甘草次酸壳聚糖聚己内酯靶向纳米载体及其制备方法与应用.pdf

本发明公开了一种甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体及其制备方法与应用。本发明以壳聚糖分子为主链，利用接枝共聚反应，分别将甘草次酸和ε-己内酯嫁接到主链上，形成接枝共聚物。利用离子交联法或透析法将该聚合物制备成为纳米载体，可用于制备口服或注射用治疗肝脏疾病的药物，靶向缓释治疗肝脏疾病。上述纳米载体中，壳聚糖主链和聚己内酯支链可形成两个载药核心，分别对亲水性和疏水性的药物进行有效负载；甘草次酸配体使得该载体肝靶向定位作用明显提高。经检测，该纳米载体的粒径为30～400nm结构稳定，生物相容性高，肝靶向定位能力强，具有生物相容性好、粒径分布均匀、结构稳定并且体内降解产物无毒副作用的特点。

权利要求书
1.  一种甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体，其特征在于所述载体的分子结构为：


2.  一种权利要求1所述甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：
a、将壳聚糖溶解于N，N-二甲基甲酯胺中，然后加入适量邻苯二甲酸酐，壳聚糖与邻苯二甲酸酐质量比为1∶1～4，在60～120℃氮气保护条件下不断搅拌，反应4～18h，生成N-邻苯二甲酯化壳聚糖中间体；
b、将N-邻苯二甲酯化壳聚糖和ε-己内酯溶解到无水N，N-二甲基甲酯胺中，N-邻苯二甲酯化壳聚糖和ε-己内酯质量比为1∶0.5～3，在60～120℃氮气保护条件下不断搅拌，反应8～24h，获得N-邻苯二甲酯化壳聚糖-g-聚己内酯，利用丙酮萃取除去同聚物；
c、将合成的N-邻苯二甲酯化壳聚糖-g-聚己内酯溶于二甲基甲酯胺中，添加水合联氨，N-邻苯二甲酯化壳聚糖-g-聚己内酯与水合联氨的质量比为1∶1～4，在60～120℃氮气保护条件下不断搅拌，反应4～24小时，消除邻苯二甲酯基团，制得的溶液冷却至室温，收集沉淀物，用水和无水乙醇清洗，室温干燥，获得壳聚糖-g-聚己内酯；
d、将甘草次酸和壳聚糖-g-聚己内酯分别溶于N，N-二甲基甲酯胺，将两种溶液混合搅拌均匀，甘草次酸和壳聚糖-g-聚己内酯的质量比为1∶10～100，向混合液中缓慢滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的水溶液和N-羟基琥珀酯亚胺溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐用量占总溶液质量的0.1～10％，N-羟基琥珀酯亚胺占总溶液质量的0.1～10％，在20～50℃条件下不断搅拌，反应8～24h，用丙酮沉淀，将沉淀过滤，用丙酮、乙醇清洗，室温下真空干燥获得甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯；
e、采用离子交联法或透析法制备甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯纳米粒子。

3.  根据权利要求2所述的甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体的制备方法，其特征在于所述壳聚糖的脱乙酯度为90～100％。

4.  根据权利要求2所述的甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体的制备方法，其特征在于所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的浓度为10％(w/v)，N-羟基琥珀酯亚胺溶液的浓度为10％(w/v)。

5.  根据权利要求2所述的甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体的制备方法，其特征在于所述聚己内酯嫁接率为60～400％。

6.  根据权利要求2所述的甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体的制备方法，其特征在于所述甘草次酸嫁接率为1～10％。

7.  根据权利要求2所述的甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体的制备方法，其特征在于所述离子交联法制备纳米粒子步骤如下：将甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于稀醋酸溶液，甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯与醋酸溶液质量比为1∶5～100，加入三聚磷酸钠水溶液，甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯与三聚磷酸钠的质量比为1∶0.1～10，20～40℃条件下不断搅拌，交联反应1～2小时，将混合溶液8000～10000rpm离心30～60分钟获得纳米颗粒，用蒸馏水冲洗，冷冻干燥并低温保存。

8.  根据权利要求7所述的甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体的制备方法，其特征在于所述醋酸浓度为0.1～10％(v/v)，三聚磷酸钠水溶液浓度为0.1～5％(w/v)。

9.  根据权利要求2所述的甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体的制备方法，其特征在于所述透析法制备纳米粒子步骤如下：将甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于二氯甲烷，甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯与二氯甲烷质量比为1∶10～100，20～40℃条件下搅拌1～2小时，将溶液加入到去离子水中，甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯与去离子水的质量比为1:100～1000，50～100MPa下高压均质5～10个循环，然后将溶液置于大量的去离子水中透析，2～4天，取出透析袋中物质，冷冻干燥，获得纳米颗粒。

10.  一种权利要求1所述甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体的可用于制备口服或注射用治疗肝脏疾病的药物。

说明书甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于高分子药物载体领域，涉及一种甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，高分子聚合物微胶粒作为药物载体成为研究的热门领域。聚合物微胶粒载体可以负载多种疏水性药物，提高药物的生物利用率并且能够实现药物在血液中长效缓释。高分子微粒载体系统大多是由一个疏水的核心和一个亲水的外壳组成：疏水核心可以作为油性药物的储备库，用于储存和保护负载的药物。亲水的外壳使微球载体的结构更加稳定并且能够有效减小空间位阻斥力，同时可以防止被网状内皮系统摄取，亲水的外壳使载体具备高通透性和低滞留效应，有利于药物在病变位点的靶向释放。
目前，用于微粒载体系统的高分子材料主要有两亲嵌段共聚物、水溶性基团改性的聚合物和天然多糖。但是这些载体尚有许多不足之处：例如，部分两亲嵌段共聚物载体生物相容性比较低，在临床应用中容易引起机体的排斥反应。经过简单亲水基团改性的高分子聚合物载体容易被单核巨噬细胞系统吞噬或被被网状内皮系统摄取，靶向作用不明显。一些天然多糖制备载体，容易出现沉淀现象，稳定性较差。另外，这些载体无法满足不同性质药物如亲水性药物、有机大分子药物的高效包载和转运。因此，设计研究转运效率高、靶向性强、结构稳定的高分子纳米微粒载体具有重要的意义。
我国肝癌发病率高，但是具有体内肝靶向功能的给药系统尚不成熟，因此发明具有强肝靶向性的载体对于实现高效受体介导的肝靶向给药意义重大。研究表明，肝细胞表面存在大量甘草次酸受体，甘草次酸与该位点的结合具有高度特异性。近年来，将甘草次酸作为肝靶向配体已成为近年来肝靶向治疗的研究热点。
发明内容
本发明针对目前肝靶向制剂载药量较小、稳定性较差、价格昂贵以及副作用较大等问题，提供一种甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体及其制备方法与应用。本发明将甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体用于负载肝癌药物，以实现肝癌药物的精准靶向输送和长时间持续可控释放。该纳米载体具有生物相容性好、粒径分布均匀、结构稳定并且体内降解产物无毒副作用的特点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯靶向纳米载体，其分子结构为：

上述纳米载体中，壳聚糖主链和聚己内酯支链可形成两个载药核心，分别对亲水性和疏水性的药物进行有效负载；甘草次酸配体使得该载体肝靶向定位作用明显提高。
本发明以壳聚糖分子为主链，利用接枝共聚反应，分别将甘草次酸和ε-己内酯嫁接到主链上，形成接枝共聚物。利用离子交联法或透析法将该聚合物制备成为纳米载体，经检测，该纳米载体的粒径为30～400nm结构稳定，生物相容性高，肝靶向定位能力强。如图1所示，具体制备步骤如下：
a、将壳聚糖(脱乙酰度为90～100％)溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，控制壳聚糖浓度为5～40％(w/v)，然后加入适量邻苯二甲酸酐，壳聚糖与邻苯二甲酸酐质量比为1∶1～4，在60～120℃氮气保护条件下不断搅拌，反应4～18h，生成N-邻苯二甲酰化壳聚糖中间体。
b、将N-邻苯二甲酰化壳聚糖和ε-己内酯溶解到无水N，N-二甲基甲酰胺中，在60～120℃氮气保护条件下不断搅拌，反应8～24h，获得N-邻苯二甲酰化壳聚糖-g-聚己内酯，其中：N-邻苯二甲酰化壳聚糖和ε-己内酯质量比为1∶0.5～3，N，N-二甲基甲酰胺用量占反应溶液总体积的60～95％，利用丙酮萃取除去同聚物。
c、将合成的N-邻苯二甲酰化壳聚糖-g-聚己内酯溶于二甲基甲酰胺中，N，N-二甲基甲酰胺用量占反应溶液总体积的60～95％，添加水合联氨，N-邻苯二甲酰化壳聚糖-g-聚己内酯与水合联氨的质量比为1∶1～4，在60～120℃氮气保护条件下不断搅拌，反应4～24小时，消除邻苯二甲酰基团，制得的溶液冷却至室温，收集沉淀物，用水和无水乙醇清洗，室温干燥，获得壳聚糖-g-聚己内酯。
d、将甘草次酸和壳聚糖-g-聚己内酯分别溶于N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基甲酰胺用量为80～99％，将两种溶液混合搅拌均匀，甘草次酸和壳聚糖-g-聚己内酯的质量比为1∶10～100，向混合液中缓慢滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的水溶液(浓度10％，w/v)和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液(浓度10％，w/v)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐用量占总溶液质量的0.1～10％，N-羟基琥珀酰亚胺占总溶液质量的0.1～10％，在20～50℃条件下不断搅拌，反应8～24h，用丙酮沉淀，将沉淀过滤，用丙酮、乙醇清洗，室温下真空干燥获得甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯。由图2可知，甘草次酸和己内酯成功接枝到壳聚糖分子上。
在上述制备方法，聚己内酯嫁接率为60～400％。甘草次酸嫁接率为1～10％。


e、采用离子交联法或透析法制备甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯纳米粒子。
在上述制备过程中，离子交联法制备纳米粒子步骤如下：将甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于稀醋酸溶液，醋酸浓度为0.1～10％(v/v)，甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯与醋酸溶液质量比为1∶5～100，加入浓度为0.1～5％(w/v)的三聚磷酸钠水溶液，甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯与三聚磷酸钠的质量比为1∶0.1～10，20～40℃条件下不断搅拌，交联反应1～2小时，将混合溶液8000～10000rpm离心30～60分钟获得纳米颗粒，用蒸馏水冲洗，冷冻干燥并低温保存。
在上述制备过程中，透析法制备纳米粒子步骤如下：将甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于二氯甲烷，甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯与二氯甲烷质量比为1∶10～100，20～40℃条件下搅拌1～2小时，将溶液加入到去离子水中，甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯与去离子水的质量比为1∶100～1000，50～100MPa下高压均质5～10个循环，然后将溶液置于大量的去离子水中透析，2～4天，取出透析袋中物质，冷冻干燥，获得纳米颗粒。
本发明所述的甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯纳米载体可用于制备口服或注射用治疗肝脏疾病的药物，靶向缓释治疗肝脏疾病。
本发明具有如下优点：
(1)生物相容性好：疏水核心聚己内酯支链具有良好的生物相容性，能在生物体内自行降解、代谢并被机体吸收和排泄。亲水核心壳聚糖主链能减少材料被网状内皮系统摄取的机会，有助于药物的靶向运输。
(2)应用广泛：由于存在疏水和亲水两个核心，分别能对亲水性和疏水性的药物高效负载。
(3)靶向性强：由于甘草次酸配体的引入，该纳米载体系统主动肝靶向性能优秀，有效减小肝癌治疗的副作用。
(4)结构稳定，有利于实现载药后的长效缓释。
(5)生产成本较低，条件温和，具有大规模生产的优势，能够有效提高治疗效果，具有较高的应用前景。
附图说明
图1为草次酸-壳聚糖-聚己内酯接枝共聚物的制备流程图；
图2为草次酸-壳聚糖-聚己内酯接枝共聚物的红外谱图；
图3为离子交联法制备Lo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯粒径分布；
图4为离子交联法制备Bo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯粒径分布；
图5为透析法法制备Lo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯粒径分布；
图6为透析法法制备Bo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯粒径分布；
图7为载药纳米粒子的体外释放曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
亲水核心优势型甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯接枝共聚物的制备：
将5g壳聚糖(脱乙酰度为100％)溶于100mL N，N-二甲基甲酰胺水溶液中(浓度5％，v/v)，加入10g邻苯二甲酸酐，在N2环境中120℃条件下不断搅拌，持续反应10h。反应结束后冷却至室温，抽滤获得沉淀物，并用甲醇清洗2次，干燥制得N-邻苯二甲酰化壳聚糖中间体。
取2gε-己内酯和6g N-邻苯二甲酰化壳聚糖溶解到30mL无水N，N-二甲基甲酰胺中，在N2环境100℃反应24h，获得N-邻苯二甲酰化壳聚糖-g-聚己内酯，利用丙酮萃取除去同聚物。
将制得的N-邻苯二甲酰化壳聚糖-g-聚己内酯溶于50mL N，N-二甲基甲酰胺水溶液中(浓度5％，v/v)，添10mL加水合联氨，在N2环境100℃反应10h，消除邻苯二甲酰基团。制得的溶液冷却至室温，收集沉淀物，用水和无水乙醇清洗，干燥，获得壳聚糖-g-聚己内酯。获得的产品聚己内酯嫁接率为63％。
称取10mg甘草次酸和1g壳聚糖-g-聚己内酯分别溶于50mL N，N-二甲基甲酰胺水溶液中(浓度5％，v/v)，混合搅拌均匀，向混合液中缓慢滴加10mL(浓度10％，m/v)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的水溶液和10mL(浓度10％，m/v)N-羟基琥珀酰亚胺水溶液，室温反应，用丙酮沉淀，将沉淀过滤，用丙酮、乙醇清洗，室温真空干燥获得甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯。获得的产甘草次酸嫁接率为1.23％。获得的亲水核心优势型产品记作Lo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯。
实施例2
疏水核心优势型甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯接枝共聚物的制备：
将5g壳聚糖(脱乙酰度为100％)溶于100mL N，N-二甲基甲酰胺水溶液中(浓度5％，v/v)，加入10g邻苯二甲酸酐，在N2环境中120℃条件下不断搅拌，持续反应10h。反应结束后冷却至室温，抽滤获得沉淀物，并用甲醇清洗2次，干燥制得N-邻苯二甲酰化壳聚糖中间体。
取8gε-己内酯和6g N-邻苯二甲酰化壳聚糖溶解到50mL无水N，N-二甲基甲酰胺中，在N2环境100℃反应24h，获得N-邻苯二甲酰化壳聚糖-g-聚己内酯，利用丙酮萃取除去同聚物。
将制得的N-邻苯二甲酰化壳聚糖-g-聚己内酯溶于50mL N，N-二甲基甲酰胺水溶液中(浓度5％，v/v)，添加10mL水合联氨，在N2环境100℃反应10h，消除邻苯二甲酰基团。制得的溶液冷却至室温，收集沉淀物，用水和无水乙醇清洗，干燥，获得壳聚糖-g-聚己内酯。获得的产品聚己内酯嫁接率为235％。
称取10mg甘草次酸和1g壳聚糖-g-聚己内酯分别溶于50mLN，N-二甲基甲酰胺水溶液(浓度5％，v/v)，混合搅拌均匀，向混合液中缓慢滴加10mL(浓度10％，m/v)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的水溶液和10mL(浓度10％，m/v)N-羟基琥珀酰亚胺水溶液，室温反应，用丙酮沉淀，将沉淀过滤，用丙酮、乙醇清洗，室温真空干燥获得甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯。获得的产甘草次酸嫁接率为1.62％。获得的疏水核心优势型产品记作Bo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯。
实施例3
离子交联法制备纳米颗粒：
(1)称取0.5g Lo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于50mL 5％醋酸溶液，缓慢滴加20mL三聚磷酸钠(1mg/mL)水溶液，搅拌2小时，交联反应形成纳米颗粒，将混合溶液8000rpm离心30分钟获得纳米颗粒，用蒸馏水冲洗，干燥保存。
(2)称取0.5g Bo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于50mL 5％醋酸溶液，缓慢滴加20mL三聚磷酸钠(1mg/mL)水溶液，搅拌2小时，交联反应形成纳米颗粒，将混合溶液8000rpm离心30分钟获得纳米颗粒，用蒸馏水冲洗，干燥保存。
用激光粒度分析仪检测粒子尺寸及分布如图3-4所示，Lo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯的平均粒径为98nm；Bo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯的平均粒径为106nm。
实施例4
透析法制备纳米颗粒：
(1)称取0.5g Lo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于50mL二氯甲烷中，搅拌1小时，之后加入到100mL蒸馏水中，高压均质80MPa下5个循环，转移到透析袋中(MWO＝8000～14000)，并置于大量的去离子水中透析2天，取出透析袋中物质，冻干，获得纳米颗粒。
(2)称取0.5g Bo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于50mL二氯甲烷中，搅拌1小时，之后加入到100mL蒸馏水中，高压均质80MPa下5个循环，转移到透析袋中(MWO＝8000～14000)，并置于大量的去离子水中透析2天，取出透析袋中物质，冻干，获得纳米颗粒。
用激光粒度分析仪检测粒子尺寸及分布如图5-6所示，Lo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯的平均粒径为156nm；Bo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯的平均粒径为138nm。
实施例5
负载亲水性药物纳米颗粒制备
称取10mg Lo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于10mL 5％醋酸溶液，加入10mg盐酸阿霉素。缓慢滴加5mL三聚磷酸钠(1mg/mL)水溶液，搅拌2小时，交联反应形成纳米颗粒，将混合溶液8000rpm离心10分钟获得载药纳米颗粒。
用激光粒度分析仪检测粒子尺寸及分布，平均粒径为108nm。盐酸阿霉素的包封率为85.2％。
实施例6：负载疏水性药物纳米颗粒制备
称取10mg Bo-甘草次酸-壳聚糖-聚己内酯溶于10mL 5％醋酸溶液，称取10mg姜黄素溶于5mL冰醋酸，将两溶液混合，缓慢滴加5mL三聚磷酸钠(1mg/mL)水溶液，搅拌2小时，交联反应形成纳米颗粒，将混合溶液8000rpm离心10分钟获得载药纳米颗粒。
用激光粒度分析仪检测粒子尺寸及分布，平均粒径为119nm。姜黄素的包封率为83.1％。
实施例7
载药纳米粒子的体外释放性能研究：
精确称取实施例5载药纳米粒10mg，置于10.0mL磷酸缓冲液中(pH＝7.4)，37℃恒温振荡，定期取样离心，更换介质。利用高效液相色谱检测溶液中盐酸阿霉素含量。结果显示载药纳米载体24h的累积释放量为50％，5天后释放量达到80％(图7)。