说明书一种靶向lncRNAs的用于抗AR相关肿瘤去势复发的修饰性LNA寡核苷酸
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种靶向lncRNAs的用于抗AR相关肿瘤去势复发的修饰性LNA寡核苷酸。
背景技术
癌症占人类死亡病因的近1/4。在过去的几十年里肿瘤复发和转移仍是改善整体存活率的主要障碍，这可能主要归因于人们对于癌症生物学仍然缺乏全面的了解。例如，功能基因组学研究的最新进展表明，参与人类基因转录的绝大多数是非编码RNA，然而，对于长非编码RNA(lncRNA)在调控癌症基因表达及机制等方面人类仍然所知甚少(Xie C,Yuan J,Li H,Li M,Zhao G,Bu D,et al.NONCODEv4:exploring the world of long non-coding RNA genes.Nucleic acids research.2013；doi:10.1093/nar/gkt1222.)。
新近有研究表明lncRNA PCGEM1可以与雄激素受体(AR)结合作用(Yang L,Lin C,Jin C,Yang JC,Tanasa B,Li W,et al.lncRNA-dependent mechanisms of androgen-receptor-regulated gene activation programs.Nature.2013；29:598-602.)。PCGEM1在前列腺癌上调(Srikantan V,Zou Z,Petrovics G,Xu L,Augustus M,Davis L,et al.PCGEM1,a prostate-specific gene,is overexpressed in prostate cancer.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2000；97:12216-21.)，可促进细胞增殖(Petrovics G,Zhang W,Makarem M,Street JP,Connelly R,Sun L,et al.Elevated expression of PCGEM1,a prostate-specific gene with cell growth-promoting function,is associated with high-risk prostate cancer patients.Oncogene.2004；23:605-11.)。AR3(AR-V7)是AR异构体，有研究表明AR3(AR-V7)在很大程度上诱导形成相关肿瘤如前列腺癌的激素去势抵抗(Antonarakis ES,et al.AR-V7 and resistance to enzalutamide and abiraterone in prostate cancer.The New England journal of medicine.2014；371,1028-1038.)。
目前关于通过靶向lncRNA PCGEM1，以阻断该特异性目标基因的表达，进一步抑制AR相关肿瘤的激素去势抵抗和复发转移还未见报道。
LNA(Locked Nucleic Acids，锁核酸)是一种类寡核苷酸衍生物，结构中β-D-呋喃核糖的2′-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构。LNA降低了核 糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种LNA寡核苷酸。
本发明的再一的目的是，提供所述的LNA寡核苷酸的用途。
本发明的另一的目的是，提供一种缀合物。
本发明的第四个目的是，提供一种药物组合物。
本发明的第五个目的是，提供所述的缀合物或药物组合物的用途。
本发明的第六个目的是，提供一种试剂盒。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
LNA寡核苷酸，所述的LNA寡核苷酸选自下述序列：
a)T+T+T+TCCAAAGGG+T+CCGCTGTCCCTG+G+A+G，或
b)A+T+T+CCCCTCAGA+A+ATCTCAGGGCTT+G+T+C，
其中+选自β-D-氧-LNA核苷酸类似物中的任一种。
优选地，所述的LNA寡核苷酸选自下述序列的一种：
a)TGTGTATCCAAAGGGTTACCGCTGTCCCTGTGTAAG；
b)TGTGTATCCAAAGGGATTCCGCTGTCCCTGTGTAAG；
c)AGTCTACCCCTCAGACAGATCTCAGGGCTTAGATCC；
d)AGTCTACCCCTCAGAGAGATCTCAGGGCTTAGCTCC，
其中，G为G-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，C为C-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，A为A-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，T为T-β-D-氧-LNA核苷酸类似物。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的LNA寡核苷酸在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗或诊断肿瘤。
所述的肿瘤前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌和结肠癌。
所述的LNA寡核苷酸在制备药物中的应用，所述的药物用于降低雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵抗和复发转移。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种缀合物，所述的缀合物包含如上所述的LNA寡核苷酸，和至少一个共价结合到所述LNA寡核苷酸上的非核苷酸或非多核苷酸部分。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种药物组合物，所述的药物组合物含有如上所述的LNA寡核苷酸，以及可药用的稀释剂、载体或辅剂。
优选地，所述的药物组合物包含水性载体，所述的水性载体包含用于将pH维持在7.35-7.45范围内的缓冲剂。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的缀合物或所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗或诊断肿瘤。
为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：
一种试剂盒，所述的试剂盒含有如上所述的LNA寡核苷酸，以及适合重配所述LNA寡核苷酸的盐水或缓冲溶液。
本发明优点在于：
本发明通过临床标本研究发现PCGEM1的基因表达与前列腺癌恶性程度及转移复发呈高度相关性，PCGEM1不但可以与AR直接作用，更重要的是PCGEM1与AR异构体(如AR3(AR-V7))的表达呈高度正相关，并证明了PCGEM1通过选择性转录修饰调控了AR的异构体如AR3(AR-V7)的表达，由此发现lncRNAs如PCGEM1可能通过调控AR基因转录的表观遗传机制参与AR相关肿瘤的增殖、恶性侵袭复发及转移驱动，因为在一定程度上是由于AR的异构体如AR3(AR-V7)介导了该类肿瘤的激素去势抵抗，而并非野生型全长AR。
基于上述AR相关肿瘤的特异性调节lncRNAs如PCGEM1参与调控了与该类肿瘤的激素去势抵抗相关AR异构体(如AR3(AR-V7))的表达，本发明设计了修饰性LNA寡核苷酸，直接靶向目标基因lncRNA PCGEM1，其能够高效、准确的阻断该特异性目标基因的表达，联合靶向阻断PCGEM1所介导的雄激素受体异构体AR3(AR-V7)，进而有效的降低AR相关肿瘤(如前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌和结肠癌)的激素去势治疗后的去势抵抗和复发转移情况。本发明的LNA寡核苷酸特异性好，稳定性高，在体内不易降解，作用时间显著延长，动物实验表明能抑制肿瘤生长，效果十分显著。
附图说明
图1.核酸荧光原位杂交方法检测lncRNA PCGEM1在组织标本中的表达， 结果显示肿瘤组织中显著高于正常组织，高度恶性或转移性肿瘤中的表达显著高于低度恶性肿瘤组织，且在高度恶性或转移性肿瘤中lncRNA PCGEM1具有显著的核移位现象。
图2.通过对临床前列腺肿瘤标本检测发现：lncRNA PCGEM1在肿瘤细胞中显著高表达，且lncRNA PCGEM1与AR3(AR-V7)表达具有高度正相关性。
图3.蛋白印迹检测表明，下调lncRNA PCGEM1的表达可以同向的引起AR3(AR-V7)表达的显著降低，表明二者的正相关性。Ctrl shRNA为未转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸(SEQ ID NO.3)的对照组；PCGEM1-shRNA为转染了lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸(SEQ ID NO.3)的实验组。
图4.体外验证lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸的功能：应用22RV1cell，体外转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸(SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3)，与对照组比较，肿瘤细胞的PCGEM1显著被下调。CON.为转染PCGEM1-LNA寡核苷酸的对照组；PCGEM1-LNA-#1为转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1的实验组；PCGEM1-LNA-#2为转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.3的实验组。
图5.通过前列腺癌LNCaP细胞株培养，体外转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1，与对照组比较，可以显著抑制肿瘤的生长侵袭能力。CON.为未转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸的对照组；PCGEM1-LNA为转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1的实验组。
图6.通过裸鼠动物实验，应用lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1处理LNCaP细胞所形成的肿瘤，与对照组比较，可以显著下调肿瘤细胞LNCaP在小鼠体内的增殖能力(肿瘤重量)。CON.为使用未经lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1处理的LNCaP细胞建立的动物模型对照组；PCGEM1-LNA为使用转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1的LNCaP细胞建立的动物模型实验组。
图7.通过裸鼠动物实验，应用lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1处理LNCaP细胞所形成的肿瘤，与对照组比较，可以显著下调肿瘤细胞的增殖能力(肿瘤体积)。CON.为使用未经lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1处理的LNCaP细胞建立的动物模型对照组；PCGEM1-LNA为使用转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1的LNCaP细胞建立的动 物模型实验组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1合成lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸
LNA寡核苷酸对靶核酸表达的影响可在多种细胞类型中的任何一种细胞中进行检测，条件是目标核酸以可测量的水平存在，靶物可内源性表达，或通过编码所述核酸的核酸的瞬时或稳定转染表达。
合成的lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸序列如下所示：
PCGEM1-LNA-1：T+T+T+TCCAAAGGG+T+CCGCTGTCCCTG+G+A+G(SEQ ID NO.5)；
PCGEM1-LNA-2：A+T+T+CCCCTCAGA+A+ATCTCAGGGCTT+G+T+C(SEQ ID NO.6)。
其中+选自β-D-氧-LNA核苷酸类似物中的任一种。
其中4种GAS5-LNA寡核苷酸序列如下：
a)TGTGTATCCAAAGGGTTACCGCTGTCCCTGTGTAAG(SEQ ID NO.1)；
b)TGTGTATCCAAAGGGATTCCGCTGTCCCTGTGTAAG(SEQ ID NO.2)；
c)AGTCTACCCCTCAGACAGATCTCAGGGCTTAGATCC(SEQ ID NO.3)；
d)AGTCTACCCCTCAGAGAGATCTCAGGGCTTAGCTCC(SEQ ID NO.4)，
G为G-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，C为C-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，A为A-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，T为T-β-D-氧-LNA核苷酸类似物。
以上序列均由美国Exiqon合成，具体可参考：http://www.biomart.cn/infos upply/11085229.htm；http://www.biomart.cn/infosupply/19919667.htm。
实施例2 lncRNA PCGEM1参与AR相关肿瘤去势抵抗的作用验证(附图1、2、3)
1、通过核酸荧光原位杂交方法检测前列腺恶性或转移性肿瘤、高度恶性肿瘤、低度恶性肿瘤和良性肿瘤中lncRNA PCGEM1的表达。核酸荧光原位杂交的具体步骤为：
(1)临床前列腺癌石蜡包埋组织切片脱蜡：
1)二甲苯脱蜡3次，每次5min；
2)100％酒精两次，每次2min；
3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
(2)蛋白酶处理：
1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解；
2)37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min；
3)2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min；
4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。
(3)变性：
1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3)78℃孵育8min；
4)即移入-20℃预冷70％酒精的染色缸内2min，再依次移入80％、90％和100％的-20℃预冷酒精内，每缸2min；
5)空气干燥。
(4)杂交：
1)准备探针；
2)取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
3)滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
4)盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
5)镊子小心去除盖玻片；
6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7)2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥；
9)从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片；
10)每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；
11)去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；
12)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
13)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
14)去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3 次，每次2min；
15)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
16)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
17)1×PBS室温下洗3次，每次2min。
(5)细胞核染色：
1)张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
结果：见图1。
2、Real-time实验检测临床前列腺肿瘤标本中lncRNA PCGEM1和AR3(AR-V7)的表达量
(1)收集临床前列腺肿瘤标本。
(2)提取临床前列腺肿瘤标本的总RNA。采用Ambion公司的RNA提取试剂盒(AM1560)，按照试剂盒说明书方法进行操作。
(2)取100ng的总RNA逆转录。
(3)取反转录得到的产物，根据Ambion公司的试剂盒说明书进行后续的real-time实验。引物序列如下：
结果：结果见图2。
3、在22RV1肿瘤细胞中，使用lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸(SEQ ID NO.3)下调lncRNA PCGEM1的表达，然后通过蛋白印迹方法检测AR、AR3(AR-V7)的表达量，以Tubulin作为参照。蛋白印迹检测的具体步骤为：
(1)蛋白样品制备
1)细胞总蛋白的提取(参照蛋白提取试剂盒，Roch)；
2)分装备用或放于－20℃保存。
(2)蛋白含量的测定
(3)SDS-PAGE电泳
1)电泳，电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
2)转膜
(4)免疫印迹反应；
(5)化学发光，显影，定影；
(6)凝胶图象分析，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
结果：见图3。
实施例3体外分析：lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸对肿瘤细胞PCGEM1表达的反义抑制(附图4)
将LNCaP或22RV1细胞以0.3×106细胞接种。在37℃，5％CO2条件下培养。接种的次日，使用RNA转染试剂(2.5μg/ml)，使用两种不同的lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3(10μg/ml)分别转染细胞。简而言之，用OptiMEM中的Lipofectamine温育细胞10min，随后加入lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3。12小时后，去除转染混合物，洗涤细胞，接种至适当的生长培养基中，37℃条件下生长约48小时，然后进行荧光定量PCR分析。
结果：22RV1细胞中的检测结果见图4。LNCaP中的检测结果为：分别转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1和lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸SEQ ID NO.3的实验组，相比于未转染LNA寡核苷酸的对照组，PCGEM1的表达量分别降低了63％和74％。
实施例4 lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸抑制细胞迁移生长(附图5)
细胞迁移实验：在37℃、95％湿度和5％CO2条件下，在添加了10％胎牛血清、Glutamax I、NEAA、丙酮酸钠和庆大霉素的MEM(Sigma)中，培养前列腺癌LNCaP细胞株(ATCC)。当细胞达到60-70％汇合时，使用RNA转染试剂(2.5μg/ml)转染细胞，转染的lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸为SEQ ID NO.1(10μg/ml)。
在37℃、95％湿度和5％CO2条件下，在含有10％胎牛血清、庆大霉素的MEM(Sigma)中，培养22RV1细胞系。当细胞达到60-70％汇合时转染细胞，转染的lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸为SEQ ID NO.3(10μg/ml)。
然后进行细胞迁移侵袭实验。
结果：前列腺癌LNCaP细胞株中的细胞迁移实验结果见图5。22RV1细胞系中的细胞迁移实验结果与LNCaP一致，均显示转染lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸显著抑制了肿瘤的生长侵袭能力。
实施例5动物实验检测LNA寡核苷酸的体内抑瘤效果(附图6、7)
错配研究：将50只裸鼠(约25g)分组，利用LNCaP肿瘤细胞制作裸鼠皮下成瘤模型，并随机分为lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸处理组及对照组(未经lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸处理)。具体为：
(1)肿瘤细胞用1640培养基加10％FBS培养至细胞密度达40％；
(2)用RNA转染试剂Lipofectamine(Invitrogen)按照说明书的常规操作方式转染，终浓度达50nM；
(3)首先体外检验转染效率：细胞转染6小时之后，换上新鲜的培养基，继续培养；收集24h的细胞，提取细胞总RNA，按照实施例2的方法检测细胞内的目标基因的表达情况(U6作为内参)；
(4)上述细胞用于小鼠动物模型的制作及后继体内干预实验；
(5)动态监测裸鼠皮下成瘤模型，成瘤四周后将动物处死，测定肿瘤组织的重量和体积。
结果：肿瘤重量和体积的测定结果分别见图6和图7。
实施例6动物实验检测LNA寡核苷酸的体内治疗效果
将裸鼠(24～26g)采用肿瘤细胞LNCaP制作裸鼠皮下成瘤模型，模型建立成功后抽取体重基本一致(最高-最低<2g)的裸鼠模型50只，随机分为5组，饲养条件相同。各组裸鼠模型在分组后的第1、2、3、4天注射药物，实验组1注射SEQ ID NO.1的lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸，实验组2注射SEQ ID NO.2的lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸，实验组3注射SEQ ID NO.3的lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸，实验组4注射SEQ ID NO.4的lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸，对照组注射等量溶剂Lipofectamine。lncRNA PCGEM1-LNA寡核苷酸采用Lipofectamine(Invitrogen)配制成50nM/ml的溶液，直接注射入裸鼠模型的瘤体中，注射剂量为0.2ml。在最后一次注射后2周将动物处死，取出肿瘤组织，测定肿瘤重量和体积，计算各实验组肿瘤组织的重量降低率和体积降低率，重量降低率＝(实验组肿瘤组织总重量－对照组肿瘤组织总重量)×100％/对照组肿瘤组织总重量，体积降低率＝(实验组肿瘤组织总体积－对照组肿瘤组织总体积)×100％/对照组肿瘤组织总体积。结果 见表1。
表1各实验组裸鼠模型肿瘤组织的重量降低率和体积降低率
实验组肿瘤组织的重量降低率(％)肿瘤组织的重量降低率(％)
实验组184.983.1
实验组282.283.6
实验组388.382.5
实验组480.781.4
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。