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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410630045.7(22)申请日 2014.11.11CCTCC NO: M 2014504 2014.10.21C12N 1/20(2006.01)A23B 7/155(2006.01)A23B 7/16(2006.01)A01N 63/00(2006.01)A01P 3/00(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(71)申请人 东莞市农业科学研究中心地址 523083 广东省东莞市南城区西平绿色路 100 号申请人 胡文锋(72)发明人 徐匆 李艳芳 马锞 范妍 胡珊罗诗 罗华建 胡文锋(74)专利代理机构 。
2、广州粤高专利商标代理有限公司 44102代理人 任重(54) 发明名称一株多粘类芽孢杆菌菌株在蔬果保鲜上的应用(57) 摘要本发明涉及生物技术领域，公开了一株多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）菌 株dgnkzx004 的应用。所述菌株已于 2014 年 10 月21 日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是 CCTCC M 2014504。所述菌株不仅对荔枝霜疫霉菌和 / 或炭疽病菌均具有非常好的抑制作用，还能够抑制荔枝或者龙眼的多酚氧化酶（PPO）和 / 或过氧化物酶（POD）的活性。因此，该菌株在荔枝火龙眼等果蔬的保鲜方面具有非常重要的应用价值。。
3、(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书9页 附图4页(10)申请公布号 CN 104480033 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104480033 A1/1页21.一株多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004的应用，其特征在于，所述应用是指应用于荔枝和/或龙眼的保鲜方面；所述菌株于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 2014504，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，是应用于。
4、荔枝的保鲜方面。3.一株多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004的应用，其特征在于，所述应用是指应用于抑制荔枝或龙眼霜疫霉菌和/或炭疽病菌方面；所述菌株于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 2014504，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。4.一株多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004的应用，其特征在于，所述应用是指应用于抑制荔枝或龙眼的多酚氧化酶和/或过氧化物酶活性方面；所述菌株于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 201。
5、4504，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。5.一种用于荔枝或龙眼的保鲜菌剂，其特征在于，所述保鲜菌剂包括以下重量百分含量的各组分：纳他霉素0.20.6g/L，乳酸钠1% 5%，氯化钠0.85%0.9%，水余量；在上述各组分组成的100%体系中加入所述多粘类芽孢杆菌，使其在体系中的最终浓度为108109CFU/mL。6.根据权利要求5所述保鲜菌剂，其特征在于，所述保鲜菌剂包括以下重量百分含量的各组分：纳他霉素0.3g/L，乳酸钠1%，氯化钠0.85%，水余量；在上述各组分组成的100%体系中加入所述多粘类芽孢杆菌，使其在体系中的最终浓度为7.48.2108CFU/mL。7.权利要求5或6所述保鲜。
6、菌剂在荔枝和 /或龙眼的保鲜方面的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述保鲜菌剂应用于荔枝的保鲜。9.根据权利要求2或8所述的应用，其特征在于，所述荔枝的品种为桂味荔枝、糯米糍荔枝或井岗红糯荔枝。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述荔枝的品种为桂味荔枝。权 利 要 求 书CN 104480033 A1/9页3一株多粘类芽孢杆菌菌株在蔬果保鲜上的应用技术领域0001 本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一株多粘类芽孢杆菌菌株在蔬果保鲜上的应用。背景技术0002 新鲜果蔬从采收到被消费者食用前，由于自身呼吸作用及病原生物侵染，每年都有大量果蔬从采收后在运输、贮藏过程中腐。
7、烂损失。国家农产品保鲜工程技术研究中心调查研究发现，目前我国每年年产的果蔬从田间到餐桌损失率高达2530%，年损失近800亿人民币。与此同时，随着生活水平的提高，人们对水果等食品的要求越来越高，在对于水果的色、香、味要求基础上，人们越来越多地开始关注的是食品的安全与环保。因此进一步开展果蔬保鲜技术开发研究，以保证果蔬产品附加值的实现和资源的充分利用刻不容缓。0003 目前国际通用的水果保鲜方法大致有两种：一种是乙烯吸收剂，通常是用透气袋来吸收乙烯，使水果不会进一步成熟，无药无害，但是保鲜时间和效果不稳定；另一种是打蜡，很多水果自身会产生果蜡，可防病虫、微生物侵害，但储存、运输时果蜡容易被蹭掉部。
8、分，效果不能保证，而且不可避免地导致消费者食用到果蜡，危害健康。另外，适量的二氧化硫对荔枝、龙眼等水果有很好的保鲜效果，但过量使用导致残留超标，不但果品品质受影响，食用者也会出现头晕、恶心、呕吐和腹泻等症状，甚至会损伤肝肾功能。有报道称控制果蔬采后病害的最有效手段是冷藏结合化学杀菌剂处理。但由于化学杀菌剂残留危害人类健康，而且植物病原菌对化学杀菌剂容易产生抗药性，应用越来越受到限制。0004 以人们喜爱的岭南佳果荔枝为例，荔枝果实营养丰富，其色、香、味具佳，具有“果王”的美称，极具开发价值，具有很好的经济效益，是我国在国际市场上最具竞争力的水果之一，我国是目前世界上栽培荔枝最多的国家。但荔枝很。
9、难保存，针对荔枝的保鲜，素有“一日色变，二日香变，三日味变，四日色香味尽去”的总结。荔枝的果实采摘季节处于短暂且炎热的夏季，采后自身呼吸作用旺盛，水分蒸发率高，在自身酶及外界病原菌侵袭的双重作用下极易褐变腐烂，不易贮藏，不耐贮运，严重限制了荔枝的远销与出口，制约了地域市场的开拓。据统计，荔枝每年因腐烂变质而造成的损失约占总产量的20%以上。0005 目前，国内外荔枝果实的贮藏保鲜技术主要有物理贮藏和化学保鲜两种。荔枝果实的化学保鲜过程中常用防腐药物主要是苯来特、特克多、施保克、灭菌威、多菌灵等，如申请号为 CN200610123793.1、CN03140439.1、CN 20101012779。
10、4.X 等专利；此外还包括熏硫或亚硫酸盐处理等化学处理方式，例如申请号为 CN96122329.4、CN97105377.4 以及CN00130815.7等专利。虽然化学药剂能比较有效的起到防腐、保鲜的作用，但其所产生的残留污染不仅影响风味，而且最重要的是药剂残留对人体健康有潜在威胁。化学保鲜剂屡屡触动备受食品安全问题煎熬的消费者神经。加之喷酸荔枝、石灰芒果等报道见诸报端和网络，不断地引发消费者的不安。寻找安全无毒的生物保鲜技术，用于取代化学保鲜法，已经成为关注的热点。0006 微生物种类丰富、代谢途径多样，并能产生对自然界病害菌有拮抗作用的活性说 明 书CN 104480033 A2/9页4。
11、物质。因此，利用微生物及其制剂来进行水果保鲜，能达到无毒、无害、无残留、无污染的要求，安全有效地消除化学药剂的残留，符合食品安全的发展趋势。多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是土壤中常见的细菌，也是一类重要的病害生物防治微生物，有不少还具有刺激植物生长的特点。大量研究表明，多粘类芽孢杆菌除了可以直接抑制植物病原菌，还能通过产生抗菌物质如抗菌蛋白质或酶、诱导寄主的抗病能力等。对于多粘类芽孢杆菌诱导寄主的抗病能力机制的研究越来越受到重视，2004年童蕴慧等公开了利用多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）W3菌株处理番茄叶片，能够明显增强植株叶内苯。
12、丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，对灰霉病有明显的诱导抗病作用。也就是说现有的多粘类芽孢杆菌可以直接抑制植物病原菌，同时增强寄主的过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性。而本领域公知常识，抑制相关病菌对果蔬的保鲜具有正向作用，而促进POD、PPO酶类的活性对果蔬的保鲜具有反向作用，目前尚未见有多粘类芽孢杆菌应用于果蔬保鲜的研究和报道。发明内容0007 本发明要解决的技术问题是克服现有荔枝或龙眼等果蔬采后生物保鲜技术的缺陷和不足，提供了一株多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）菌株的应用，所述菌株不。
13、仅对炭疽病和荔枝霜疫霉病具有显著的抑制作用，而且能够抑制荔枝或龙眼的多酚氧化酶和/或过氧化物酶的活性，可以很好地应用于果蔬的生物保鲜。0008 本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明提供了一株多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）菌株 dgnkzx004 的应用，所述应用是指应用于荔枝或龙眼的保鲜方面，尤其是应用于荔枝的保鲜；具体地，本发明还提供了所述多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004在抑制荔枝霜疫霉菌和/或炭疽病菌方面的应用；本发明还提供了所述多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）菌株。
14、 dgnkzx004 在抑制荔枝或龙眼的多酚氧化酶和/或过氧化物酶活性方面的应用；所述菌株于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014504。所述中国典型培养物保藏中心的地址为湖北省武汉市武汉大学。0009 另外，本发明提供了一种保鲜菌剂，是以多粘类芽孢杆菌菌株dgnkzx004的菌体悬液为有效的活性成分。所述保鲜菌剂包括以下重量百分含量的各组分：纳他霉素0.20.6g/L，乳酸钠 1% 5%，氯化钠 0.85% 0.9%，水余量；在上述各组分组成的 100% 体系中加入所述多粘类芽孢杆菌的菌体沉淀，使其在体系中的最终浓度为108109C。
15、FU/mL。0010 优选地，所述保鲜菌剂包括以下重量百分含量的各组分：纳他霉素0.3g/L，乳酸钠1%，氯化钠0.85%，水余量；在上述各组分组成的100%体系中加入所述多粘类芽孢杆菌的菌体沉淀，使其在体系中的最终浓度为7.48.2108CFU/mL。0011 本发明通过长期大量的实验研究，所得该菌株和上述保鲜菌剂不仅对常见的炭疽病和荔枝霜疫霉病等水果采后病害具有显著、稳定的抑菌效果，还能够抑制荔枝或者龙眼的多酚氧化酶（PPO）和/或过氧化物酶（POD）的活性。因此，该菌株在荔枝或龙眼的保鲜方面具有重要的应用价值，能获得很好地保鲜效果，尤其是应用于岭南佳果荔枝或龙眼，能获得最好的保鲜效果。其。
16、中对桂味荔枝、糯米糍荔枝、井岗红糯荔枝品种的保鲜效果最为突说 明 书CN 104480033 A3/9页5出。0012 本发明上述的多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）菌株 dgnkzx004 是本发明人从东莞农业科学研究中心果园土壤中采集分离所得，已于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014504。0013 具体地，本发明人在荔枝果园，选用对角线法和棋盘法采样。确定取土地点后，除去上面的枯枝落叶层以及地表5cm左右的浮土；之后用铲斜向下（离地表515cm深度的土壤）切取一片片的土壤样品。每个取样点取515个。
17、样，将取好的土样在灭菌牛皮纸上混合，四分法获取所需土壤的量。编号，记录采集信息：每一采样地的采集地点、采集日期、采集深度等。0014 将各采样点混合土样各称取10g，放入盛有100mL无菌水（制备1：10土壤悬液）并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合并分散，此为原稀释液；再用1mL无菌吸管吸取1mL稀释后的土壤溶液注入盛有9mL无菌水的试管中，用吸耳球多次吹吸充分混匀，此为10-1稀释悬液；依次类推将土样梯度稀释成10-2，1 0-3，1 0-4，1 0-5，1 0-6的土壤稀释悬液，重复3次。多次吹吸混匀所制备好的稀释液，取10-2、1 0-4、1 0-6三个梯度的。
18、稀释液，用无菌移液管吸取（吸取前再次吹吸，确保稀释液均匀）0.2mL加到已凝固的LB平板上，然后用涂布棒迅速将菌液均匀涂开。待菌落长出，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入平板划线分离，划线分离3次进行纯化并进行革兰氏染色镜检。0015 上述LB平板就是由改良LB液体培养基加入琼脂制备而成；所述改良LB液体培养基的成分：蛋白胨15g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000mL，pH6.8，121灭菌20min。0016 所述菌株dgnkzx004的培养方法，使用上述改良LB液体培养基作为培养基，具体步骤如下：S1.菌株的活化：将多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的甘油菌种按体积比。
19、2%的接种量接种到改良LB液体培养基中，32静置活化培养20小时，得种子液；S2.扩大培养：将种子液按体积比5%的接种量接种到改良LB液体培养基中，并于32静置培养20小时，得发酵液；S3.菌体悬液制备：发酵液经离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，离心获得所需的活菌体，最后用生理盐水将菌体悬起制成细胞悬浮液。0017 其中，S3所述离心是9500r/min、4离心15min。0018 本发明所述多粘类芽孢杆菌株dgnkzx004的菌落形态为圆形，奶油白色，表面干燥不透明，凸起生长，湿润，边缘整齐，直径1.31.7mm；显微镜观察菌体形态为革兰式阳性菌，杆状。0019 本发明具有以下有益效果：。
20、本发明在获得一株新的多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004菌株的基础上，提供了所述菌株的应用，该菌株不仅对荔枝霜疫霉菌、荔枝炭疽病菌具有良好的抑制作用，而且能够抑制荔枝的多酚氧化酶（PPO）和/或过氧化物酶（POD）的活性，对果蔬的保鲜具有显著的应用效果，尤其是对荔枝的保鲜效果最为突出，为果蔬的生物保鲜技术领域提供了一个新的微生物成员。0020 本发明基于新的多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004菌株，为说 明 书CN 104480033 A4/9页6果蔬的生物保鲜技术领域提供一种新的保鲜菌剂。所述保鲜菌剂。
21、尤其是对荔枝霜疫霉菌、炭疽病菌具有良好的抑制作用，还能抑制荔枝的多酚氧化酶（PPO）和/或过氧化物酶（POD）的活性，对荔枝具有显著的保鲜作用。0021 上述保鲜菌剂是本发明人在获得的多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004 菌株的基础上，将纳他霉素、乳酸钠、氯化钠与所述菌株的菌体悬液相配伍，获得了优良的果蔬保鲜效果。在选择菌剂辅料时，本发明人经过大量实验结合对各种辅料的性质研究，总结得到本发明技术方案：纳他霉素依靠其内酯环结构与真菌细胞膜上的甾醇化合物作用，形成抗生素甾醇化合物，从而破坏真菌的细胞质膜的结构。大环内脂的亲水部分（多醇部分）在膜上形成水。
22、孔，损伤细胞膜通透性，进而引起菌内氨基酸，电解质等物质渗出，菌体死亡，而且很难被人体消化道吸收，对人体无害，同时微生物很难对其产生抗性，是一种无臭、无味，低剂量且安全性高的食品防腐剂；本发明提供的菌剂体系中，能够发挥乳酸钠的保鲜和保水性能，经过不断分析研究和大量实验总结，在本发明提供的合适的配伍构成的体系下，菌株可以很好地成活并发挥活性作用，重要的是本发明菌体悬液体系共同产生了显著的应用技术效果。0022 本发明在获得的多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004菌株的基础上，进一步总结得到各组分的合理配伍比例，在适宜的用量范围内，本发明的保鲜菌剂具有很好。
23、的保鲜效果，应用于荔枝，尤其是桂味荔枝，常温贮藏4天后仍能保持鲜亮的外观和良好的风味，好果率可达80%左右，5天后好果率为40%，6天后仍然有20%左右的好果率；除此之外，本发明保鲜菌剂安全无毒、易溶于水便于食用前清洗等优点。0023 本发明应用所述菌株制备菌剂并成功实现应用，克服了通常微生物菌的活性应用局限于实验室的缺陷，具有很好的实际应用前景。所述菌剂制备方法简单，应用方便，为微生物菌在果蔬保鲜方面的应用提供有力的技术启示和指导，具有重要的应用价值和实际推广应用可行性。附图说明0024 图1为多粘类芽孢杆菌 dgnkzx004菌株菌落形态（LB培养基，32，2天）。0025 图2为多粘类芽。
24、孢杆菌 dgnkzx004革兰氏染色镜检结果。0026 图3为多粘类芽孢杆菌 dgnkzx004对炭疽菌抑制实验结果。0027 图4为多粘类芽孢杆菌 dgnkzx004对霜疫霉菌抑制实验结果。0028 图5多粘类芽孢杆菌 dgnkzx004对过氧化物酶（POD）活性影响效果图。0029 图6为多粘类芽孢杆菌 dgnkzx004对多酚氧化酶（PPO）活性影响效果图。0030 图7为对照例和实施例 4的桂味荔枝好果率随贮藏时间变化的对比曲线。0031 图8为对照例和实施例 4的桂味荔枝褐变指数随贮藏时间变化的对比曲线。0032 图9为对照例和实施例 4的糯米糍荔枝好果率随贮藏时间变化的对比曲线。0。
25、033 图10 为对照例和实施例4的糯米糍荔枝褐变指数随贮藏时间变化的对比曲线。具体实施方式0034 下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。本发明以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明做任何形式的限定。本发明主要阐述所述菌株说 明 书CN 104480033 A5/9页7以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。0035 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和。
26、设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。0036 实施例1 菌株分离及鉴定1、本发明人于2011年 8 月 2日采集东莞农业科学研究中心果园土壤，将各采样点混合土样各称取10g，放入盛有100mL无菌水（制备1：10土壤悬液）并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合并分散，此为原稀释液；再用1mL无菌吸管吸取1mL稀释后的土壤溶液注入盛有9mL无菌水的试管中，用吸耳球多次吹吸充分混匀，此为10-1稀释悬液；依次类推将土样梯度稀释成10-2，1 0-3，1 0-4，1 0-5，1 0-6的土壤稀释悬液，重复3次。多次吹吸混匀所制备好的稀释液，取10-2、1 0-4。
27、、1 0-6三个梯度的稀释液，用无菌移液管吸取（吸取前再次吹吸，确保稀释液均匀）0.2mL加到已凝固的LB平板上，然后用涂布棒迅速将菌液均匀涂开。待菌落长出，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入平板划线分离，划线分离3次进行纯化并进行革兰氏染色镜检。0037 上述LB平板是由改良LB液体培养基加入琼脂制备而成；所述改良LB液体培养基的成分：蛋白胨15g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000mL，pH6.8，121灭菌20min。0038 2、在LB培养基纯化平板上菌落形态为：圆形，奶油白色，表面干燥不透明，凸起生长，湿润，边缘整齐，直径1.31.7mm。见附图1所示。0039。
28、 将所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期是2014年10月21日，保藏号是CCTCC M 2014504，所述菌株命名为dgnkzx004。所述中国典型培养物保藏中心的地址为湖北省武汉市武汉大学。0040 3、革兰氏染色实验S1.涂片：取一片干净无油载玻片，在中央滴一滴无菌水，然后用接种环以无菌操作方法取少许培养好的菌株，放在载玻片的水滴中涂匀，注意菌量不宜过多，否则，不易看清单个菌体。0041 S2.固定：将涂好的玻片在酒精灯火焰上快速通过34次，使水份蒸发，此时细菌菌体紧贴在玻片上。0042 S3. 初染：加草酸铵结晶紫染色剂1滴，染色1分钟。0043 S4.媒染：。
29、倾去染液并用洗瓶装水轻轻冲洗，加碘液染色1分钟，水洗，然后用吸水纸吸干。0044 S5.脱色：将载玻片略倾斜，滴加95%酒精脱色2030秒（洗至流下的酒精中无紫色时为止），然后水洗。0045 S6.复染：在玻片上滴加番红染液约2分钟，水洗，然后用吸水纸吸干。染色中应防止染液干涸。0046 S7.镜检：干燥后用油镜进行镜检，镜检显示为一株革兰氏阳性杆菌，杆状。菌体形态结果见附图2。0047 实施例2 抑菌试验说 明 书CN 104480033 A6/9页8由于炭疽病和荔枝霜疫霉病是采后荔枝最常见的病害，因此本实施例选用炭疽病菌、荔枝霜疫霉菌作为病原指示菌，来研究多粘类芽孢杆菌菌株dgnkzx00。
30、4的抑菌活性。0048 1、制备悬浮液将50%甘油管冷冻保藏的多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004 的甘油管冷冻保藏的菌种按2%(v/v)接种量到20mL改良LB液体培养基中，并于32培养箱中静置活化培养20小时；将活化好的种子液按5%(v/v)接种量接到1000mL改良LB液体培养基中，并于32培养箱中震荡培养20小时；发酵完成后，发酵液经8000r/min、4离心15min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，离心获得所需的活菌体。最后用适量生理盐水将菌体悬起制成细胞悬浮液。0049 所述改良LB液体培养基的成分：蛋白胨15g/L，葡萄糖20g/L。
31、，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000mL，pH6.8，121灭菌20min。菌株培养温度32。0050 2、抑制效果检测设置对照组和实验组：（1）对照 ：用一毫升枪头的大口端打取真菌（霜疫霉菌，炭疽病菌）培养基块置于PDA平板中央生长。0051 （2）发酵液组：取2毫升发酵液（完全发酵液，包括菌体）和18毫升带有琼脂的PDA培养基混匀，倒于平板上，冷却，用一毫升枪头的大口端打取真菌培养基块置于平板中央生长。0052 （3）发酵液上清组：取2毫升发酵液上清（完全发酵液经过离心后的上清，不包括菌体）和18毫升带有琼脂的PDA培养基混匀，倒于平板上，冷却，用一毫升枪头的大口端打取真菌（霜疫。
32、霉菌，炭疽病菌）培养基块置于平板中央生长。0053 （4）菌体悬浮液组：取2毫升菌体悬浮液（完全发酵液经过离心后的菌体）和18毫升带有琼脂的PDA培养基混匀，倒于平板上，冷却，用一毫升枪头的大口端打取真菌（霜疫霉菌，炭疽病菌）培养基块置于平板中央生长。0054 结果如附图3和附图4所示，附图3为多粘类芽孢杆菌dgnkzx004对炭疽菌的抑制结果，附图4为对霜疫霉菌的抑制结果。0055 与对照组相比，多粘类芽孢杆菌dgnkzx004菌株，以及其发酵液和发酵液上清，均对霜疫霉菌和炭疽病菌都有很好的抑制作用。0056 3、抑菌率计算抑菌率（%）= (对照菌落平均直径处理菌落平均直径) / 对照菌落平。
33、均直径 100。0057 结果如表1所示，结果显示，本发明的多粘类芽孢杆菌dgnkzx004菌株、以及其发酵液和发酵液上清，均对炭疽病菌和荔枝霜疫霉菌都有很好的抑制作用。0058 表1 多粘类芽孢杆菌 dgnkzx004对炭疽菌及霜疫霉菌的抑制率说 明 书CN 104480033 A7/9页9实施例3 抑制酶活试验由于多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）是荔枝褐变过程中最重要的两种酶，因此，本实验选用PPO和POD进行酶活抑制试验。0059 1、粗酶液的制备：取荔枝果皮2g，用5倍体积重量比的0.2M pH6.8的磷酸缓冲液加0.4g PVP冰浴研磨，4、9500r/min离心15min。
34、，收集上清液即为粗酶液，4保存备用。0060 2、POD 酶活性测定（1）反应体系包括：2175L pH6.8的磷酸缓冲液（组成为：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，常规方法配制），375L 0.08%（体积比浓度）H2O2溶液，325L抑制剂，750L 0.05M愈创木酚溶液，75L稀释10倍的上述粗酶液。0061 （2）上述反应体系中，抑制剂为：实验组：50%甘油管冷冻保藏的dgnkzx004菌种，按体积比5%接种量在LB液体培养基中发酵2天，发酵完成后，发酵液经9500r/min、4离心15min收集菌体，用0.9%无菌生理盐水洗涤2次，4放置备用。用0.9%生理盐水制备含菌体细胞浓度为10610。
35、9CFU/mL的发酵液作为抑制剂进行试验。0062 对照组：前述0.2M pH6.8 的磷酸缓冲液代替。0063 （3）在470nm处测量吸光值，从上述酶液加入开始计时，每10秒记录一次吸光值，以最初直线斜率计算酶活。一个酶活单位定义为： 在测定条件下， 吸光值每分钟增大0.001所需的酶量，酶活平行测定三次。dgnkzx004 对POD活性影响效果见附图5所示。0064 3、PPO 酶活性测定（1）反应体系包括：2550L 0.2M pH6.8 的磷酸缓冲液（组成为：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，常规方法配制），750L 0.2M邻苯二酚溶液（组成为：上述磷酸盐缓冲液制备的邻苯二酚溶液），325L。
36、抑制剂，75L上述粗酶液。0065 （2）上述反应体系中，抑制剂为：实验组：50%甘油管冷冻保藏的dgnkzx004菌种按5%接种量在MRS液体培养基中发酵2 天，发酵完成后，发酵液经 9500r/min、4离心 15min 收集菌体，用 0.9% 无菌生理盐水洗涤2次，4放置备用。用0.9%生理盐水制备含菌体细胞浓度为106109CFU/mL的发酵液作为抑制剂进行试验。0066 对照组用0.2M pH6.8 的磷酸缓冲液。0067 （3）在398nm处测量吸光值，从上述酶液加入开始计时，每10秒记录一次吸光值，以最初直线斜率计算酶活。一个酶活单位定义为： 在测定条件下， 吸光值每分钟增大0.。
37、001所需的酶量，酶活平行测定三次。dgnkzx004 对PPO活性影响效果见附图6所示。0068 综上所述，本发明的多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004菌株说 明 书CN 104480033 A8/9页10对荔枝的多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）的活性均有抑制作用。0069 实施例4 保鲜试验1、菌株的培养：S1.菌株的活化：将多粘类芽孢杆菌（ Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004 的甘油菌种按2%(v/v)接种量接到20mL LB液体培养基中，并于32培养箱中静置活化培养20小时，得种子液；S2.扩大培养：。
38、将活化好的种子液按5%(v/v)接种量接种到1000mL LB液体培养基中，并于32培养箱中静置培养20小时；S3.菌体悬液制备：发酵完成后，发酵液经9500r/min、4离心15min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，离心获得所需的活菌体。最后用适量生理盐水将菌体悬起制成细胞悬浮液。0070 所述改良LB 液体培养基成分如实施例1所述。0071 2、保鲜菌剂的配制：保鲜菌剂含有如下质量百分比的组分：纳他霉素0.3g/L，乳酸钠1%，氯化钠0.85%，水余量；在上述各组分组成的100%体系中加入所述菌株的菌体悬液，使其在体系中的菌体浓度为7.8108CFU/mL。0072 3、以桂味荔枝为对象。
39、进行保鲜实验（1）荔枝果实预处理：在晴天早上采摘荔枝果实，选取健康无病虫害、大小均一、无机械损伤、约8成熟的荔枝果实；5条件下对荔枝预冷2h，冷风（ 0空调房冷风）吹干表面水分；用紫外灯照射30min进行杀菌处理。0073 （2）实验分组实验组：对上述预处理过的荔枝果实，用上述保鲜剂浸泡荔枝果实3min，冷风吹干，以食盒盛装，并在食盒内部铺垫包装纸以免荔枝果皮被水珠浸渍引起褐变，在5、相对湿度80%90%条件下贮藏。0074 对照组：对上述预处理过的荔枝果实，用自来水均匀喷涂在荔枝果实表面，常温晾干后以食盒盛装，并在食盒内部铺垫包装纸以免荔枝果皮被水珠浸渍引起褐变，在10、相对湿度80%85%。
40、条件下贮藏。0075 （3）好果率统计结果如附图7所示，在4天的贮藏期后，实施例好果率高达80% 以上，而对照例仅为60%。在5天的贮藏期后，实施例好果率可达40%，而对照例几乎为0%。在6天的贮藏期后，实施例好果率仍然有20%，而对照例为0%。0076 褐变指数结果如附图8所示，贮藏5天后，实施例的褐变指数为1.8，对照例为4.7。贮藏6天后，实施例的褐变指数为3，对照例为5。0077 4、以糯米糍荔枝为对象进行保鲜实验（1）荔枝果实预处理：在晴天早上采摘荔枝果实，选取健康无病虫害、大小均一、无机械损伤、约8成熟的荔枝果实；5条件下对荔枝预冷2h，冷风（ 0空调房冷风）吹干表面水分；用紫外灯照射30min进行杀菌处理。0078 （2）实验分组实验组：对上述预处理过的荔枝果实，用上述保鲜剂浸泡荔枝果实3min，冷风吹干，以食盒盛装，并在食盒内部铺垫包装纸以免荔枝果皮被水珠浸渍引起褐变，在5、相对湿度说 明 书CN 104480033 A。