一种全人源靶向EGFR/KDR的IGG样双特异性抗体.pdf

本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及抗表皮生长因子受体(EGFR)和抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2/KDR)的IgG样双特异性抗体(Bispecific antibody，Bi-Ab)的制备方法及用途。本发明利用基因工程技术将抗EGFR高亲和力单链抗体E10与抗KDR高亲和力单链抗体AK404的重轻链可变区交叉连接并与Fc(IgG1)段串联表达，形成的双特异性抗体能同时作用于肿瘤细胞表面表达的EGFR和KDR，可达到同时抑制或杀死肿瘤细胞及抑制或破坏肿瘤新生血管并保留抗体ADCC效应的目的。

权利要求书
1.  一种全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体，具有以下特征：该抗体以抗EGFR单链抗体、抗KDR的单链抗体及人源Fc(IgGl)段为基础，通过基因重组等手段，构建成IgG样双特异性抗体，并且各可变区及Fc片段之间通过柔性肽连接。

2.  根据权利要求1所述的一种全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体，具有以下特征：其完整结构由相同的两条肽链通过二硫键组成，其中每一条肽链由抗EGFR轻链可变区、抗KDR重链可变区、抗KDR轻链可变区、抗EGFR重链可变区和人源IgGl抗体Fc段组成。

3.  一种毕赤酵母分泌表达法，其特征在于：用于分泌表达权利要求1所述的全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体。

4.  一种分离的核酸，其特征在于：该核酸编码权利要求1的一种全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体。

5.  一种表达载体，含有权利要求4所述的核酸。

6.  一种重组宿主细胞，含有权利要求5所述的表达载体。

7.  权利要求1抗体的应用，其特征在于选择性地与EGFR/KDR结合或抑制EGFR/KDR与EGFR配体/KDR配体的结合阻断其信号的转导。

8.  权利要求1抗体的偶联物。

9.  权利要求1所述的全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体在治疗肿瘤药物中的应用。

说明书一种全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可与人表皮生长因子受体及人血管内皮生长因子受体2特异结合的高亲和力全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体，能特异性的抑制表皮生长因子受体和血管内皮生长因子受体2的活化。在体内外试验中，可显著抑制过表达表皮生长因子受体和血管内皮生长因子受体2的肿瘤细胞(HT-29、SKOV-3)的生长，是一种同时具有抗肿瘤及抗血管生成活性的特异性基因工程抗体。
背景技术
单链抗体以其特异性、均一性、可大量生产制备等优点，已经广泛应用于疾病的诊断和治疗。由于单链抗体具有这些优点，使其在肿瘤的诊断和治疗中具有一定的潜能，但也存在明显不足，如分子量小、亲和力低等。近年来，在肿瘤治疗中单链抗体的临床效果大多十分有限。为增强抗体的抗肿瘤效应，人们尝试了多种方法改造抗体分子，其中大分子抗体和多靶点抗体成为重要发展方向。IgG样双特异性抗体同时具备分子量大和多靶点的特性，可同时阻断两个独立抗原介导的信号转导通路，此外，还可延长抗体在体内的半衰期。制备全人源IgG样双特异性抗体的关键是使组成完整抗体的肽链含有两组抗体可变区及Fc段，并形成结构稳定的二聚体。全人源IgG样双特异性抗体是通过柔性肽来连接不同抗体可变区的，这使得同源抗体可变区的结构域相互配对，形成稳定且具有生物活性的两组完整的可变区。此外，全人源IgG样双特异性抗体包含Fc段，这使得宿主表达的肽链能通过二硫键形成稳定的同源二聚体。
近年来，靶向表皮生长因子受体和血管内皮生长因子受体2的抗体相继上市。它们通过作用不同的靶点、阻断各自的信号通路达到抗肿瘤药效。表皮生长因子受体是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，可通过多种配体(表皮生长因子和转化生长因子等)激活，在多种肿瘤的形成、发展和转移中起重要作用。血管内皮生长因子受体2是一种跨膜受体，在肿瘤的发生和发展过程主要中介导血管的新生。同时抑制表皮生长因子受体和血管内皮生长因子受体2的活性，对肿瘤的生长、转移、复发、预后均有明显的抑制作用。此外，表皮生长因子受体信号通路与血管内皮生长因子受体2信号通路之间存在交叉对话，因此同时抑制这两种信号通路的传导能显著增强抗体抗肿瘤活性。
表皮生长因子受体(EGFR)
人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种分子量为170kDa的跨膜糖蛋白，为表皮生长因子受体家族四成员之一，由c-erbB原癌基因编码。由胞外区、跨膜区及胞内区三个部分组成。跨膜区由一个亲脂性多肽螺旋构成，胞内区具有酪氨酸激酶活性；胞外区分成4个亚区，是EGFR与配体结合的部位。EGFR与其配体结合后可形成同源或异源二聚体，引起胞内区发生磷酸化，进而启动一系列胞内信号级联。EGFR可与以下配体结合：表皮生长因子(EGF)，双调蛋白，转化生长因子-α(TGF-α)，肝素结合EGF(hb-EGF)，epiregulin和β动物纤维素。EGFR与其配体介导的信号通路是细胞信号传导系统的一部分，调节多种细胞过程，包括激活控制细胞增殖、细胞存活、分化、血管发生、程序性细胞死亡、有丝分裂发生和转移等信号转导途径。据报道，EGFR的过度表达，能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移，EGFR的信号通路在肿瘤的形成和发展过程中占有重要的地位。EGFR过表达于多种肿瘤，包括乳 腺、结肠、头颈、前列腺、肺和卵巢癌等，且其过量表达的程度与不佳的临床预后相关。因此，EGFR已经成为重要的抗肿瘤治疗的特异性靶目标。
靶向EGFR药物主要有两类：一类是作用于受体胞内区段，防止信号传导的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，主要包括吉非替尼、erlotinib等等；另一类是阻断配体结合到受体胞外功能域的抗EGFR单克隆抗体(mAb)，包括西妥昔单抗(cetuximab)等。
血管内皮生长因子受体2(VEGFR2/KDR)
血管形成是一个复杂的生理过程，受多种作用因子的调控，其中血管内皮生长因子(VEGF)是主要的正性调控因子之一，其通过与血管内皮生长因子受体结合诱导新生血管的形成。血管内皮生长因子受体介导的信号通路与肿瘤新生内皮细胞的迁移、增殖、生存有关，在肿瘤周围血管新生过程中具有重要的作用，与机体多种常见肿瘤的发病及肿瘤的转移有着密切的关系。因此，血管内皮生长因子受体信号转导途径可作为抗肿瘤治疗方案的理想靶点。
VEGF家族有三种受体：VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，它们分别由fit-1、flk-1/KDR、fit-4基因编码，其中VEGFR-2(KDR)主要参与血管形成过程。KDR属酪氨酸激酶型受体，由胞外区、跨膜区及膜内区三部分组成。胞外区7个免疫球蛋白样区中，第3样区对VEGF的结合贡献最为突出。
靶向VEGF通路药物主要有三类：一类是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，主要包括Sutent，Sorafinib，PTK787，Zactima and Recentin等；一类是抗VEGF的单克隆抗体(mAb)，阻断配体与其受体结合，包括bevacizumab和aflibercept等；第三类是作用于血管内皮生长因子的抗体，如：Ramucirumab(IMC-1121B)，CDP-791等。
发明内容
发明目的
本发明提供一种具有抗肿瘤药效的全人源靶向EGFR/KDR的IgG样特异性抗体。本发明双特异性抗体的特征为特异性结合人EGFR胞外2区及KDR的胞外3区，含有Fc段，保留了抗体的ADCC效应，在体外能够抑制结肠癌细胞HT-29和卵巢癌细胞SKOV-3的生长，其抑制高表达EGFR和KDR肿瘤的效果要优于单独使用抗EGFR和抗KDR抗体。
技术方案
一种全人源靶向EGFR/KDR的IgG样特异性抗体，该抗体以抗EGFR单链抗体、抗KDR的单链抗体及人源Fc(IgG1)段为基础，通过基因重组等手段，构建成IgG样双特异性抗体，并且各可变区及Fc片段之间通过柔性肽连接，其完整结构由相同的两条肽链通过二硫键组成。
其中每一条肽链由抗EGFR轻链可变区、抗EGFR重链可变区、抗KDR轻链可变区、抗KDR重链可变区和人源IgG1抗体Fc段组成。
一种毕赤酵母分泌表达法，用于分泌表达权利要求1所述的全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体。
一种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的抗体。
一种表达载体，含有上述的核酸。
一种重组宿主细胞，含有上述的表达载体。
上述抗体的应用，其特征在于选择性地与EGFR/KDR结合或抑制EGFR/KDR与EGFR配体/KDR配体的结合阻断其信号的转导。
上述抗体的偶联物。
全人源靶向EGFR/KDR的IgG样特异性抗体在治疗肿瘤药物中的应用。
发明进一步说明：
本发明中全人源靶向EGFR/KDR的IgG样特异性抗体由两条相同链组成，其中每一条肽链由抗EGFR轻链可变区、5个氨基酸的柔性肽(GGGGS)、抗EGFR重链可变区、15个氨基酸的柔性肽(GGGGS)3、抗KDR轻链可变区、5个氨基酸的柔性肽(GGGGS)、抗KDR重链可变区、5个氨基酸的柔性肽(GGGGS)和人源IgG1抗体Fc段依次组成。
含有本发明全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体基因的表达载体和宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体的方法。
本发明利用PCR技术将筛选获得的抗EGFR高亲和力单链抗体E10与本实验室筛选获得的抗KDR高亲和力单链抗体AK404及人源Fc(IgG1)段进行克隆重组，构建IgG样双特异性抗体(Bi-Ab)重组载体，转化毕赤酵母后用0.5％甲醇诱导分泌表达；离心提取酵母发酵液上清，低温离心去除酵母细胞及碎片，发酵上清经硫酸铵沉淀法初步分离目的蛋白(Bi-Ab)后，采用Protein A亲和层析柱进行进一步的分离纯化；Western Blot鉴定得到的抗体；SPR实验分析测定抗体与两种抗原的亲和力常数；MTT检测Bi-Ab对结肠癌细胞HT-29及卵巢癌细胞SKOV-3的生长抑制作用；流式凋亡实验证实Bi-Ab对细胞的增殖抑制作用是通过其生理性程序使其凋亡，而非细胞毒作用；最终采用裸鼠肿瘤模型实验验证Bi-Ab体内抗肿瘤活性。
本发明涉及的双特异性抗体可以特异性结合EGFR及KDR，抑制肿瘤生长及肿瘤血管新生。研究表明，该双特异性抗体分别结合EGFR或KDR的能力与抗EGFR或抗KDR单克隆抗体近似，且对肿瘤或血管内皮细胞的增殖抑制能力与抗EGFR或抗KDR单克隆抗体近似。为说明该双特异性抗体同时抑制EGFR和KDR比单独抑制两者中的一种能够更好地抑制肿瘤的生长，建立人结肠癌细胞HT-29和人卵巢癌细胞SKOV-3裸鼠移植瘤模型。
附图说明
图1是抗EGFR/KDR双特异性抗体Bi-Ab基因重组分析图，重组基因大小约为2200bp。
图2是抗EGFR/KDR双特异性抗体Bi-Ab的结构示意图，该抗体由两条相同的肽链通过二硫键共价结合构成，其中抗体可变区或Fc段之间通过柔性肽G4S/(G4S)3链接。
图3是SDS-PAGE蛋白质电泳图和Western Blot鉴定双特异性抗体Bi-Ab图。图3A描述发酵表达的双特异性抗体Bi-Ab通过硫酸铵沉淀及Protein A亲和柱进行分离纯化的结果，图3B描述Western Blot 鉴定分离到的双特异性抗体Bi-Ab的结果。泳道1和2分别为非还原型的市售抗体cetuximab(一种抗EGFR人鼠嵌合抗体)和双特异性抗体Bi-Ab，泳道3为蛋白marker(条带分子量从上至下依次为：170；130；100；70；55；40；35；25；15kDa)，泳道4和5分别为还原型的cetuximab和双特异性抗体Bi-Ab。
图4是抗原抗体亲和力拟和曲线图，展示抗EGFR/KDR双特异性抗体Bi-Ab与抗原EGFR(图4A)或抗原KDR(图4B)的结合测试实验(Biacore)。
图5是柱形图，描述抗EGFR/KDR双特异性抗体Bi-Ab对HT-29细胞(图5A，与PBS、cetuximab、mAb-04、Combination对比)的生长抑制作用或对SKOV-3细胞的生长抑制作用(图5B，与PBS、cetuximab、mAb-04、Combination对比)。
图6是流式检测图，描述全人源抗EGFR/KDR双特异性抗体Bi-Ab对SKOV-3细胞(与PBS、cetuximab、mAb-04、Combination对比)的凋亡作用。
图7是HT-29/SKOV-3裸鼠移植瘤抑制实验结果曲线图，描述全人源抗EGFR/KDR双特异性抗体Bi-Ab对裸鼠结肠癌/卵巢癌移植瘤的生长抑制作用(与PBS、cetuximab、mAb-04、Combination对比)。
具体实施方式
实施例1全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体的构建
分别以scFv-E10、scFv-AK404R和Fc(IgG1)段基因及PICZα质粒为模板，设计并合成引物进行PCR扩增。全人源IgG样靶向EGFR/KDR的特异性抗体的构建以先扩增独立的可变区和Fc段为基础，再进行重叠PCR延伸扩增最后获得完整的Bi-Ab基因。PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因片段。PCR扩增终产物及质粒PICZα用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接。连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定。
实施例2全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体的表达、纯化、鉴定
将测序正确的重组质粒进行扩增，经线性化后电导转化毕赤酵母X-33感受态细胞。从筛选培养基上挑去单菌落，接种于YPD(25μg/ml Zeocin)液体培养基，30℃过夜活化。次日以1％接种量接于BMGY培养基中，培养至OD600约为1.5后，4℃，3000rpm离心10min去上清，菌体重悬与等体积的BMMY培养基中，每24小时添加0.5％的甲醇，诱导表达5天。4℃，8000rpm离心30min收集诱导表达的发酵液上清，缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度为50％，4℃静置过夜。4℃，8000rpm离心30min收集沉淀，沉淀溶于10％初始发酵液体积的Protein A上样缓冲液，0.22μm滤膜过滤样品用Protein A亲和柱层析纯化。A.15％SDS-PAGE分析收集样品，挑选高纯度蛋白做鉴定。B.将高纯度蛋白样品进行Western Blot鉴定。4℃，250mA恒流转印1.5h，将蛋白转印到PVDF膜(购自Millipore)；转印结束，将膜在5％脱脂牛奶中室温封闭2h；PBS洗3遍，按1∶8000比例加入HRP偶联的羊抗人IgG多克隆抗体，37℃孵育1h，TBS洗3遍，滴加ECL发光显色液，凝胶成像仪曝光拍照。采用超滤法将纯化后目的蛋白转入PBS中，液氮速冻，-70℃保存。
实施例3全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体的SPR实验
该实验中双特异性抗体Bi-Ab和各抗原结合使用Biacore X100作为SPR-依赖的生物传感器来检测
该实验中双特异性抗体Bi-Ab和各抗原结合使用Biacore X100作为SPR-依赖的生物传感器来检测Bi-Ab与EGFR或KDR之间的相互作用：A.将EGFR通过氨基偶联法固定在CM5芯片上，分别流过浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40nmol/L的Bi-Ab，获得结合-解离曲线，用BIA评估软件分析计算获得平衡解离常数KD约为1.45nmol/L。B.将KDR通过氨基偶联法固定在CM5芯片上，分别流过浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40nmol/L的Bi-Ab，获得结合-解离曲线，用BIA评估软件分析计算获得平衡解离常数KD约为2.37nmol/L。
实施例4全人源靶向EGFR/KD的IgG样双特异性抗体对结肠癌细胞HT-29/卵巢癌细胞SKOV-3的生长抑制作用
该实验将双特异性抗体Bi-Ab与高表达EGFR和KDR的结肠癌细胞HT-29/卵巢癌细胞SKOV-3作用，并利用SPSS软件对实验数据进行分析，以评估该蛋白的体外抗肿瘤活性。将3×103～5×103个HT-29/SKOV-3细胞接种96孔细胞培养板，100μl/孔，在37℃5％CO2培养箱中培养。用含10ng/ml VEGF+EGF的对应培养基将样品组Bi-Ab、cetuximab、mAb-04、Combination(cetuximab+mAb-04)分别稀释至不同浓度梯度，24h后加入100μl梯度稀释的抗体，每个浓度设置三个平行孔，继续培养72h。
观察细胞生长状况后每孔加入11μL的MTT，37℃继续培养4h，小心倾去上清，每孔加入150μLDMSO，在酶标仪570nm/630nm波长处测定光吸收值(OD值)，计算细胞增殖。Bi-Ab的生物活性由细胞生长的抑制率评价，抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。
实施例5全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体对卵巢癌细胞SKOV-3的凋亡实验
全人源IgG样靶向EGFR/KDR特异性抗体对卵巢癌细胞SKOV-3的凋亡实验证明蛋白对细胞的增殖抑制作用是通过细胞程序性死亡而非细胞毒死亡。取对数生长期SKOV-3细胞4×105个接种于6孔细胞培养板，1ml/孔，另补充1ml/孔完全培养基，在37℃5％CO2培养箱中培养。对应培养基将样品组Bi-Ab、cetuximab、mAb-04、Combination分别稀释至不同浓度梯度，48h后加入1.5ml梯度稀释的抗体，继续培养36h。
观察细胞生长状况后，吸弃培养基，PBS洗2遍，0.25％胰酶消化孔板细胞，冷PBS温和洗涤细胞两次；用195μL的1×Binding Buffer重悬细胞，使细胞密度为2～5×105个/ml；加5μL的Annexin V-FITC至195μL细胞重悬液，混匀后避光，室温孵育10分钟；200μL的1×Binding Buffer洗涤细胞一次，然后将细胞重悬于190μL的1×Binding Buffer；加入10μL Propidium Iodie，利用流式细胞仪分析。结果显示SKOV-3细胞凋亡率与抗体相关，证明抗体可诱导卵巢癌细胞SKOV-3的凋亡。
实施例6全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体对结肠癌细胞HT-29/卵巢癌细胞SKOV-3裸鼠肿瘤模型的抑制实验
选用6周龄雌性裸鼠建立裸鼠肿瘤模型。将5×106个对数生长期HT-29/SKOV-3细胞重悬于100ul PBS中，用注射器植入裸鼠左侧腋下，每日观察裸鼠成瘤情况。待裸鼠移植瘤生长至约50mm3后，将荷瘤小鼠随机分组，每组六只。每周3次尾静脉给药0.1mg(PBS、cetuximab、mAb-04、Combination、Bi-Ab)。每三天测量一次瘤体长(a)、宽径(b)，按公式：体积V(mm3)＝a×b2π/6计算出肿瘤体积V0。