一种甘蔗糖蜜的前处理工艺及发酵生产DHA的工艺.pdf

本发明公开了一种甘蔗糖蜜的前处理工艺及发酵生产工艺。本发明通过对制糖产业副产物甘蔗糖蜜进行酸化、预灰、絮凝等一系列处理后，去除絮凝物杂质，得到符合裂殖壶菌发酵生产DHA的糖蜜处理液。通过处理后的甘蔗糖蜜中蔗糖已基本分解为还原糖，去除了大部分胶体，钾离子去除率不低于50%，钙离子含量略有减少，符合裂殖壶菌的发酵生产要求。本发明利用前处理后的甘蔗糖蜜以按总还原糖15～60%加入裂殖壶菌培养基中，发酵生产DHA。添加甘蔗蜜糖处理液既可为裂殖壶菌的生长提供部分葡萄糖、果糖等碳源，又含有其生长与油脂合成所必需的维生素与矿质元素，且价格相对低廉，可作为发酵生产DHA的优良廉价原料。

权利要求书
1.  一种甘蔗糖蜜的前处理工艺，包括如下步骤：
1）酸化处理：将甘蔗糖蜜加蒸馏水稀释到合适锤度，加入酸液调节pH，水浴加热将蔗糖充分水解为还原糖；
2）预灰处理：待糖液降温后加入石灰乳调节pH 至6.8～7.2；
3）絮凝处理；
4）去除絮凝物，得到供发酵生产DHA用的甘蔗糖蜜。

2.  根据权利要求1所述的一种甘蔗糖蜜的前处理工艺，其特征在于：步骤1）中，将甘蔗糖蜜加蒸馏水稀释到锤度50～65°Bx。

3.  根据权利要求1或2所述的一种甘蔗糖蜜的前处理工艺，其特征在于：步骤1）中加入酸液调节pH 2～4。

4.  根据权利要求1或2所述的一种甘蔗糖蜜的前处理工艺，其特征在于：步骤1）中水浴的条件为70～95℃，水浴加热30～60min。

5.  根据权利要求1或2所述的一种甘蔗糖蜜的前处理工艺，其特征在于：步骤2）中待糖液降温至65～75℃后加入石灰乳。

6.  根据权利要求1所述的一种甘蔗糖蜜的前处理工艺，其特征在于：步骤3）中絮凝处理采用保温絮凝、加入絮凝剂或者两者的结合。

7.  根据权利要求6所述的一种甘蔗糖蜜的前处理工艺，其特征在于：步骤3）中，絮凝处理为先进行保温絮凝，然后加入聚丙烯酰胺进行二次絮凝。

8.  一种甘蔗糖蜜发酵生产DHA的工艺，包括如下步骤：
按权利要求1～7任意一项方法制备得到供发酵生产DHA用的甘蔗糖蜜；
将处理后的甘蔗糖蜜以按总还原糖15～60%加入裂殖壶菌培养基中，发酵生产DHA。

说明书一种甘蔗糖蜜的前处理工艺及发酵生产DHA的工艺
技术领域
本发明涉及利用裂殖壶菌发酵生产DHA，具体涉及甘蔗蜜糖作为碳源进行前处理工艺及发酵生产DHA的工艺。
背景技术
 二十二碳六烯酸(docosahexaenic acid，DHA)是一种重要的ω-3系列长链不饱和脂肪酸， 属于人体必需脂肪酸之一，具有促进大脑与视网膜发育、抗凝血、降低血脂、防治老年人痴呆症与癌症等重要功效。人体只能利用食物中获取的亚麻酸合成少量DHA，无法满足身体营养需求，所以从饮食中获取DHA已成为人们的共识。
目前DHA的主要来源是海产鱼油，鱼油产品存在DHA含量不高、脂肪酸组成复杂、纯化困难、有鱼腥味等缺点，其品质受到鱼的种类、季节、地理位置的影响。利用海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)发酵生产DHA，可避免上述缺陷，产品DHA含量高，没有腥味，可人为控制DHA的生产，确保DHA的含量和产量的稳定，因此利用裂殖壶菌发酵生产DHA具有非常广阔的应用前景和市场需求。目前裂殖壶菌发酵原料多为葡萄糖，生产成本较高，利用廉价或废弃生物质（如甜高粱汁、清酒发酵废液等）作为原料培养裂殖壶菌生产DHA已见报道，为降低DHA生产成本提供了新的思路。
甘蔗糖蜜为制糖产业副产物，其总糖分为50～55%，是发酵工业中较廉价的原料。利用甘蔗糖蜜作为原料培养裂殖壶菌生产DHA暂未有报道。甘蔗蜜糖与葡萄糖或淀粉水解液相比，糖蜜不仅价格低廉，还含有微生物生长所需的多种氨基酸、维生素与微量元素，是一种优良的发酵原料。其缺点为含有大量的胶体与灰分，不同程度的影响了发酵产品的产量与质量：含有胶体物质使得糖蜜粘度较大，造成发酵液流动性差，导致氧气、热量与营养物质的传导困难；糖蜜中灰分高达10～15%，造成发酵液盐度升高，对细胞生长产生毒性，所以必须对糖蜜进行预处理，针对性的去除胶体、灰分等杂质。
发明内容
    本发明涉及一种甘蔗糖蜜的前处理工艺及发酵生产DHA的工艺。
本发明所采取的技术方案是：
    一种甘蔗糖蜜的前处理工艺，包括如下步骤：
1）酸化处理：将甘蔗糖蜜加蒸馏水稀释到合适锤度，加入酸液调节pH，水浴加热将蔗糖充分水解为还原糖；
2）预灰处理：待糖液降温后加入石灰乳调节pH 至6.8～7.2；
3）絮凝处理；
4）去除絮凝物，得到供发酵生产DHA用的甘蔗糖蜜。
    作为上述方法的进一步改进，步骤1）中甘蔗糖蜜加蒸馏水稀释到锤度50～65°Bx。
    作为上述方法的进一步改进，步骤1）中加入酸液调节pH 2～4。
    作为上述方法的进一步改进，步骤1）中水浴的条件为70～95℃，水浴加热30～60min。
    作为上述方法的进一步改进，步骤2）中待糖液降温至65～75℃后加入石灰乳。
    作为上述方法的进一步改进，步骤3）中絮凝处理采用保温絮凝、加入絮凝剂或者两者的结合。
    作为上述方法的进一步改进，步骤3）中絮凝处理为先进行保温絮凝，然后加入聚丙烯酰胺进行二次絮凝。
    一种甘蔗糖蜜发酵生产DHA的工艺，包括如下步骤：
    按照前面步骤制备得到供发酵生产DHA用的甘蔗糖蜜；将处理后的甘蔗糖蜜以按总还原糖15～60%加入裂殖壶菌培养基中，发酵生产DHA。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种甘蔗糖蜜的前处理工艺，通过处理后甘蔗糖蜜中的蔗糖基本分解为还原糖，去除了糖蜜中大部分胶体，糖蜜中钾离子去除率不低于50%，钙离子含量略有减少，得到符合裂殖壶菌发酵生产DHA的糖蜜处理液。
本发明提供了一种甘蔗糖蜜发酵生产DHA的工艺，通过添加甘蔗蜜糖处理液既可为裂殖壶菌的生长提供部分葡萄糖、果糖等碳源，又含有其生长与油脂合成所必需的维生素与矿质元素，且价格相对低廉，可作为发酵生产DHA的优良廉价原料。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
    1）不同来源甘蔗糖蜜灰分分析：
蔗糖蜜中的灰分以钾盐与钙盐为主，采用常规方法去除难度较大。糖蜜的成分因甘蔗品种、种植气候、成熟程度、土壤条件、田间管理和制糖工艺流程等不同而有所变化，其灰分含量与其来源存在密切关联。我们现场调查了广东翁源、广西南宁、崇左、贵港等地共八家糖厂糖蜜灰分情况，试图寻找到灰分含量较低的糖蜜作为发酵原料。
结果如表1所示：

  表1结果表明糖蜜灰分含量与糖厂所在地区及制糖工艺存在一定联系：广东翁源因气温偏低导致蔗汁中胶体含量高，在制糖澄清过程中加入石灰量大，所以糖蜜灰分含量明显高于广西糖蜜；广西扶南糖厂因采用碳酸法制糖，其工艺除杂效果要好于亚硫酸法，所以糖蜜灰分含量最低。根据上述结果采集广东翁源、广西良圻、广西大新三家糖厂糖蜜作为发酵实验原料。
    2）配制培养基，以下实施例中培养基均按照此配方配制：
    普通种子培养基：葡萄糖30g/L，酵母膏10g/L，0.5倍海水，pH6.0；
    普通发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母膏10g/L，玉米浆5g/L，大豆蛋白胨5g/L，微量元素混合液1ml/L，维生素混合液2ml/L，0.5倍海水，pH6.0；
    糖蜜种子培养基：糖蜜处理液以培养基中总还原糖一定比例计算加入，其余成分与普通种子培养基相同；
    糖蜜发酵培养基：糖蜜处理液以培养基中总还原糖一定比例计算加入，其余成分与普通发酵培养基相同。
    3）实验方法，以下实施例中实验方法均按照此方法进行：
    甘蔗糖蜜锤度、蔗糖、还原糖、胶体与灰分测定参照QB/T2684-2005 ；裂殖壶菌生物量、菌体油脂含量与DHA含量测定按参考文献（周林. 高密度培养裂殖壶菌生产DHA[D]. 厦门：厦门大学，2007）中描述方法进行。
实施例1：
1)        甘蔗糖蜜前处理：
以广西大新飞龙糖厂糖蜜作为发酵实验原料，将糖蜜加蒸馏水稀释至锤度50oBX，加入浓硫酸调pH 2，70℃水浴加热60min，将蔗糖充分水解为还原糖，待糖液温度降至65℃加石灰乳调节 pH 7.0，保温30min絮凝杂质，加入聚丙烯酰胺3mg/L，保温10min 二次絮凝，8000r/min离心10min，取上清液备用。经过处理后的上清液中蔗糖基本分解为还原糖，去除了糖蜜中大部分胶体，糖蜜中钾离子去除率为50%，钙离子含量略有减少。
2)        制备培养基：
    配制普通种子培养基，普通发酵培养基，糖蜜处理液以培养基中总还原糖0～90%计算加入糖蜜种子及发酵培养基。
3)        菌株培养：
种子培养：将斜面保存裂殖壶菌菌种（厦门大学惠赠，本实验室保藏）接种至种子培养基中，于28℃、200r/min摇床中培养1-2d，待种子生长至对数生长期；
发酵培养：以接种量4%、糖蜜处理液以培养基中总还原糖0～90%计算加入糖蜜种子与发酵培养基，28℃、200r/min震荡培养6d条件进行发酵，发酵过程中每24h测定发酵液还原糖含量，适量补充葡萄糖或者糖蜜处理液。
4)        实验方法：
    测定裂殖壶菌生物量、菌体油脂含量与DHA含量等。
结果如表2所示：

表2中的结果显示：裂殖壶菌发酵各项指标受到糖蜜添加比例影响，当糖蜜添加比例为30%时，发酵结果与对照相比差别不显著，效果最好，说明在该添加比例下培养基中的糖蜜杂质浓度对菌体生长与油脂积累的抑制作用已明显减弱，糖蜜可以部分替代葡萄糖用于裂殖壶菌DHA发酵生产；当糖蜜添加比例为60%时，总油脂中DHA含量比例变化不大，说明糖蜜中杂质并不会特异性抑制细胞内DHA的合成，但是菌体油脂总量相对减少，油脂中DHA总含量也相对减少；当糖蜜的添加比例为90%时，糖蜜杂质对菌体生长与油脂积累的抑制作用较明显，导致菌体油脂总量明显减少，油脂中DHA总含量也减少。通过分析比较，糖蜜添加比例占培养基中总还原糖30%时是最佳比例。
实施例2：
1)        甘蔗糖蜜前处理：
以广西大新飞龙糖厂糖蜜作为发酵实验原料，将糖蜜加蒸馏水稀释至锤度65oBX，加入浓硫酸调pH 4，95℃水浴加热50min将蔗糖充分水解为还原糖，待糖液温度降至75℃加石灰乳调节 pH 7.0，保温30min絮凝杂质，加入聚丙烯酰胺3mg/L，保温10min 二次絮凝，8000r/min离心10min，取上清液备用。经过处理后的上清液中蔗糖基本分解为还原糖，其中蔗糖比例为3.3%，还原糖比例为46.7%，去除了糖蜜中大部分胶体，糖蜜中钾离子去除率为53%，钙离子含量略有减少。
2)        制备培养基：
    糖蜜培养基：将糖蜜处理液以培养基中总还原糖30%计算加入，其余成分与普通培养基相同；
    糖蜜改良培养基：将糖蜜处理液以培养基中总还原糖30%计算加入，不添加维生素与微量元素混合液，其余成分与普通培养基相同。
3)        菌株培养：
种子培养：将斜面保存裂殖壶菌菌种（厦门大学惠赠，本实验室保藏）接种至种子培养基中，于28℃、200r/min摇床中培养1～2d，待种子生长至对数生长期；
发酵培养：以接种量4%、糖蜜处理液以培养基中总还原糖30%计算加入糖蜜种子与发酵培养基，28℃、200r/min震荡培养6d条件进行发酵，发酵过程中每24h测定发酵液还原糖含量，适量补充葡萄糖或者糖蜜处理液。
4)        实验方法：
    测定裂殖壶菌生物量、菌体油脂含量与DHA含量等。
结果如表3所示：

表3中的结果显示：与对照相比，裂殖壶菌在未添加微量元素与维生素的糖蜜培养基中生长良好，生物量、菌体油脂含量及DHA含量与对照无显著差别，说明糖蜜中原有的营养物质丰富，其中包括丰富的矿物质与泛酸、生物素等维生素，是裂殖壶菌生长与油脂积累必需的营养物质，利用糖蜜培养裂殖壶菌可减少部分营养物质添加，降低发酵成本。
实施例3：
1)        甘蔗糖蜜前处理：
以广东翁源茂源糖厂糖蜜作为发酵实验原料，将糖蜜加蒸馏水稀释至锤度55oBX，加入浓硫酸调pH 2，95℃水浴加热30min将蔗糖充分水解为还原糖，待糖液温度降至75℃加石灰乳调节 pH 7.0，保温30min絮凝杂质，加入聚丙烯酰胺3mg/L，保温10min 二次絮凝，8000r/min离心10min，取上清液备用。
结果见表4：

    表4结果显示：经过处理后的上清液中蔗糖基本分解为还原糖，去除了糖蜜中大部分胶体，糖蜜中钾离子去除率为56.1%，钙离子含量略有减少。
2)        制备培养基：
    配制普通种子与发酵培养基，翁源糖蜜种子与发酵培养基。
3)        菌株培养：
种子培养：将斜面保存裂殖壶菌菌种（厦门大学惠赠，本实验室保藏）接种至种子培养基中，于28℃、200r/min摇床中培养1～2d，待种子生长至对数生长期；
发酵培养：以接种量4%、糖蜜处理液以培养基中总还原糖15～60%计算加入糖蜜改良种子与发酵培养基，28℃、200r/min震荡培养6d条件进行发酵，发酵过程中每24h测定发酵液还原糖含量，适量补充葡萄糖或者糖蜜处理液。
4)        实验方法：
    测定裂殖壶菌生物量、菌体油脂含量与DHA含量等。
结果如表5所示：

表5中的结果显示：处理后的翁源甘蔗糖蜜以按总还原糖15～60%加入裂殖壶菌糖蜜改良培养基中，裂殖壶菌在糖蜜改良培养基中生长良好，生物量、菌体油脂含量及DHA含量与裂殖壶菌在普通葡萄糖碳源培养基中的发酵生产无显著差别。