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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410746578.1(22)申请日 2014.12.09B01D 11/04(2006.01)C08F 220/54(2006.01)C08F 220/06(2006.01)C08F 8/42(2006.01)(71)申请人 常州工程职业技术学院地址 213164 江苏省常州市武进区滆湖中路3号(72)发明人 李树白 马迪 张启蒙 薛叙明陆敏 姚晨 赵昊昱 刘英莉聂华丽(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所 ( 普通合伙 ) 11350代理人 汤东凤(54) 发明名称一种亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用(57) 摘要本。
2、发明公开了一种亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用。所述的亲和温敏聚合物为 PNIPAAm-co-AAm-Cu，所述的双水相体系是PNIPAAm-co-AAm-Cu和葡聚糖4万双水相体系。本发明的双水相体系纯化BSA后，上相中得到的BSA蛋白的特征谱带颜色加深，而其杂质蛋白明显变淡，而下相中几乎不含有 BSA 分子的谱带，表明该亲和温敏双水相体系能有效的用于 BSA 的富集和分离。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书7页 附图2页(10)申请公布号 CN 104474737 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 10447。
3、4737 A1/2 页21.一种亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用，其特征在于 ：所述的亲和温敏聚合物为 PNIPAAm-co-AAm-Cu，所述的双水相体系是 PNIPAAm-co-AAm-Cu 和葡聚糖 4 万双水相体系。2.如权利要求 1 所述的亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用，其特征在于 ：所述的亲和温敏聚合物 PNIPAAm-co-AAm-Cu 的制备方法如下 ：(1)将N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸溶解在去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的重量体积比为 1:50-150g/l，N- 异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为 1:20-30g/ml，然后真空脱气10min，再加入N,。
4、N,N,N-四甲基乙二胺和过硫酸铵溶液，N,N,N,N-四甲基乙二胺与 N- 异丙基丙烯酰胺的体积重量比为 40-80:1l/g，过硫酸铵溶液与 N- 异丙基丙烯酰胺的体积重量比为0.1-1:1ml/g，通氮气鼓泡15min后密封，于50恒温水浴中反应2h；(2) 反应结束后，将上层清液轻轻倒出，加入去离子水将沉淀溶解，待沉淀完全溶解后，置于 50恒温水浴中 30min，离心收集聚合物沉淀，重复上述步骤 3 次，以去除未反应的单体，得到PNIPAAm-co-AAm 聚合物，在真空干燥箱中将所得的聚合物在 50干燥 ；(3) 然后将聚合物 PNIPAAm-co-AAm 加入到 2.0g/L 硫酸。
5、铜溶液中，PNIPAAm-co-AAm 与硫酸铜溶液的重量体积比为0.1-0.5:2g/ml，调节pH至4.5，在室温下进行铜离子的吸附实验 1h，待吸附平衡后置于 50的恒温水浴中，保温 10min 至金属螯合温敏聚合物受热凝集沉淀，8000rpm离心5min使之完全沉淀得到亲和温敏金属螯合聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu。3.如权利要求2所述的亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用，其特征在于 ：步骤(1)中，N- 异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的重量体积比为 1:100g/l ；N- 异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为 1:25g/ml ；N,N,N,N- 四甲基乙二胺与 N- 异丙基丙。
6、烯酰胺的体积重量比为60:1l/g ；过硫酸铵溶液与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为0.6:1ml/g，过硫酸铵溶液的浓度为 10 w/v。4.如权利要求2所述的亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用，其特征在于 ：步骤(3)中，PNIPAAm-co-AAm 与硫酸铜溶液的重量体积比为 0.2:2g/ml。5.如权利要求 1 所述的亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用，其特征在于 ：所述的双水相体系对 BSA 的分离纯化方法如下 ：(1) 将成相物质亲和温敏聚合物 PNIPAAm-co-AAm-Cu 配制成浓度为 5.50 w/w 的浓溶液，葡聚糖 4 万配制成浓度为 20 w/w 的浓溶液 ；(2。
7、) 将 BSA 配制成 15.0mg/ml 的溶液 ；(3)将步骤(1)配制的PNIPAAm-co-AAm-Cu溶液和葡聚糖4万混合得到双水相体系，使双水相体系中葡聚糖 4 万的浓度为 6.0 w/w，亲和温敏聚合物的浓度为 3.5 w/w，振荡混合均匀。(4) 往双水相体系中加入步骤 (2) 配制的 BSA 溶液，并用 0.05mpl/L Tris-HCl 缓冲液调节体系的pH值6，然后加蒸馏水，在旋涡混合器上混合1min，室温下静置30min，体系分成两相，使 BSA 在两相中进行分配，读取上下两相的体积，计算相体积比 R(R Vt/Vb)；(5) 分别取一定量的上下两相，分别测定两相中 。
8、BSA 的浓度，亲和温敏聚合物相置于40水浴中保温 10min，使亲和温敏聚合物受热凝聚至完全沉淀，8000rpm 离心 5min 弃上权 利 要 求 书CN 104474737 A2/2 页3清，将所得沉淀用 pH 6.0 的 0.05mol/L Tris-HCl 缓冲溶液洗涤数次，除去未吸附的蛋白质，最后用 2ml，pH 4.0 的 0.05mol/L Tris-HCl 缓冲溶液在 4下将温敏聚合物充分溶解，在 40水浴下保温 10min，使亲和温敏聚合物完全沉淀，8000rpm 离心 5min 取上层清液，分别测定洗脱前后溶液中蛋白质的含量。6.如权利要求5所述的亲和温敏聚合物在双水相体。
9、系中的应用，其特征在于 ：步骤(2)中，BSA 溶液用 pH6.0，0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液配制。7.如权利要求5所述的亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用，其特征在于 ：步骤(5)中，Tris-HCl 缓冲溶液中含有 0.20mol/L NaCl 和 0.050mol/L EDTA。权 利 要 求 书CN 104474737 A1/7 页4一种亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用技术领域0001 本发明涉及高分子聚合物领域，尤其涉及一种亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用。背景技术0002 聚 (N- 异丙基丙烯酰胺 ) 简称 PNIPAAm，分子结构式如下 ：0003 由于其。
10、大分子侧链上同时具有亲水性的酰胺基基团 (-CONH-) 和疏水性的异丙基基团 -CH(CH3)2, 使线型 PNIPAAm 的水溶液呈现出温度敏感的特性。人们对 PNIPAAm 的研究始于 1956 年，Sprecht 等人于 1967 年首次观察到了线型的 PNIPAAm 水溶液具有临界相转变温度的温敏现象。八十年代初，日本学者 Katayama等人合成了聚甲基 - 丙烯酰胺类高聚物，此后不少新的化合物也陆续被合成出来。1984 年Hirokawa，Tanaka 等人首次报道了非离子型的 PNIPAAm 在二甲基亚砜的水溶液中有体积相变发生。从此 PNIPAAm 以及 N- 烷基取代丙烯酰。
11、胺成为国际上高分子领域一个新的研究热点。此后人们发现了一系列可使此类高聚物发生相变的外界因素，例如溶液的 pH 值、离子强度、电场、磁场、光、化学物质等，预示了它在化学转换器、记忆元件开关、传感器、药物的控制释放、分子分离等方面都有潜在的应用价值。0004 双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作，并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。目前，双水相萃取技术已被广泛地应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域，用此法可提取的生物酶已达数十种，部分过程已进行到中试规模，被认为是生物下游工程中一种具有广阔应用前景的分离技术。00。
12、05 目前，双水相萃取技术已被研究用于众多生物产品的分离提纯，并显示出众多其他分离技术不具备的优点，是一种应用前景广阔的新型生物分离技术。发明内容0006 本发明提供了一种亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用。0007 本发明采用如下技术方案 ：0008 本发明的亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用中 ：所述的亲和温敏聚合物为PNIPAAm-co-AAm-Cu，所述的双水相体系是 PNIPAAm-co-AAm-Cu 和葡聚糖 4 万双水相体系。0009 所述的亲和温敏聚合物 PNIPAAm-co-AAm-Cu 的制备方法如下 ：0010 (1) 将 N- 异丙基丙烯酰胺和丙烯酸溶解在去离子水中，N。
13、- 异丙基丙烯酰胺和说 明 书CN 104474737 A2/7 页5丙烯酸的重量体积比为 1:50-150g/l，N- 异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为1:20-30g/ml，然后真空脱气 10min，再加入 N,N,N,N- 四甲基乙二胺和过硫酸铵溶液，N,N,N,N- 四甲基乙二胺与 N- 异丙基丙烯酰胺的体积重量比为 40-80:1l/g，过硫酸铵溶液与 N- 异丙基丙烯酰胺的体积重量比为 0.1-1:1ml/g，通氮气鼓泡 15min 后密封，于50恒温水浴中反应 2h ；0011 (2) 反应结束后，将上层清液轻轻倒出，加入去离子水将沉淀溶解，待沉淀完全溶解后，置于50恒温水。
14、浴中30min，离心收集聚合物沉淀，重复上述步骤3次，以去除未反应的单体，得到 PNIPAAm-co-AAm 聚合物，在真空干燥箱中将所得的聚合物在 50干燥 ；0012 (3)然后将聚合物PNIPAAm-co-AAm加入到2.0g/L硫酸铜溶液中，PNIPAAm-co-AAm与硫酸铜溶液的重量体积比为0.1-0.5:2g/ml，调节pH至4.5，在室温下进行铜离子的吸附实验1h，待吸附平衡后置于50的恒温水浴中，保温10min至金属螯合温敏聚合物受热凝集沉淀，8000rpm离心5min使之完全沉淀得到亲和温敏金属螯合聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu。0013 步骤(1)中，优选：N-。
15、异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的重量体积比为1:100g/l；N- 异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为 1:25g/ml ；N,N,N,N- 四甲基乙二胺与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为60:1l/g ；过硫酸铵溶液与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为 0.6:1ml/g，过硫酸铵溶液的浓度为 10 w/v。0014 步骤 (3) 中，优选 ：PNIPAAm-co-AAm 与硫酸铜溶液的重量体积比为 0.2:2g/ml。0015 本发明的双水相体系对 BSA 的分离纯化方法如下 ：0016 (1) 将成相物质亲和温敏聚合物 PNIPAAm-co-AAm-Cu 配制成浓度为 5.50 w/w 的浓溶。
16、液，葡聚糖 4 万配制成浓度为 20 w/w 的浓溶液 ；0017 (2) 将 BSA 配制成 15.0mg/ml 的溶液 ；0018 (3) 将步骤 (1) 配制的 PNIPAAm-co-AAm-Cu 溶液和葡聚糖 4 万混合得到双水相体系，使双水相体系中葡聚糖 4 万的浓度为 6.0 w/w，亲和温敏聚合物的浓度为 3.5 w/w，振荡混合均匀。0019 (4)往双水相体系中加入步骤(2)配制的BSA溶液，并用0.05mpl/LTris-HCl缓冲液调节体系的pH值6，然后加蒸馏水，在旋涡混合器上混合1min，室温下静置30min，体系分成两相，使 BSA 在两相中进行分配，读取上下两相的。
17、体积，计算相体积比 R(R Vt/Vb)；0020 (5) 分别取一定量的上下两相，分别测定两相中 BSA 的浓度，亲和温敏聚合物相置于 40水浴中保温 10min，使亲和温敏聚合物受热凝聚至完全沉淀，8000rpm 离心 5min 弃上清，将所得沉淀用pH 6.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤数次，除去未吸附的蛋白质，最后用 2ml，pH 4.0 的 0.05mol/L Tris-HCl 缓冲溶液在 4下将温敏聚合物充分溶解，在 40水浴下保温 10min，使亲和温敏聚合物完全沉淀，8000rpm 离心 5min 取上层清液，分别测定洗脱前后溶液中蛋白质的含量。0021 。
18、步骤 (2) 中，BSA 溶液用 pH6.0，0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液配制。0022 步骤 (5) 中，Tris-HCl 缓冲溶液中含有 0.20mol/L NaCl 和 0.050mol/L EDTA。0023 本发明的积极效果如下 ：0024 本发明的双水相体系纯化BSA后，上相中得到的BSA蛋白的特征谱带颜色加深，而其杂质蛋白明显变淡，而下相中几乎不含有 BSA 分子的谱带，表明该亲和温敏双水相体系说 明 书CN 104474737 A3/7 页6能有效的用于 BSA 的富集和分离。附图说明0025 图 1 是本发明的亲和温敏双水相体系相图。0026 图 2 是亲和温。
19、敏双水相体系纯化过后的 BSA 蛋白 SDS-PAGE 图。具体实施方式0027 下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。0028 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0029 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径得到。0030 实施例 10031 本发明的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法的具体步骤如下 ：0032 (1)将1.0g N-异丙基丙烯酰胺和100l丙烯酸溶解在25ml去离子水中，置于 100ml 具塞磨口圆底烧瓶中，真空脱气 10min，加入 N,N,N,N- 四甲基乙二胺 (TEMED)(60l) 和 0.6ml 过硫酸铵溶液 (。
20、10，w/v)，通氮气鼓泡 15min 后密封，之后 50恒温水浴反应 2h。0033 (2)反应结束后，将上层清液轻轻倒出，加入50ml去离子水将沉淀溶解。待沉淀完全溶解后，置于 50恒温水浴中 30min，离心收集聚合物沉淀。重复上述步骤 3 次，以去除未反应的单体，在真空干燥箱中将所得的聚合物 PNIPAAm-co-AAm 50干燥。0034 (3)然后将0.20g温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm加入到2ml 2.0g/L硫酸铜溶液中，调节pH至4.5，在室温下进行铜离子的吸附实验1h，待吸附平衡后置于50的恒温水浴中，保温 10min 至金属螯合温敏聚合物受热凝集沉淀，8000r。
21、pm 离心 5min 使之完全沉淀得到PNIPAAm-co-AAm-Cu。0035 亲和温敏双水相体系相图的绘制 ：0036 将两种成相聚合物亲和温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu和葡聚糖4万分别制成一定浓度的母液。准确称量一定量亲和温敏聚合物 PNIPAAm-co-AAm-Cu 母液，加入试管中，然后加入葡聚糖4万母液混合均匀，直到试管开始出现混浊为止，称量加入的葡聚糖 万母液的质量，算出亲和温敏聚合物和葡聚糖 4 万在双水相体系中的重量百分浓度，再加入适量水，使体系变澄清，称量加入水的质量，并继续加入葡聚糖 4 万母液，使体系再次变混浊，如此反复操作，计算到达混浊时亲和温敏聚合物。
22、 PNIPAAm-co-AAm-Cu 和葡聚糖 4 万在系统中的重量百分含量，则可得到亲和温敏聚合物 PNIPAAm-co-AAm-Cu 和葡聚糖 4 万的双节线相图。0037 本发明的双水相体系对 BSA 的分离纯化方法 ：0038 (1) 将成相物质亲和温敏聚合物 PNIPAAm-co-AAm-Cu 配制成浓度为 5.50 (w/w)的浓溶液，葡聚糖 4 万配制成浓度为 20 (w/w) 的浓溶液，备用。0039 (2) 将 BSA 配制成一定浓度的溶液，备用。0040 (3) 根据绘制好的相图构造不同组成的双水相体系，按照计算好配制一定组成(质量分数)的双水相体系所需的聚合物PNIPAA。
23、m-co-AAm-Cu和葡聚糖4万母液的质量，依次将所需的母液加入带刻度的试管中，振荡混合均匀。说 明 书CN 104474737 A4/7 页70041 (4)按照实验选定的条件，在试管中加入一定浓度的BSA溶液，并用0.05mpl/L Tris-HCl 缓冲液调节体系的 pH 值，然后加蒸馏水至所需的质量。在旋涡混合器上混合1min，室温下静置 30min，体系分成两相，使 BSA 在两相中进行分配。读取上下两相的体积，计算相体积比 R(R Vt/Vb)。0042 (5) 分别取一定量的上下两相，分别测定两相中 BSA 的浓度。亲和温敏聚合物相置于 40水浴中保温 10min，使亲和温敏聚。
24、合物受热凝聚至完全沉淀，8000rpm 离心 5min弃上清。将所得沉淀用 pH 6.0 的 0.05mol/L Tris-HCl 缓冲溶液洗涤数次，除去未吸附的蛋白质。最后用 2ml，pH 4.0 的 0.05mol/L Tris-HCl 缓冲溶液 ( 含有 0.20mol/L NaCl 和0.050mol/L EDTA)在4下将温敏聚合物充分溶解，在40水浴下保温10min，使亲和温敏聚合物完全沉淀，8000rpm 离心 5min 取上层清液，分别测定洗脱前后溶液中蛋白质的含量。按式KCt/Cb，式 中 Ct、Cb分别为上相和下相分配物质的浓度，单位为 g/L、Y RK/(1+RK)( 或。
25、 Y 1/(1+RK) 计算 BSA 在双水相体系中的分配系数和相回收率。0043 胎牛血清中 BSA 的分离纯化 ：0044 在亲和温敏双水相体系中加入一定量制备好的胎牛血清样品，调节体系的 pH 值，混合均匀后室温静置分相。分别取一定量的上下两相，分别测定两相中 BSA 的浓度，计算BSA在双水相体系中的分配系数和相回收率。收集上下两相的蛋白质溶液组分，冷冻干燥浓缩，通过 SDS-PAGE 电泳分析分离纯化的效果。0045 胎牛血清的预处理 ：0046 将胎牛血清与 pH 7.0，0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液按 1 ：15( 体积比 ) 混合，然后4下 10000rpm 冷。
26、冻离心 20min，取上清液作为分离样品，4保存，备用。0047 葡聚糖 4 万浓度对 BSA 分配系数及回收率的影响 ：0048 表 1 葡聚糖 4 万浓度对 BSA 分配系数和回收率的影响0049 0050 0051 由表 1 可知，随着葡聚糖 4 万浓度的提高，BSA 的分配系数不断减小。说明随着双水相体系中葡聚糖4万含量的增加，BSA不断从亲和温敏聚合物富集相(即上相)中向葡聚糖富集相 ( 即下相 ) 分配，同样上相中 BSA 的回收率也随之降低。由于 BSA 属于亲水性蛋白质，容易向亲水性的聚合物相中分配。随着葡聚糖 4 万在双水相体系中的浓度越来越大，下相的体积也随之增大，导致上相。
27、中 BSA 受到界面吸附的影响不断向下相分配。由表 1 可以看出，随着葡聚糖 4 万浓度的增加，BSA 的分配系数从 22.9 下降到了 3.97。同样 BSA 的说 明 书CN 104474737 A5/7 页8回收率也从原来的 80.4下降到了 48.2。而且由实验操作可知，随着葡聚糖 4 万浓度的增加，双水相体系中下相的体积也在不断增大。由于从葡聚糖溶液中分离纯化得到 BSA 的难度很大，所以葡聚糖富集相体积的增大是我们所不乐见的。而且随着葡聚糖 4 万浓度的增加，体系的粘度也不断升高，总所周知，高的体系粘度不利于目标分配物质的相间传质过程，会影响目标分离物质的分配系数。因此考虑到要降低。
28、体系的粘度和节省物料以及提高BSA 的分配系数，我们选择了葡聚糖 4 万浓度为 6.0 (w/w) 作为亲和温敏双水相的最优下相浓度。0052 亲和温敏聚合物浓度对 BSA 分配系数及回收率的影响 ：0053 表 2 PNIPAAm-co-AAm-Cu 浓度对 BSA 分配系数和回收率的影响0054 0055 由表2的数据可以看出，在葡聚糖4万浓度一定的条件下，随着亲和温敏聚合物浓度的增大，BSA 的分配系数逐渐增加。由实验可知，随着亲和温敏聚合物在双水相体系中含量的增加，上相的体积也不断增大，所以 BSA 回收率也随之增加。当亲和温敏聚合物的浓度从 2.5增加到 4.0时，BSA 的分配系数。
29、从 22.92 增加到了 24.83。分析其中可能的原因有两个 ：一是随着亲和温敏聚合物含量的增加，对 BSA 的亲和吸引力不断增强，使得更多的BSA 分子趋向于向上相分配，而且随着上相体积不断增大，下相体积不断减小，分配于下相的 BSA 分子之间受到静电排斥作用，也会趋向于向上相分配。另一个原因是，亲和温敏聚合物为链式大分子，并且含有羧基 -COO- 这样的高亲水性的功能基团，使得亲和温敏聚合物比较起葡聚糖 4 万来讲具有更高的亲水性。而且亲和温敏聚合物的相对分子质量比葡聚糖4 万小的多，其分子的空间位阻也比葡聚糖 4 万要小得多，这也可能导致了 BSA 分子更容易在上相分配。因此，我们选定。
30、 3.5为双水相体系中亲和温敏聚合物的最佳浓度。0056 pH 值对 BSA 分配系数及回收率的影响 ：0057 表 3 pH 值对 BSA 分配系数和回收率的影响0058 说 明 书CN 104474737 A6/7 页90059 pH值的变化改变了两相间的电位差和BSA的带电状态，从而影响了BSA的分配。由表 3 可以看出，BSA 的分配系数随双水相体系 pH 值改变的变化情况。在 pH 6.0 处 (BSA等电点 pI 附近 ) 出现了最大值，分析可能的原因是 ：当双水相体系的 pH 值由 4.0 向 BSA 的等电点逼近时，BSA 分子所带的正电荷逐渐减小，亲和温敏聚合物分子中的铜离子。
31、对 BSA 分子的静电排斥作用不断减弱，故 BSA 的分配系数增大。当体系的 pH 值远离 BSA 的等电点继续增大至体系的 pH 基本为中性时，相间的电位差逐渐减小，驱使 BSA 聚阴离子向上相分配的电位差将不再起主要的作用，故随着体系 pH 值的增大，BSA 的分配系数的增大幅度越来越小。当体系的 pH7.0 之后，亲和温敏聚合物中的金属铜离子变得不稳定，容易发生泄漏现象，对 BSA 的亲和吸引力下降，且上相聚合物中羧酸根离子 -COO- 数目增多，导致 BSA 的分配系数下降。因此考虑到 BSA 的分配系数和亲和温敏聚合物的稳定性，确定双水相体的最佳 pH 值为 6.0。0060 BSA。
32、 初始浓度对 BSA 分配系数及回收率的影响 ：0061 表 4 BSA 浓度对 BSA 分配系数和回收率的影响0062 0063 通过上述实验，我们得到了优化后的亲和温敏双水相体系，6.0葡聚糖4万/3.5亲和温敏聚合物，pH 值为 6.0。随后我们对 BSA 的初始浓度对 BSA 在亲和温敏双水相体系中的分配系数和回收率做了研究。我们设定了 BSA 的初始浓度的范围为 5.0mg/ml-25.0mg/ml。由表 4 可知，在 BSA 溶液的浓度较低时，随着 BSA 初始浓度的增加，BSA 的分配系数和回收率基本保持不变。而当 BSA 的初始浓度增到 15.0mg/ml 之后，BSA 的分配。
33、系说 明 书CN 104474737 A7/7 页10数和回收率都出现了下降。分析可能出现的原因是，在 BSA 初始浓度小于 15.0mg/ml 时，亲和温敏高聚物相还没有达到饱和，BSA 分子可以自由的在双水相体系的两相中进行分配，由于双水相体系中两种成相聚合物的浓度以及 pH 值都已经固定，所以体系的分配系数和回收率就基本保持不变。但是随着 BSA 的浓度进一步提高，亲和温敏聚合物相对 BSA 的吸附达到了饱和，此时 BSA 的浓度再增加，由于分子间的排斥作用，BSA 分子开始倾向于向下相分配，从而导致 BSA 的分配系数和回收率下降。由于这种情况会导致在回收过程中 BSA 分子的损失，所。
34、以最后确定最优的 BSA 初始浓度为 15.0mg/ml。0064 胎牛血清中 BSA 的分离纯化 ：0065 图 2 是经过亲和温敏双水相体系纯化过后的 BSA 蛋白 SDS-PAGE 的分析结果，BSA的分子量为 66kDa，胎牛血清的电泳图中显示此谱带非常宽，估计包含较多杂质，另外的谱带均为杂质蛋白。经过双水相体系纯化后，上相中得到的 BSA 蛋白的特征谱带颜色加深了，而其杂质蛋白明显变淡，而下相中几乎不含有 BSA 分子的谱带，表明该亲和温敏双水相体系能有效的用于 BSA 的富集和分离。0066 胎牛血清经过亲和温敏聚合物 / 葡聚糖 4 万构成的双水相体系纯化后，上相中得到的BSA蛋白的特征谱带颜色加深，而其杂质蛋白明显变淡，而下相中几乎不含有BSA分子的谱带，表明该亲和温敏双水相体系能有效的用于 BSA 的富集和分离。0067 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。说 明 书CN 104474737 A。