说明书松香型二萜衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及松香型二萜衍生物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。
背景技术
臭牡丹(Clerodendrum bungei Steud.)为唇形科大青属植物。别名臭八宝、大红袍(植物名实图考)，矮桐子(分类草药性)，臭梧桐(广西药用植物名录)，逢仙草(湖南药物志)，臭黄根、臭茉莉(庐山中草药)。根、茎、叶入药，性平，味辛，无毒。有祛风解毒、消肿止痛之功效，主治痈疽、痔疮、高血压、风湿痹痛、子宫脱垂。臭牡丹的主要化学成分包括二萜、苯乙醇苷、黄酮、有机酸等。据报道，这些成分具有细胞毒活性、抗氧化活性、降血压及降血糖活性。目前没有臭牡丹提取物及其化学成分治疗脂代谢异常的报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明提供几类新的松香型二萜类衍生物及其制备方法和应用，为预防或治疗脂代谢异常筛选理想的药物。
本发明所述的松香烷型二萜衍生物，是具有通式I、II或III所示结构的化合物：
或其与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐；
其中，R1为氢、羟基或C1～C3的烷氧基或酰氧基；R2为C1～C3的饱和或不饱和烃基、C1～C3的含氧烷基或C1～C3的酸及其酯或盐。
作为一种优选方案，所述的R1选自氢、羟基或甲氧基；所述的R2选自甲基、羟甲基或甲氧羰基。
作为进一步优选方案，所述松香型二萜衍生物包括下述化合物中的一种：
一种制备本发明所述的松香型二萜衍生物的方法，包括如下步骤：
以唇形科大青属植物臭牡丹的根部或地上部分为原料，经溶剂提取、萃取、柱层析分离和纯化制得；其中：提取溶剂为任意比例的醇-水混合物；提取方法采用回流提取法、超声提取法、冷浸提取法、温浸提取法、渗漉提取法中的任意一种；萃取剂选自C1～C10的烷烃或卤代烃、C1～C10的醇、C1～C10的酮、C1～C10的酯或其混合物，及以上溶剂与水任意比例的混合溶剂；进行柱层析分离的洗脱溶剂选自石油醚、环己烷、正己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇或甲醇中的至少一种；洗脱方式包括单一溶剂或混合溶剂的正相洗脱、反相洗脱或梯度洗脱；柱层析填料选自硅胶、硅藻土、氧化铝、吸附树脂、葡聚糖凝胶或ODS反相填料中的至少一种。
作为一种优选方案，所述烷烃类溶剂的通式为CnH2n+2或CnH2n，n<10；卤代烃溶剂通式为CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3，n<10，R=Cl,Br或I；醇类溶剂通式为CnH2n+1OH或CnH2n-1OH，n<10；酮类溶剂通式为CnH2nO或CnH2n-2O，n<10；酯类溶剂通式为CnH2nO2或CnH2n-2O2。
作为一种优选方案，所述制备方法包括如下步骤：
a)以臭牡丹为原料，粉碎后，用体积分数为95%的乙醇水溶液进行回流提取2～3次，每次回流1～2小时；
b)过滤，合并提取液，减压浓缩；将得到的浸膏混悬于水中，用小极性有机溶剂（如石油醚、正己烷、石油醚与乙酸乙酯的混合液等溶剂）萃取，有机相通过硅胶柱进行层析，用石油醚或石油醚与乙酸乙酯的混合液进行梯度洗脱，用薄层色谱法检视，分段收集；
c)将硅胶柱分离部位用凝胶柱进行层析，用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合液进行洗脱，然后再用硅胶柱进行层析，用体积比为9:1～2:1的二氯甲烷和甲醇的混合液进行洗脱，用薄层色谱法检视，直至得到所述衍生物的纯品。
本发明所述的松香型二萜衍生物的一种应用，是以所述的松香型二萜衍生物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备治疗由脂代谢异常所引起的疾病的药物。
作为一种优选方案，所述的由脂代谢异常所引起的疾病包括高甘油三脂、高胆固醇、肥胖症、动脉粥样硬化中的至少一种。
作为一种优选方案，所述的松香型二萜衍生物为如下化合物：
及其与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐中的至少一种。
本发明的有益效果在于：本发明在分离得到松香烷型二萜类衍生物的基础上，证实了该类化合物具有抑制固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的表达作用，为开发治疗脂代谢异常的药物提供了先导化合物，对开发天然产物和植物药的新用途具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案做进一步详细、完整地说明。
实施例1
取臭牡丹根1kg，粉碎后加入3L体积分数为95%的乙醇中进行回流提取，回流提取2次，每次2小时，过滤并合并提取液，减压回收乙醇后将浸膏混悬于水中，用石油醚（60～90℃）萃取混悬液5次，合并石油醚层并减压回收溶剂，得石油醚部位；将得到的石油醚部位通过硅胶柱层析，依次用体积比为20:1、10:1、8.5:1.5、7:3和1:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液进行梯度洗脱，薄层色谱法检视，分段收集，得5个部位(Fr.1～Fr.5)，其中，Fr.2和Fr.4先经Sephadex LH-20柱层析，用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合液进行洗脱，再经硅胶柱层析，用体积比分别为10:1、8.5:1.5、4:1的石油醚与乙酸乙酯的混合液进行梯度洗脱，得化合物IV、V和IX；Fr.5先经Sephadex LH-20柱层析，用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱后，再经ODS柱层析，分别用体积为8:2、9:1、1:0的甲醇和水的混合液进行梯度洗脱，得化合物VI、VII和VIII。
实施例2
取臭牡丹全株2kg，粉碎后加入6L体积分数为95%乙醇进行超声提取，提取3次，每次30分钟，过滤并合并提取液，减压回收乙醇后将浸膏混悬于水中；用石油醚（60～90℃）萃取混悬液5次，合并石油醚层并减压回收溶剂，得石油醚部位；将得到的石油醚部位通过硅胶柱层析，依次用体积比为20:1、10:1、8:2、和1:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液进行梯度洗脱，薄层色谱法检视，分段收集含二萜的流份，得4个部位(Fr.1～Fr.4)；其中Fr.2和Fr.3先经Sephadex LH-20柱层析，用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱后，再经硅胶柱层析，依次用体积比为10:1、8.5:1.5、7:3、4:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱，得化合物IV、V和IX；Fr.4先经Sephadex LH-20柱层析，用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱后、再经硅胶柱层析，分别用体积比为8.5:1.5、7:3、4:1、2:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液进行梯度洗脱，最后经ODS柱层析，分别用体积比为8:2、8.5:1.5、9:1、9.5:0.5的甲醇和水的混合液进行梯度洗脱，得化合物VI、VII和VIII。
化合物IV：臭牡丹酯A，为黄色无定型粉末。
HRESIMS（高分辨质谱）：399.1406，[M-H]-(calcd.for399.1444)；
：+18.4(c0.08,CH2Cl2)；
UV(CH2Cl2)：λmax(logε)，243(4.35),276(4.38),295(4.36)nm；
IR(KBr)：νmax3350,2936,1717,1622,1441,1340,1277,1119,1107,992,826,756cm-1；
1H NMR及13CNMR数据见表1所示。
化合物V：15-去氢大青酮A，为黄色无定型粉末。
HRESIMS：355.1583，[M-H]-(calcd.for355.1545)；
：+18.3(c0.07,CH2Cl2)；
UV(CH2Cl2)：λmax(logε)229(4.41),266(4.30)nm；
IR(KBr)：νmax3274,2923,2870,1624,1597,1567,1467,1438,1396,1223,1139,819,801cm-1；
1HNMR及13C NMR数据见表1所示。
化合物VI：15-去氢-17-羟基大青酮A，为黄色无定型粉末。
HRESIMS：395.1492，[M+Na]+(calcd.for395.1471)；
：–5.0(c0.08,CH2Cl2)；
UV(CH2Cl2)：λmax(logε)230(4.38),267(4.24)nm；
IR(KBr)：νmax3397,2932,1599,1449,1395,1247,1082,992,825cm-1；
1HNMR及13CNMR数据见表1所示。
表1.化合物IV-VI的1H-NMR(CDCl3,400MHz)及13C-NMR(CDCl3,100MHz)数据
实施例3
固醇调节元件结合蛋白(SREBP)信号转导途径是脂代谢信号转导主要途径之一，SREBP作为强大的激活因子，可直接激活30多个参与脂肪酸、甘油三醋和磷酸脂合成与摄取的基因表达。因此，抑制SREBP的表达，可以达到降血脂的目的。本发明通过测试化合物1-6对SREBP表达的抑制作用，来反映其降脂功效。
将pSRE-Luciferase质粒，pEGFP-N1质粒(Invitrogen)以5:1的比例转入Huh-7细胞株中，得到Huh-7/SRE-Luc细胞株。取生长状况好的Huh-7/SRE-Luc细胞进行实验，调整细胞浓度约为10000/孔。用移液器对96孔加液，每孔注入200μL细胞液进行细胞培养24h。将原来的培养液移去，用200μL的PBS清洗每孔，换160μL新鲜的含10%低脂蛋白血清（LPDS）,洛伐他丁（1μM），甲羟戊酸（10μM）及1%双抗的DMEM培养液,同时加入40μL含待测化合物（终浓度为20μM）及阳性药25-羟基胆固醇（终浓度为2.5μM）的LPDS-DMEM培养基，再次放入培养箱中培养16h后，取出细胞培养板，吸出培养液，用200μL的PBS清洗孔，在每孔中加入用水稀释五倍的130μL的细胞裂解液，经冻融一次后，用震摇器以1000rpm震摇3min，吸取20μL于96孔黑板中，将荧光素酶的底物事先用原装缓冲液溶解，要黑板中避光加入30μL/孔的荧光素酶底物，混匀后，立刻检测；吸取80μL细胞裂解液于384孔黑板中测定GFP的吸收值；待测样品及阳性药均以三复孔计。各处理组细胞的转染效率通过将SRE-Luciferase活性值除以同一样品的GFP的荧光吸收值进行校正；以含0.1%DMSO的溶媒对照组荧光素酶活性值作为基础表达(统计分析时以1表示)，以各组校正转染效率后的样品活性值与其的比值来反映诱导能力。
实验结果表明化合物IV～IX对SREBP的表达均有抑制作用，即具有一定的降脂作用。IC50值(SREBP的表达被抑制50%时所需的化合物浓度)见表2，25-羟基胆固醇为阳性对照。
表2.松香烷而萜类衍生物对SREBP表达的抑制作用
化合物IC50(μM)
IV13.76
V5.78
VI8.02
VII8.48
VIII4.89
IX11.67
25-羟基胆固醇1.36
综上实验可见，本发明所述化合物具有抑制固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的表达作用，可望开发成治疗脂代谢异常的药物，对开发天然产物和植物药的新用途具有重要意义。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。