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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410751410.X(22)申请日 2014.12.10C12N 5/0775(2010.01)(71)申请人 敖云霞地址 550000 贵州省贵阳市云岩区北京路 4号贵医 2006 级学生集体宿舍(72)发明人 敖云霞(74)专利代理机构 贵阳中新专利商标事务所 52100代理人 程新敏(54) 发明名称一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法(57) 摘要本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法，该方法采用组织块植入法培养原代 ，绘制细胞生长曲线，根据细胞生长状态选第 代 进行实验，流式。
2、细胞术、透射电镜和免疫细胞化学等技术研究 的生物学特性，本发明所培养的细胞基本符合委员会制定的鉴定 的标准，可确认为人脐带间充质干细胞，这一结果将为后续试验提供具有较强增殖能力及诱导分化潜能的种子细胞。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页 附图1页(10)申请公布号 CN 104480067 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104480067 A1/1页21.一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法，其特征在于：该方法采用组织块植入法培养原代 ，绘制细胞生长曲线，根据细胞生长状态选第 代 进行实验。
3、，流式细胞术、透射电镜和免疫细胞化学等技术研究 的生物学特性。权 利 要 求 书CN 104480067 A1/4页3一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法技术领域0001 本发明涉及一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法，属于生物医药技术领域。背景技术0002 间 充 质 干 细 胞 （ ，）是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可来源于多种组织，如骨髓、脂肪、脐带等，最近资料表明，人脐带间充质干细胞（-，-）存在于新生儿脐带中，富含于羊膜被覆上皮与脐 带 血 管 之 间 的 华 通 胶 （即 ）内，脐带属于废弃物，取材方便，且无伦理学限制，从脐带。
4、内提取干细胞成本较低。具有 的一般特性：处于未分化状态，表达间充质干细胞膜标记分子，不表达或低表达造血干细胞标记分子；体外可向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞等方向分化，具有高增殖性、低免疫原性、细胞替代治疗效果显著等特点，已被广泛地应用于临床基因和细胞治疗中，尽管如此，基础方面的研究仍然面临较多问题。发明内容0003 本发明的目的是：提供一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法，该方法采用组织块植入法获得的具有较强的增殖能力，在体外诱导培养下可向成骨和成脂细胞分化，以克服现有技术的不足。0004 本发明的技术方案一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法，该方。
5、法采用组织块植入法培养原代 ，绘制细胞生长曲线，根据细胞生长状态选第 代 进行实验，流式细胞术、透射电镜和免疫细胞化学等技术研究 的生物学特性。0005 由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明所培养的细胞基本符合委员会制定的鉴定 的标准，可确认为人脐带间充质干细胞，这一结果将为后续试验提供具有较强增殖能力及诱导分化潜能的种子细胞。附图说明0006 附图1为生长曲线图。具体实施方式0007 下面对本发明进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。说 明 书CN 104480067 A2/4页40008 本发明的实施例： 材料与方法 实验材料足月剖腹产手术的健康胎儿脐带组织（家属知情同意。
6、，贵阳医学院附属医院产科提供）。脐带采集之前产妇需做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、支原体等病原检测。脐带采集后 保存，在 内完成组织分离处理。0009 的体外培养预冷 反复冲洗脐带后，将其剪成约 长的小段，剔除脐静脉内膜、脐动脉和脐带外膜后，剪成约 大小的组织块，用钩针将组织块点兵式间距 摆放于 培养瓶底壁（培养基预湿润），将培养瓶底壁朝上置入 培养箱中，、 以及饱和湿度下进行培养；次日翻转培养瓶，每隔加入培养基；后换液，以后每换液次，待细胞长到融合时弃去组织块，的胰蛋白酶（约 ）消化收集贴壁细胞并进行传代培养。0010 的形态学观察及生长曲线绘制取生长状。
7、态良好的第 、代 ，待细胞生长到 汇合时，胰蛋白酶消化收获细胞，以每孔 细胞的密度将细胞接种六孔板中，常规培养细胞。接种后，每天取各代细胞（各 孔）进行计数，连续计数 ，并绘制细胞生长曲线。0011 的透射电镜观察取生长状态良好的第 代 ，预冷的戊二醛于 固定 次，锇酸于 固定 后， 丙酮酸逐级脱水，包埋剂包埋，醋酸铀和枸橼酸铅染色，洗涤后滤纸吸干，透射电镜（，日本）下观察并照相。0012 . 表面抗原及细胞周期的检测取生长状态良好的第 代 ，洗涤次，下封闭 ，将细胞以 浓度悬浮于含鼠抗人 、的中及鼠抗人 、的 中，室温下避光孵育 。洗涤细胞 次后，将细胞悬浮于 中，吹打混匀后过目细胞筛，上流。
8、式细胞仪（公司，美国）检测，软件分析数据。细胞周期检测操作利用 酒精固定细胞和 染色。0013 . 免疫细胞化学法检测 表面分子将第 代 细胞接种于事先置入经多聚赖氨酸处理盖玻片的 孔板（孔）中，待细胞生长到 汇合时取出盖玻片。用 的多聚甲醛固定细胞（室温，），洗涤 次，.处理细 胞 ，处 理，洗涤 次，山羊血清封闭细胞 ，弃掉羊血清不洗，兔抗人 、单克隆抗体常温孵育 （具体操作按 免疫组织化学试剂盒说明进行）。洗涤 次后，封片，显微镜（-，日本）下观察并照相。0014 . 的成骨和成脂诱导说 明 书CN 104480067 A3/4页5将第 代 分别接种于（置入多聚赖氨酸处理盖玻片）含成骨诱。
9、导培养基（含 .地塞米松、.维生素 和甘油磷酸钠）和成脂诱导培养基（含 .地塞米松、胰岛素、.-甲基-异丁-基黄嘌呤和 .吲哚美辛）的 孔培养板中常规培养 .。0015 . 成骨诱导后碱性磷酸酶染色 取出经成骨诱导剂培养的 ，洗涤 次，多聚甲醛固定细胞 ，常规 . 室温下处理 细 胞 ，洗 涤 次,处 理，洗涤 次，山羊血清室温下封闭细胞，弃掉羊血清不洗，加入 兔抗人碱性磷酸酶抗体（按照 法免疫组织化学试剂盒说明书操作）。洗涤 次后，封片，显微镜下观察并照相。0016 . 成脂诱导后油红 染色 取出经成脂诱导剂培养的 ，洗涤 次，酒精固定，弃掉酒精，加入油红 稀释液 ，室温下染色；双蒸水漂洗细。
10、胞次，倒置相差显微镜（-，日本）下观察细胞染色情况并照相。0017 . 统计学分析数据以 表示，采用 -统计软件进行方差分析及均数间比较。0018 结果. 的形态及生长曲线脐带组织块于接种后第 天其周围即有大量圆形细胞游出并贴壁生长，在第 天多数细胞贴壁生长并变为三角形或短梭形，第天绝大部分细胞变为长梭形或杆状，且局部细胞开始逐渐汇合生长。传代的细胞多呈长梭形或分支状，在接种后第 天即大量汇合且呈漩涡状生长，部分传代的细胞出现集落样生长，传到代细胞形态基本不变。细胞生长曲线表明，第 天为潜伏期，第 天为对数生长期；第 天后细胞生长明显减慢，进入平台期。各组之间比较显示，第 代 增殖能力相对较强。
11、（附图1）。0019 . 超微结构超微结构所示，形态不规则，核大不规则，核质比大，有 个明显核仁、核内染色质稀疏且弥散分布于细胞核内，胞质较少且分布于核周，细胞器较少见。0020 . 表面分子表达流式细胞仪检测显示细胞阳性表达 ，极弱阳性表达 ；阳性表达 ，极弱阳性表达 。0021 免疫细胞化学检测结果免疫细胞化学检测显示，强阳性表达、分子，弱阳性表达 分子， 向成骨和成脂细胞诱导分化成骨诱导剂诱导培养 后，大部分 碱性磷酸酶染色呈阳性表达，多数细胞胞质出现较多的棕黄色颗粒；经成脂肪细胞诱导剂诱导培养 后，多数细胞胞质内出现大量脂滴，被油红 染为棕红色。说 明 书CN 104480067 A4。
12、/4页60022 讨论是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉等多种成体细胞，是组织再生医学的一种较为理想的种子细胞，以往临床 移植的研究多是采用骨髓来源 和脐带血来源的 ，但二者均有不同程度的缺点，骨髓取材是创伤性手术，会给骨髓供者造成身体上和心理上的伤害，同时还会给供者带来传染性及感染性疾病，而脐带血 的增殖性较低，数量不能充分满足临床对 的需求，是新近发现的一种具有较好应用前景的间充质干细胞，其来源材料充足。若脐带来源的 也具有很强的增殖和分化能力，将可作为干细胞移植治疗和再生医学的理想选择。目前，国际细胞治疗协会。
13、（）委员会已经制定出了一系列标准来鉴定间充质干细胞，包括三方面：细胞形态学鉴定、细胞表面抗原表型分析以及多向分化潜能，本课题组除了按照 的标准对培养细胞进行基本形态学观察及生长曲线检测、流式细胞仪分析细胞表面标记分子和向成骨、成脂诱导分化能力三方面鉴定外，还较系统的研究了培养细胞的超微结构特点。本实验采取组织块培养法从脐带中分离培养，分离的细胞传代培养后呈长梭形，形态与骨髓间充质干细胞相似，呈漩涡状生长，与国内外研究报道基本一致；通过传统计数法绘制第、代细胞生长曲线发现，细胞第 天为潜伏期，第天为对数生长期，后进入平台期，以第 代细胞的增殖能力较强，细胞群体倍增时间约为，且细胞可稳定传到代左右。
14、，其形态及增殖分化能力基本不变。所以后续实验所用的细胞均为培养的第 代 。迄今为止，间充质干细胞尚未发现特异性的膜表面相关抗原分子。以往的研究表明成熟 稳定且高表达 、等膜表面标记分子，不表达或较低表达 、等内皮细胞和造血细胞特异性分子，荧光标记抗体染色流式细胞仪检测及免疫细胞化学染色法是一种鉴 定 细 胞 膜 表 面 标 记 分 子 表 达 的 重 要 方法，本实验结果显示，细胞阳性表达 、和 等膜表面标记分子，阴性表达 和 分子，与以往研究结果一致，为进一步确定所培养的细胞是否具有间充质干细胞的多向分化能力，本实验采取分别添加成骨、成脂诱导因子对培养的细胞进行诱导分化，于诱导的第 天，分别。
15、给予碱性磷酸酶染色和油红染色显示诱导分化情况，结果显示胞浆内碱性磷酸酶及油红 均呈阳性表达，提示所诱导的细胞已向成骨、成脂方向分化。表明培养的细胞符合间充质干细胞的多向分化特性。近年来，国内外学者对间充质干细胞的研究主要体现在细胞形态学、表面标记分子、诱导分化潜能方面，但对其超微结构特点的研究少见。本实验用透射电镜观察培养的细胞，发现 胞核大，核质比较大，可见明显核仁，核内常染色质比较疏松，胞质量少，细胞器较少见。核质比大提示细胞处于幼稚状态，核仁明显、常染色质疏松、弥散于核内提示细胞处于分裂间期。以上研究结果表明，所培养的细胞基本符合委员会制定的鉴定 的标准，可确认为人脐带间充质干细胞，这一结果将为后续试验提供具有较强增殖能力及诱导分化潜能的种子细胞。说 明 书CN 104480067 A1/1页7图1说 明 书 附 图CN 104480067 A。