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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410667350.3(22)申请日 2014.11.20C12P 19/26(2006.01)(71)申请人 海南金海岸生物技术研究所地址 570200 海南省海口市人民路 39 号南苑大厦 B-9D(72)发明人 张学文(74)专利代理机构 北京联瑞联丰知识产权代理事务所 ( 普通合伙 ) 11411代理人 朱广存(54) 发明名称一种发酵法制备氨基寡糖素的方法(57) 摘要一种发酵法制备氨基寡糖素的方法，将产壳聚糖酶假单胞菌按0.110106个/mL接种于发酵培养基中，在发酵温度 25 30的条件下，发酵培养 2 4 天，分离。
2、提纯，既得氨基寡糖素 ；其中，所述发酵培养基每升组分包括 ：壳聚糖 10 20g、NaCl 0.1 1g、KH2PO40.1 1g、微量金属离子化合物 0.005 0.05g、表面活性剂 0.1 1g，水定容至 1L，pH5.5 7.0。本发明在大量实验的基础上，选择合适产壳聚糖酶假单胞菌，优化培养基和发酵条件，能够高产、高效地制备氨基寡糖素，反应条件温和，容易控制，并避免了寡聚体的破坏。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页(10)申请公布号 CN 104480167 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 10448。
3、0167 A1/1 页21.一种发酵法制备氨基寡糖素的方法，其特征在于，将产壳聚糖酶假单胞菌按 0.1 10106个 /mL 接种于发酵培养基中，在发酵温度 25 30的条件下，发酵培养 2 4 天，分离提纯，既得氨基寡糖素 ；其中，所述发酵培养基每升组分包括 ：壳聚糖 10 20g、NaCl 0.1 1g、KH2PO40.1 1g、微量金属离子化合物0.0050.05g、表面活性剂0.11g，水定容至1L，pH5.57.0。2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，产壳聚糖酶假单胞菌的接种量为 1 5106个 /mL。3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，发酵温度为 27 28。。
4、4.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，发酵培养时间为 3 天。5.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基每升组分中含壳聚糖10-15g。6.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述微量金属离子化合物为能提供 Fe2+、Mn2+、C u2+、Z n2+、C a2+、F e3+、A l3+、N i2+或 Co2+的化合物中的一种或多种。7.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基每升组分中含表面活性剂 0.1 0.5g。8.根据权利要求 7 所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂为吐温 20 或吐温 80。9.根据权利要求18中任意一项所述的方法，其。
5、特征在于，所述产壳聚糖酶假单胞菌为假单胞菌 H3。权 利 要 求 书CN 104480167 A1/3 页3一种发酵法制备氨基寡糖素的方法技术领域0001 本发明涉及一种发酵法制备氨基寡糖素的方法。背景技术0002 氨基寡糖素(壳寡糖)是指D-氨基葡萄糖以-1,4糖苷键连接的低聚糖。壳寡糖可改变土壤微生物区系，促进有益微生物的生长而抑制一些植物病原菌 ；可刺激植物生长，使农作物和水果蔬菜增产丰收 ；可诱导植物的抗病性，对多种真菌、细菌和病毒产生免疫和杀灭作用，对小麦花叶病、棉花黄萎病、水稻稻瘟病、番茄疫病等病害具有良好的防治作用。同时，壳寡糖对多种植物病原菌具有一定程度的直接抑制作用。壳寡糖在。
6、应用上具有微量(PPM 级 )、高效、低成本、无公害等特点，对我国农业可持续性发展具有重要意义。目前，氨基寡糖素杀菌农药已经在我国进行了大面积的推广应用，对我国农业的可持续性发展具有重要意义。0003 现常用的氨基寡糖素的制备方法有采用酸降解壳聚糖和甲壳素等或者采用酶降解壳聚糖和甲壳素等。采用酸降解壳聚糖和甲壳素等，由于反应条件难控制，并且提纯困难，成本高。而采用酶降解壳聚糖和甲壳素等，需要先行制备酶，成分高。发明内容0004 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效、高产的制备氨基寡糖素的方法。0005 本发明是这样实现的 ：0006 一种发酵法制备氨基寡糖素的方法，将产壳聚糖酶假单。
7、胞菌按0.110106个/mL 接种于发酵培养基中，在发酵温度 25 30的条件下，发酵培养 2 4 天，分离提纯，既得氨基寡糖素 ；0007 其中，所述发酵培养基每升组分包括：壳聚糖1020g、NaCl 0.11g、KH2PO40.1 1g、微量金属离子化合物 0.005 0.05g、表面活性剂 0.1 1g，水定容至 1L，pH5.5 7.0。0008 优选地，产壳聚糖酶假单胞菌的接种量为 1 5106个 /mL。0009 优选地，发酵温度为 27 28。0010 优选地，发酵培养时间为 3 天。0011 优选地，所述发酵培养基每升组分中含壳聚糖 10-15g。0012 优选地，所述微量金。
8、属离子化合物为能提供 Fe2+、M n2+、C u2+、Z n2+、C a2+、F e3+、A l3+、Ni2+ 或 Co2+ 的化合物中的一种或多种。0013 优选地，所述发酵培养基每升组分中含表面活性剂 0.2 0.5g。0014 其中，所述为表面活性剂用于改变培养基表面张力，可以为改变液体表面张力的常用表面活性剂，例如吐温、脂肪醇聚氧乙烯醚 (AE) 等。0015 优选地，所述表面活性剂为吐温 20 或吐温 80。说 明 书CN 104480167 A2/3 页40016 优选地，所述产壳聚糖酶假单胞菌为假单胞菌 H3。0017 本发明在大量实验的基础上，选择合适产壳聚糖酶假单胞菌，优化。
9、培养基和发酵条件，能够高产、高效地制备氨基寡糖素，反应条件温和，容易控制，并避免了寡聚体的破坏。具体实施方式0018 下面结合具体的实施例对本发明做进一步地描述，以更好地理解本发明。0019 实施例 10020 取假单胞菌 H3 斜面培养菌，按 5106个 /mL 接种于发酵培养基中，在发酵温度27的条件下，发酵培养 3 天，离心，取上清液，上清液即为含氨基寡糖素的溶液，进一步分离提纯，既得氨基寡糖素 ；0021 其中，所述发酵培养基每升组分包括：壳聚糖10g、NaCl 0.5g、KH2PO40.5g、FeSO40.01g、吐温 20 0.5g，水定容至 1L，pH6.5。0022 将上清液在。
10、沸水浴保持 5min，过滤，滤液用铁氰化钾测定还原糖，以还原糖计氨基寡糖素的含量 (mol/mI)，经检测，氨基寡糖素的含量为 15.2mol/mI。0023 实施例240024 实施例 2 4 与实施例 1 的不同之处，在于假单胞菌 H3 的接种量不同，分别为0.1106个 /mL、1106个 /mL 和 10106个 /mL。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为 3.8mol/mI、10.3mol/mI 和 8.1mol/mI。0025 实施例570026 实施例 5 7 与实施例 1 的不同之处，在于发酵温度不同，分别为 25、28和30。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡。
11、糖素的含量分别为 5.4mol/mI、12.6mol/mI 和 7.9mol/mI。0027 实施例890028 实施例89与实施例1的不同之处，在于发酵培养时间不同，分别为2天和4天。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为 11.4mol/mI 和 13.2mol/mI。0029 实施例 10 120030 实施例 10 12 与实施例 1 的不同之处，在于发酵培养基中壳聚糖的含量不同，每升发酵培养基分别含有12g、15g和20g。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为 14.8mol/mI、13.5mol/mI 和 10.2mol/mI。从产率上看，壳聚糖浓度越大越。
12、不利于氨基寡糖素的生产，这可能是壳聚糖浓度大，培养液的粘度也大，从而影响了菌种的生长。0031 实施例 13 200032 实施例1320与实施例1的不同之处，实施例1中的FeSO4分别用能提供Mn2+、C u2+、Z n2+、C a2+、F e3+、A l3+、N i2+或 Co2+的化合物替换。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为 14.6mol/mI、14.8mol/mI、14.2mol/mI、14.5mol/mI、13.8mol/mI、14.6mol/mI、15.0mol/mI 和 13.5mol/mI。0033 实施例 21 250034 实施例 21 25 与实施例 。
13、1 的不同之处，在于发酵培养基中表面活性剂种类和含说 明 书CN 104480167 A3/3 页5量不同，每升发酵培养基分别含有吐温 20 0.1g、吐温 20 1g、吐温 80 0.1g、吐温 80 1g 和吐温 80 0.5g。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为 10.5mol/mI、6.7mol/mI、9.8mol/mI、5.9mol/mI 和 15.0mol/mI。0035 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。说 明 书CN 104480167 A。