一种活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针及其制备方法.pdf

本发明涉及生物技术领域的荧光探针及其制备方法，具体涉及一种活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针及其制备方法。本活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针抗MUC1抗体、Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺和荧光素NHS染料组成。本荧光探针由于采用了近红外荧光染料cy5.5和荧光素NHS双重标记的靶向MUC1的荧光探针，分别适合离体检测和活体检测；而MUC1是一种I型跨膜糖蛋白，在多种组织、器官上皮细胞近管腔或腺腔面中表达，呈顶端分泌，极性分布，其在肿瘤细胞中表达量明显增高。研究发现，卵巢癌细胞高表达MUC1，因此，MUC1可以作为卵巢癌治疗的理想靶点，结合了双重标记靶向MUC1的荧光探针能够完全实现活体卵巢癌的特异性成像，完成术中实时示踪。

权利要求书
1.  一种活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针，其特征在于由抗MUC1 抗体、Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺和荧光素NHS染料组成， 其中荧光素NHS染料结构如下：

Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺结构如下：

抗MUC1 抗体和结合的染料含量为：抗MUC1 抗体:荧光素NHS染料:Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺=1:0.7~2.5:0.8~2.8。

2.  一种活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
抗MUC1 抗体用0.1M、pH值为8.5的碳酸氢钠缓冲液稀释，终浓度为1mg/ml，将抗MUC1 抗体、荧光素NHS染料和Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺进行混合，混合后所述抗MUC1 抗体和结合的染料含量为：抗MUC1 抗体:荧光素NHS染料:Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺=1:0.7~2.5:0.8~2.8；所述抗MUC1 抗体、Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺和荧光素NHS染料混合物在4oC避光条件下反应2小时进行标记，反应物经脱盐柱滤过层析后，去除未反应的染料，得到所述活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针。

说明书一种活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域的荧光探针及其制备方法，具体涉及一种活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针及其制备方法。
背景技术
卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居妇科恶性肿瘤首位。手术是治疗卵巢癌的主要手段，但晚期卵巢癌患者的预后仍然很差。在卵巢癌患者行肿瘤细胞减灭术期间，尽可能去除病变组织可以提高其他治疗的疗效。其中，准确区分恶性肿瘤与周围的正常组织或良性病变的边界就显得至关重要。目前，临床上采用的各种成像方法，如超声，X线，CT，MRI和PET已用于肿瘤的检测和术前评估，但是这些传统的成像方式，在完全高对比区分及术中实时鉴别肿瘤组织与正常组织上还是存在一定局限性。开发实时的荧光探针的特异性靶向能力是影像引导手术的关键，基于特定抗原的荧光成像是癌症检测和治疗的最有前途的技术，而肿瘤组织术中的可视化可以借助荧光染料标记的肿瘤靶向探针和荧光成像系统得以实现。
发明内容
本发明的目的在于为克服现有技术的不足而提供一种靶向于卵巢癌MUC1的荧光探针。
为了达到上述目的，本发明公开了一种活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针，其特征在于由抗MUC1 抗体、Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺和荧光素NHS染料组成， 其中荧光素NHS染料结构如下：

Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺结构如下：

抗MUC1 抗体和结合的染料含量为：抗MUC1 抗体:荧光素NHS染料:Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺=1:0.7~2.5:0.8~2.8。
本发明的另一个目的在于提供一种所述荧光探针的制备方法。
为了实现上述目的，本发明公开了一种活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
抗MUC1 抗体用0.1M、pH值为8.5的碳酸氢钠缓冲液稀释，终浓度为1mg/ml，将抗MUC1 抗体、荧光素NHS染料和Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺进行混合，混合后所述抗MUC1 抗体和结合的染料含量为：抗MUC1 抗体:荧光素NHS染料:Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺=1:0.7~2.5:0.8~2.8；所述抗MUC1 抗体、Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺和荧光素NHS染料混合物在4oC避光条件下反应2小时进行标记，反应物经脱盐柱滤过层析后，去除未反应的染料，得到所述活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针。
与现有技术相比，本发明由于采用了近红外荧光染料cy5.5和荧光素NHS双重标记的靶向MUC1的荧光探针，荧光素是480nm左右激发，发绿色荧光，适合离体检测，比如制成切片后进行显微镜成像；Cy5.5是近红外荧光，其发射波长范围从650 nm到900 nm，优点是穿透能力强，适合活体检测；而MUC1是一种I型跨膜糖蛋白，在多种组织、器官上皮细胞近管腔或腺腔面中表达，呈顶端分泌，极性分布，其在肿瘤细胞中表达量明显增高。研究发现，卵巢癌细胞高表达MUC1，因此，MUC1可以作为卵巢癌治疗的理想靶点，结合了双重标记靶向MUC1的荧光探针能够完全实现活体卵巢癌的特异性成像，完成术中实时示踪，为实现肿瘤组织的术中可视化奠定了基础。
  下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
附图1为荧光素-NHS染料、Cy5.5-NHS染料和靶向抗体的荧光素-Cy5.5的荧光探针在不同成像条件下的体外荧光图像；
附图2为负瘤小鼠在注射靶向双标荧光探针和非特异性荧光探针12小时后成像。
具体实施方式
活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针由抗MUC1 抗体、Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺和荧光素NHS染料组成，其中荧光素NHS染料结构如下：

Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺结构如下：

抗MUC1 抗体和结合的染料含量为：抗MUC1 抗体:荧光素NHS染料:Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺=1:0.7~2.5:0.8~2.8。
  以下为制备活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针的具体实施例：
实例一：将抗MUC1 抗体用0.1M、pH值为8.5的碳酸氢钠缓冲液稀释，终浓度为1mg/ml，再将抗MUC1抗体/荧光染料/Cy5.5按1:1:1比例在4oC避光反应2小时进行标记，反应物经脱盐柱（Zeba? , 美国Thermo Scientific公司）滤过层析后，去除未反应的染料，得到所述活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针，通过在紫外分光光度计检测抗体和结合的染料含量为1/0.7/0.8。
实例二：将抗MUC1 抗体用0.1M、pH值为8.5的碳酸氢钠缓冲液稀释，终浓度为1mg/ml，再抗MUC1抗体/荧光染料/Cy5.5按1:10:10比例在4oC避光反应2小时进行标记，反应物经脱盐柱滤过层析后，去除未反应的染料，得到所述活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针，通过在紫外分光光度计检测抗体和结合的染料含量为1/2.5/2.8。
实例三：将抗MUC1 抗体用0.1M、pH值为8.5的碳酸氢钠缓冲液稀释，终浓度为1mg/ml，再抗MUC1抗体/荧光染料/Cy5.5按1:20:20比例在4oC避光反应2小时进行标记，反应物经脱盐柱滤过层析后，去除未反应的染料，得到所述活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针，通过在紫外分光光度计检测抗体和结合的染料含量为1/1.9/2.0。
实例四：将抗MUC1 抗体用0.1M、pH值为8.5的碳酸氢钠缓冲液稀释，终浓度为1mg/ml，再抗MUC1抗体/荧光染料/Cy5.5按1:1:9 比例在4oC避光反应2小时进行标记，反应物经脱盐柱滤过层析后，去除未反应的染料，得到所述活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针，通过在紫外分光光度计检测抗体和结合的染料含量为1/0.8/2.6。
实例五：将抗MUC1 抗体用0.1M、pH值为8.5的碳酸氢钠缓冲液稀释，终浓度为1mg/ml，再抗MUC1抗体/荧光染料/Cy5.5按1:9:1 比例在4oC避光反应2小时进行标记，反应物经脱盐柱滤过层析后，去除未反应的染料，得到所述活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针，通过在紫外分光光度计检测抗体和结合的染料含量为1/2.3/0.8。
将OVCAR3（卵巢癌细胞株）细胞消化后制成单细胞悬液，每鼠按约3 × 106 肿瘤细胞/50ul，注射于雌性裸鼠右肩部皮下。肿瘤在4周后可长至0.6-1cm；将所述活体卵巢癌组织的靶向MUC1的荧光探针经裸鼠尾静脉分别注入0.5 nmol荧光探针，分别于注射后4 h、12 h和36 h进行荧光活体成像（选择610 nm为激发波长，700 nm为发射波长）。36h后麻醉处死动物，取出主要器官和肿瘤组织，进行体外荧光成像检测。成像结果参见附图1和2。其中附图1为荧光素-NHS染料、Cy5.5-NHS染料和靶向抗体的荧光素-Cy5.5的荧光探针在不同成像条件下的体外荧光图像，（A）为激发波长在470 nm，发射波长在530 nm；（B）为激发波长610nm，发射波长在700nm；附图2为负瘤小鼠在注射靶向双标荧光探针和非特异性荧光探针12小时后成像，（A）为靶向MUC1的Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺、荧光素NHS染料双标荧光探针，（B）为非特异性IgG-Cy5.5-n-羟基琥珀酰亚胺荧光探针。通过对比附图1,2，可以看出双重标记的荧光探针较单一荧光染料的优势是有两个检测波长；其次，通过不同时间段采点来观察注射荧光探针后的负瘤小鼠裸鼠发现，探针在肿瘤部位荧光较强，说明该探针对肿瘤部位具有更高的选择性；且靶向MUC1荧光探针的荧光强度比非特异性荧光分子在肿瘤部位明显增强，在12小时达到平台期，说明靶向MUC1荧光探针对卵巢癌组织有较好的实时成像效果。