0064 在一个实施方式中，优选所述寡核苷酸为序列特定以便将一个以上的目标模板型链结合到单个固体衬底。0065 在一些实施方式中通过用蜡覆盖所述寡核苷酸可以隔绝固定在所述阱表面或者在所述阱内的所述寡核苷酸。在一些实施方式中在从阱中清洗未结合的模板后可以通过加热蜡去除隔绝的固定的寡核苷酸。0066 优选所述方法进一步包括向每个阱提供多个具有进一步结合位点的微珠的步骤，所述结合位点用于结合在阱中的所述模板的无性系扩增。0067 优选所述方法进一步包括在测序前。
30、从所述阱中清洗去除未结合的模板的步骤。0068 根据本发明的又一方面，提供了一种传感装置，该传感装置包括用于集成模板多核苷酸的扩增和测序在样品中的芯片，该装置包括芯片，该芯片在阱或室中具有至少一个ISFET ；扩增装置，该扩增装置用于在所述芯片表面上扩增模板多核苷酸且包括至少一个加热装置，该加热装置适于在高于室温的温度下引导扩增模板多核苷酸 ；以及测序装置，该测序装置用于测序在所述阱或室中的扩增的模板多核苷酸。0069 根据本发明的又一方面，提供了一种测定模板核酸的序列的方法，该方法包括扩增样品中的模板核酸测序且随后测序扩增的核酸，使用根据任一前述权利要求的所述装置。0070 根据本发明的又一。
31、的方面，提供一种用于对多个模板多核苷酸的扩增和测序的传感装置，该装置包括 ：0071 - 半导体芯片，所述半导体芯片具有多个 ISFET ；0072 - 微流体结构，所述微流体结构定义多个阱，每个阱与 ISFET 中的至少一个相接触；0073 - 扩增装置，所述扩增装置用于固定和扩增在所述阱内的所述模板多核苷酸，且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增 ；以及0074 - 测序装置，所述测序装置用于测序在所述阱中的所述扩增的模板多核苷酸。0075 根据本发明的又一方面，提供了一种测定多个模板多核苷酸的序列的方法，该方法包括 ：0076 向多个阱提供多个模。
32、板，每个阱与 ISFET 相接触 ；0077 在每个阱中在固体衬底上无性系扩增所述模板 ；以及0078 测序所述阱中的扩增的模板。附图说明0079 图 1 是 pH 检测系统的剖面图 ；0080 图 2 是在同样的阱中集成核酸扩增和测序的一种实施方式的示意图 ；以及0081 图3是CMOS与ISFETS、温度传感器、加热器、信号处理电路和模拟向数字转换一起制造的 IC 的一种实施方式的示意图 ；0082 图 4 是阱结构的一种实施方式的剖面图 ；说 明 书CN 104471076 A6/24 页90083 图 5 是可拆卸密封的不同实施方式的示意图 ；0084 图 6 是根据本发明的一种实施方。
33、式的芯片的俯视图，显示出了平行线式加热元件、温度传感器和 ISFET 传感器 ；0085 图 7 是在图 6 的线 AA 截取的芯片的剖视图，显示出了平行线式加热元件、温度传感器和 ISFET 传感器 ；0086 图 8 是显示说明相对于 ISFET 感测器的各种各样设置的加热元件的实施例 ；0087 图9是根据本发明的一种实施方式的芯片的俯视图，显示出了像素化(pixelated) 的加热元件、温度传感器和 ISFET 传感器 ；0088 图 10 是在图 6 的线 BB 截取的芯片的剖视图，显示出了像素化的加热元件、温度传感器和 ISFET 传感器 ；以及0089 图 11 是根据本发明的。
34、一种实施方式的加热器驱动电路的示意图。具体实施方式0090 本发明的发明人已设计了结合两者 ( 靶向核酸的扩增和测序 ) 的方法与装置，因此提供了一种集成设备。这种设计的一个优势为其能够加速输出的供应(provision)，也就是说所述靶向核酸的序列。另一个优势为集成系统解决了 (addresses) 许多习惯通过手工过程和实验室工具解决的挑战。另外，这种集成可以加快工作流程的速度以最小化的动手时间并减少样品损失。此外，以进一步自动化的集成系统，将可能把用于测序的应用从实验室的专业科学家转移到为专业人员、护士或技术人员使用的更商业化的环境。0091 然而，在结合扩增和测序的步骤中的困难是对于每。
35、个的最佳条件可能非常不同，且在仪器间几乎不存在可以实现的协同。通常这些步骤的每一步需要复杂的仪器，每台仪器被机械上、电气上和生化上优化以实现它的功能。例如，用于扩增的乳液 PCR 需要混合油和含有未标记核苷酸的水性液体以及生物化学品 / 装置以检测仅有单一的无性系种群的微珠。相反地该测序步骤需要具有标记的核苷酸的生物化学品和装置以检测荧光性。而且在测试中使用的带有仪器提供的全部功能的一次性部分常常相当简单 ( 例如载玻片 )。0092 在一个方面中，本发明提供了一种方法和装置，为了降低确定的仪器的复杂性和通过使用重叠化学和装置 (overlapping chemistry and appara。
36、tus) 以结合过程步骤，该方法和装置给一次性部分带来功能。0093 应该理解的是，术语核酸包括多核酸，例如DNA或RNA且以单链(single stranded) 或双链 (double stranded) 形式，视情况而定，其中任意一种为优选的。0094 特此将我们的公开的 WO2008/107014 的内容纳入参考，其在多核酸的扩增方面是有用的。0095 虽然根据上述优选的实施方式已描述了本发明，但是应当理解的是，这些实施方式仅用于说明，且权利要求并不限于这些实施方式。本领域技术人员能够根据公开的内容做出修改和变型，这些修改和变型应考虑落入随附的权利要求的范围。不论是以单独的形式还是以与。
37、本文中公开或说明的任何其他特征的任何适当的结合的形式，可以将本说明书中公开或说明的每个特征并入本发明。0096 本发明提供了一种用于半导体测序的离子敏感装置和方法。该方法 (approach)能使得无性系扩增和无性系扩增的核酸 ( 例如 DNA) 的测序两者在同样的阱中发生。因此，说 明 书CN 104471076 A7/24 页10优选提供一种充分集成的装置，提供用于样品测序 (sample-to-sequencing) 结果系统的装置。0097 所述装置允许核酸模板 ( 包括通过分离产生的多个不同核酸模板，或其他物质 )的同时无性系扩增 ( 优选 PCR、桥式扩增或等温扩增 )。所述无性系。
38、扩增可以发生在阱中，该阱在感测平台(sensing platform)上被空间隔离(即慎重的(discreet)。本发明进一步提供了用于被空间隔离 ( 例如微阱 ) 和密封的多个核酸模板实现扩增的装置，接下来在同一个阱中准备所述扩增的多个 DNA 用于随后的经合成的测序反应。其中使用多个不同的核酸模板，本发明还提供了用于在每个为了扩增的阱中分配单一模板的装置。本发明还提供了用于在每个为了扩增的阱中分配单一物种的模板的装置。0098 半导体芯片0099 通过在化学敏感层的表面和反应介质 ( 即酶 / 电解液界面 ) 之间产生电荷离子(charged ions) 交换的 FET 功能 ：0100 。
39、0101 0102 0103 例如，包括氮化硅是有益的，因为与不具有氮化硅可获得的相比它提供了对 pH 变化的增加的且更加快速的敏感性。此外，氮化硅帮助保护 FET 免受水合作用以及电荷迁移的影响。0104 非-能斯特响应(non-Nernstian response)考虑了FET的即刻敏感性(immdiate sensitivity)，所述响应起因于带电离子在绝缘门 (insulating gate) 氮化硅表面处的快速的质子依赖性的结合与释放，这将导致跨越氮化硅层的电压下降 (voltage drop)中的可重复性变化。跨越氮化硅层的电压下降的变化与 pH 的变化有关。使用测试电路(ins。
40、trumentation circuitry)监测所述电压下降，从而允许检测单独的核苷酸插入。测量的电压被称为临界电压 (threshold voltage)。0105 在图 1 中显示的一种实施方式中，离子敏感装置 21 可以为在 CMOS 微芯片 24 上的多个 ISFET，随即具有通过歧管 26 限定的微流体阱 25。该 CMOS 微芯片还可以包含一个以上的加热器22和温度传感器23。向与ISFET相接触的阱中添加核酸合成反应混合物，该核酸合成反应混合物包含核酸模板、一种或多种聚合酶以及一种或多种核苷酸。每个 ISFET输出通过信号处理器监控的电信号。优选 ISFET 包括钝化层和 / 。
41、或传感层。这些可以官能化以对质子敏感。该传感层可以由金属氧化物或金属氮化物制备，金属氧化物和金属氮化物可以选自由 Al2O3、SiO2、S i3N4、A l2O3、T a2O5、HfO3、W O3、以及超能斯特 (super-Nernstian)材料组成的组或者这些材料的混合物或者具有不同材料层的层压结构，每层厚度范围为1nm-50nm。但核苷酸水解并结合到生长 (growing) 的核酸链时，将释放质子并通过信号处理器检测作为 ISFET 电输出中的变化。ISFET 的电信号中的变化在核酸合成期间表示核酸的结合。该装置可以包含可拆卸的密封帽 27。可以将固体密封帽耦合到机械执行器，该机械执行器用以提升至打开位置和降低到密封位置 ( 参见下文对用于阱的不同类型密封帽说 明 书CN 104471076 A。