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1、10申请公布号CN104098693A43申请公布日20141015CN104098693A21申请号201410337120022申请日20140715C07K16/12200601C12N15/13200601A61K39/40200601A61P31/0420060171申请人中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所地址100071北京市丰台区东大街20号72发明人陈薇杨益隆易绍琼李建民郭强徐俊杰于长明刘树玲74专利代理机构北京市众天律师事务所11478代理人李新军54发明名称抗金黄色葡萄球菌SASA抗原的单克隆抗体及其应用57摘要本发明公开了抗金黄色葡萄球菌SASA抗原不同结构域的单。
2、克隆抗体，以及所述抗体在制备抵御金黄色葡萄球菌感染药物中的应用。该特异性的抗体联合使用时在小鼠模型中具有良好的保护性。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表19页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表19页附图3页10申请公布号CN104098693ACN104098693A1/1页21一种抗金黄色葡萄球菌SASA抗原特定结构域的单克隆抗体，其特征在于，所述SASA抗原特定结构域位于如SEQIDNO9所示的SASA抗原氨基端起第48229位氨基酸序列或者如SEQIDNO10所示的SASA抗原氨基端起第229751位氨基酸序列。2根据权利要求。
3、1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述SASA抗原特定结构域位于如SEQIDNO9所示的SASA抗原的氨基端起第48229位氨基酸序列，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区分别如SEQIDNO2第4552、6977、116126位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区分别如SEQIDNO4第4656、7476、113121位氨基酸序列所示。3根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区FR1FR4区氨基酸序列分别如SEQIDNO2第2244、5368、78115、127137位氨基酸序列所示；轻链可变区的FR1FR4区氨基酸序列。
4、分别如SEQIDNO4第2045、5773、77112、122131位氨基酸序列所示。4根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQIDNO2，轻链的氨基酸序列为SEQIDNO4。5一种编码权利要求4所述的单克隆抗体重链和轻链的核苷酸序列，其特征在于，所述单克隆抗体的重链的核苷酸序列为SEQIDNO1，轻链的核苷酸序列为SEQIDNO3。6根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述SASA抗原特定结构域位于如SEQIDNO10所示的SASA抗原的氨基端起第229751位氨基酸序列；所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区分别如SE。
5、QIDNO6第4552、6977、116130位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区分别如SEQIDNO8第4656、7476、113121位氨基酸序列所示。7根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的FR1FR4区氨基酸序列分别如SEQIDNO6第2244、5368、78115、131141位氨基酸序列所示；轻链可变区的FR1FR4区氨基酸序列分别如SEQIDNO8第2045、5773、77112、122131位氨基酸序列所示。8根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQIDNO6，轻链的氨基酸序列。
6、为SEQIDNO8。9一种编码权利要求8所述的单克隆抗体重链和轻链的核苷酸序列，其特征在于，所述单克隆抗体的重链的核苷酸序列为SEQIDNO5，轻链的核苷酸序列为SEQIDNO7。10权利要求1、2、3、4、6、7、8中的任一单克隆抗体在制备治疗金黄色葡萄球菌感染药物的应用。11一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求2和/或权利要求6所述的单克隆抗体，以及可药用的载体。12根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求4和/或权利要求8所述的单克隆抗体。13根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含23单克隆抗体和2H7单克隆抗体。权利要求书CN10。
7、4098693A1/7页3抗金黄色葡萄球菌SASA抗原的单克隆抗体及其应用技术领域0001本发明属于生物技术领域，更具体的，本发明涉及针对金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS,SAUREUS表面蛋白ASTAPHYLOCOCCUSAUREUSSURFACEPROTEINA,SASA的单克隆抗体的基因和基因编码的多肽，以及所述抗体在抵御金黄色葡萄球菌感染中的应用。背景技术0002金黄色葡萄球菌是一种重要的革兰氏阳性条件致病菌。在成年群体中，大约有20的人持续携带金黄色葡萄球菌，另有30的人间歇性携带。对于健康个体，金黄色葡萄球菌通常引起皮肤和软组织的轻微感染；但对于受外伤和免疫系。
8、统受损的患者，金黄色葡萄球菌可导致威胁生命的肺炎、菌血症及包括心内膜炎、脓毒性关节炎、骨髓炎等在内的严重并发症。金黄色葡萄球菌的外毒素还可引起食物中毒、表皮松解征和中毒性休克综合征。0003对于金黄色葡萄球菌感染的治疗，通常选用红霉素、新型青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素VI等抗生素。但是由于多重耐药金黄色葡萄球菌的出现，目前单一用抗生素治疗金黄色葡萄球菌感染已经越来越困难。临床数据显示，具有多重抗生素耐药性的金黄色葡萄球菌在社区金黄色葡萄球菌感染中占到60，而在医院这一比例占到80。其中特别突出的是甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌菌株METHICILLINRESISTANTSAUREUS，M。
9、RSA，2009年欧洲9个国家MRSA占到临床金黄色葡萄球菌株的2550。MRSA导致的感染用抗生素疗法难以治愈并且有很高的致死率。2005年，美国共有94,000例MRSA感染病例，超过18,000人死亡，致死人数超过了艾滋病、流感和病毒性肝炎的总和。0004因此，研制出抗生素之外的金黄色葡萄球菌感染的治疗药物显得迫在眉睫。由于保护性高、体内半衰期长、性质稳定，单克隆抗体被认为是具有应用前景的特异性治疗药物。金黄色葡萄球菌感染单克隆抗体药物的靶向人群，一方面包括免疫功能不健全的人群，如低体重婴儿、免疫系统受损患者糖尿病、AIDS、终末期肾病和癌症，另一方面包括不可预见的高风险感染人群，如创伤。
10、、烧伤和紧急手术等病人。0005金黄色葡萄球菌SASA蛋白属于细胞壁锚定的表面黏附蛋白。本申请人之前的研究表明重组SASA蛋白片段具有良好的免疫保护性，能够完全保护MRSA菌株USA300对于小鼠的致死攻毒YI,SQETAL,2012,MICROBIOLIMMUNOL,5640610。之后通过临床样本的分析，本发明人发现SASA在金黄色葡萄球菌临床菌株中分布广泛，保守性高。考虑到以上几个方面，本发明人认为针对SASA蛋白的单克隆抗体对于金黄色葡萄球菌感染具有潜在治疗作用。0006目前还没有针对SASA的单克隆抗体的研究报道。其他金黄色葡萄球菌表面蛋白的单克隆抗体的研究，针对的抗原包括CLFAC。
11、LUMPINGFACTORA、ISDBIRONREGULATEDSURFACEDETERMINANTB、SPASTAPHYLOCOCCALPROTEINA等。2003年ANDREAEHALL等人筛选到的一个针对CLFA的鼠单抗129，在体外具有较高的亲和活性和人纤维蛋白原结合抑制活性，但是在小鼠致死攻毒模型中，被动免疫129的小鼠生存率不超过60说明书CN104098693A2/7页4ANDREAEHALLETAL,INFECTIONANDIMMUNITY,2003,711268646870。之后INHIBITEX公司对这一单抗进行了人源化并进行了临床实验商品名为TEBAZUMAB，结果以失败。
12、告终WWWCLINICALTRIALGOV。2009年MARTHABROWN等人筛选到了针对ISDB的多个鼠单抗，但是在小鼠致死攻毒模型中，这些单抗仅显示1050的保护性MARTHABROWNETAL,CLINICALANDVACCINEIMMUNOLOGY,2009,16810951104。2012年HWANKEUNKIM等人报道了针对SPA的多个鼠单抗，在小鼠肾感染模型中具有良好的保护性，但是文章中并没有报道这些单抗在小鼠致死攻毒模型中是否具有保护性HWANKEUNKIMETAL,INFECTIONANDIMMUNITY,2012,801034603470。目前针对金黄色葡萄球菌表面蛋白单。
13、克隆抗体的研究现状是，已经完成临床实验的单抗保护性均不理想，还没有一个FDA批准的单抗上市，而动物实验的研究表明大部分的单抗在小鼠致死攻毒模型中的保护性也有限。可能的原因有以下两点一是关键的表面蛋白抗原还没有找到；二是目前研究的单抗主要针对抗原的单一结构域，其保护性对于抵御金黄色葡萄球菌的致死攻毒可能作用有限。0007因此，本发明的目的就是提供针对SASA蛋白不同结构域，对金黄色葡萄球菌感染具有更好保护效果的单克隆抗体。发明内容0008本发明通过单克隆抗体技术筛选到了针对金黄色葡萄球菌SASA抗原不同结构域的两株高亲和力单克隆抗体23和2H7，并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的C。
14、DR1、CDR2和CDR3区的氨基酸和核苷酸序列，动物实验表明23和2H7的联合使用对金黄色葡萄球菌感染具有良好的治疗作用。0009本发明一方面公开了一种抗金黄色葡萄球菌SASA抗原特定结构域的单克隆抗体，所述SASA抗原特定结构域位于如SEQIDNO9所示的SASA抗原氨基端起第48229位氨基酸序列或者如SEQIDNO10所示的SASA抗原氨基端起第229751位氨基酸序列。0010在一个优选的技术方案中，所述SASA抗原特定结构域位于如SEQIDNO9所示的SASA抗原氨基端起第48229位氨基酸序列，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区分别如SEQIDNO2第45。
15、52、6977、116126位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区分别如SEQIDNO4第4656、7476、113121位氨基酸序列所示。0011优选地，所述单克隆抗体的重链可变区FR1FR4区氨基酸序列分别如SEQIDNO2第2244、5368、78115、127137位氨基酸序列所示。轻链可变区的FR1FR4区氨基酸序列分别如SEQIDNO4第2045、5773、77112、122131位氨基酸序列所示。0012优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区氨基酸序列如SEQIDNO2第138473位氨基酸序列所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQIDNO4第132238位氨基酸序。
16、列所示。0013优选地，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQIDNO2，轻链的氨基酸序列为SEQIDNO4。0014本发明还提供了一种编码上述的单克隆抗体重链和轻链的核苷酸序列，所述单克隆抗体的重链的核苷酸序列为SEQIDNO1，轻链的核苷酸序列为SEQIDNO3。0015在另一个优选的技术方案中，所述SASA抗原特定结构域位于如SEQIDNO10所示的SASA抗原氨基端起第229751位氨基酸序列，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、说明书CN104098693A3/7页5CDR2和CDR3区分别如SEQIDNO6第4552、6977、116130位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1。
17、、CDR2和CDR3区分别如SEQIDNO8第4656、7476、113121位氨基酸序列所示。0016优选地，所述单克隆抗体的重链可变区的FR1FR4区氨基酸序列分别如SEQIDNO6第2244、5368、78115、131141位氨基酸序列所示。轻链可变区的FR1FR4区氨基酸序列分别如SEQIDNO8第2045、5773、77112、122131位氨基酸序列所示。0017优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区氨基酸序列如SEQIDNO6第142465位氨基酸序列所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQIDNO8第132238位氨基酸序列所示。0018优选地，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQ。
18、IDNO6，轻链的氨基酸序列为SEQIDNO8。0019本发明还提供了一种编码上述的单克隆抗体重链和轻链的核苷酸序列，所述单克隆抗体的重链的核苷酸序列为SEQIDNO5，轻链的核苷酸序列为SEQIDNO7。0020本发明在另一方发明公开了上述任一种单克隆抗体在制备治疗金黄色葡萄球菌感染药物的应用。0021本发明还公开了一种药物组合物，所述组合物包含上述两个技术方案述及的单克隆抗体单独配伍或组合，以及可药用的载体。0022优选地，所述组合物包含重链的氨基酸序列为SEQIDNO2，轻链的氨基酸序列为SEQIDNO4的单克隆抗体和/或重链的氨基酸序列为SEQIDNO6，轻链的氨基酸序列为SEQIDN。
19、O8的的单克隆抗体。0023更优选地，所述组合物包含23单克隆抗体和2H7单克隆抗体。依照本领域技术人员的水平，以及本发明提供的单克隆抗体的可变区序列，可以根据需要设计相应的恒定区序列，对23和2H7单克隆抗体进行抗体类型转化，或制备相对应的嵌合单克隆抗体和人源化抗体。0024本发明提供的单克隆抗体由于在重链和轻链可变区具有独特的CDR13区序列，使所述抗体23和2H7对金黄色葡萄球菌SASA蛋白具有特异的识别和结合能力。在WESTERNBLOT检测实验中，单克隆抗体23和2H7分别能够特异性结合SASA48229和SASA229751，表明23和2H7单克隆抗体针对的是SASA蛋白的不同结构。
20、域。在ELISA检测实验中，单克隆抗体23和2H7与SASA蛋白的结合呈现剂量效应反应，灵敏度分别为4NG/ML和8NG/ML，而与重组炭疽保护性抗原PA、重组破伤风抗原均没有反应，显示出本发明提供的单克隆抗体具有高度特异的结合活性。0025本发明提供的单克隆抗体还显示了在制备金黄色葡萄球菌感染治疗药物中的应用。在小鼠致死攻毒模型中，本发明提供的23和2H7单克隆抗体联合使用的保护率达到了8757/8，显著高于对照组的保护率。该实验表明本发明提供的单克隆抗体在小鼠模型中具有良好的保护性，有潜力应用于制备金黄色葡萄球菌感染治疗药物。附图说明0026图1SASA48229和SASA229751原核。
21、表达纯化后的SDSPAGE蛋白电泳图；0027图2SASA48229和SASA229751原核表达纯化后的WESTERNBLOT检测；0028图3纯化的单克隆抗体23和2H7的还原SDSPAGE蛋白电泳图；说明书CN104098693A4/7页60029图4单克隆抗体23和2H7的WESTERNBLOT检测；0030图5单克隆抗体23和2H7重链H与轻链L基因的克隆；0031图6重组单链抗体23和2H7的WESTERNBLOT检测；0032图7单克隆抗体23、2H7与SASA蛋白结合的ELISA检测；0033图8单克隆抗体23和2H7在小鼠体内对金黄色葡萄球菌USA300菌株攻毒的保护效果。具。
22、体实施方式0034下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。0035实施例1对SASA蛋白的单克隆抗体的制备00361SASA蛋白不同结构域的划分0037SASA蛋白全长2271个氨基酸，属于革兰氏阳性菌SRRP蛋白SERINERICHREPEATPROTEIN家族。根据生物信息学分析，可将SASA蛋白分为5个主要的结构域，分别是N端的信号肽、丝氨酸富集重复区域1第48229位氨基酸序列、非重复区域第229751位氨基酸序列、丝氨酸富集重复区域2第7522213位氨基酸序列和C端的细胞壁锚定序列。
23、。其中SASA7522213主要定位在金黄色葡萄球菌荚膜多糖内，而SASA48229和SASA229751定位在细菌表面，因此预测SASA48229和SASA229751是SASA蛋白的主要功能结构域。00382SASA48229和SASA229751基因的克隆0039根据金黄色葡萄球菌USA300BAA1556TMSASA蛋白的全长基因序列，设计针对SASA蛋白全长第48229位氨基酸序列SASA48229，和SASA蛋白全长第229751位氨基酸序列SASA229751基因的引物，以提取的USA300全基因组为模板进行PCR扩增，通过传统的分子克隆技术将SASA48229和SASA2297。
24、51基因片段连入表达载体PET21ANOVAGEN，CATNO697403，并转化大肠杆菌表达菌株BL21DE3NOVAGEN，CATNO69450，挑取单克隆进行限制性内切酶和测序鉴定。测序正确的菌株被命名为BL21PET21ASASA48229和BL21PET21ASASA229751，SASA48229和SASA229751的氨基酸序列分别为SEQIDNO9和SEQIDNO10。00403SASA48229和SASA229751蛋白片段的原核表达纯化及鉴定0041BL21PET21ASASA48229和BL21PET21ASASA229751经IPTG诱导表达后经过QFF离子交换柱和镍柱。
25、两步纯化，SASA48229和SASA229751蛋白的纯度达到了90以上图1。目的蛋白最终保存在PBS溶液中。SDSPAGE蛋白电泳后电转至硝酸纤维素膜，封闭液PBS5脱脂奶粉室温封闭1H，加入11,000倍稀释的抗HIS标签鼠单抗，室温孵育3H，洗液TBSTTBS01TWEEN20洗3遍后加入110,000倍稀释的马抗鼠HRP二抗CST,7076，室温孵育1H，TBST洗4遍后采用化学发光法显色曝光，WESTERNBLOT检测结果显示SASA48229和SASA229751蛋白片段在目的位置有条带图2。00424单克隆抗体的制备0043以SASA蛋白片段为免疫原，采用常规单克隆抗体制备方法。
26、WAYNEMYOKOYAMAETAL,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,2006,2512525获得两株高亲和力、高特异性的鼠源性抗SASA单抗杂交瘤细胞株，分泌的抗体分子23为IGG2B亚类，分泌的抗说明书CN104098693A5/7页7体分子2H7为IGG1亚类，轻链均为KAPPA亚型。采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的办法进行单克隆抗体生产，收集的腹水经过PROTEINA柱亲和层析纯化得到单克隆抗体23和2H7图3。对得到的单克隆抗体23和2H7进行WESTERNBLOT检测，证实23特异结合的是SASA48229，2H7特异结合的是SASA229751图4，表明2。
27、3和2H7单克隆抗体针对SASA蛋白不同的结构域。00445单克隆抗体23和2H7的轻重链基因克隆0045分别收集处于对数生长期的单克隆抗体23和2H7的杂交瘤细胞106个，采用TRIZOL一步法提取总RNA。用TAKARA5RACE试剂盒D315分别对提取的RNA进行去磷酸化处理、“去帽子”反应、5RACEADAPTOR连接和反转录反应。0046以合成的CDNA为模板，进行外引物PCR扩增抗体的重链和轻链，外引物PCR使用的引物是5RACE外引物引物序列5CATGGCTACATGCTGACAGCCTA3和特异性外引物IGG1型重链引物序列5TTTACCAGGAGAGTGGGAGAG3；IGG。
28、2B型重链引物序列5TTTACCCGGAGACCGGGAGAT3；KAPPA型轻链引物序列5ACACTCATTTCGGTTGAAGCTC3。以外引物PCR产物为模板，再进行内引物PCR扩增抗体的重链和轻链，内引物PCR使用的引物是5RACE内引物引物序列5CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG3和特异性内引物IGG1重链引物序列5TTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCTCTTCT3；IGG2B重链引物序列5TTTACCCGGAGACCGGGAGATGGTCTTCTTC3；KAPPA型轻链引物序列5ACACTCATTTCGGTTGAAGCTC3。巢式PCR产。
29、物琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。将上述巢式PCR产物连接到PMD18T载体，挑取克隆提取质粒，限制性内切酶鉴定得到阳性克隆，通过测序确定其序列。00476单克隆抗体23和2H7的轻重链序列分析0048用VECTORNTI软件对测序结果进行分析，登录IMGTHTTP/WWWIMGTORG/IMGT_VQUEST，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区FRAMEWORKREGIONS，FR和互补决定区COMPLEMENTARITYDETERMININGREGIONS，CDR。0049单克隆抗体23重链核苷酸序列为SEQIDNO1，氨基酸序列为SEQIDNO2，其中第2244位氨基酸序列。
30、为FR1，第4552位氨基酸序列为CDR1，第5368位氨基酸序列为FR2，第6977位氨基酸序列为CDR2，第78115位氨基酸序列为FR3，第116126位氨基酸序列为CDR3，第127137位氨基酸序列为FR4，第138473位氨基酸序列为恒定区。0050单克隆抗体23轻链核苷酸序列为SEQIDNO3，氨基酸序列为SEQIDNO4，其中第2045位氨基酸序列为FR1，第4656位氨基酸序列为CDR1，第5773位氨基酸序列为FR2，第7476位氨基酸序列为CDR2，第77112位氨基酸序列为FR3，第113121位氨基酸序列为CDR3，第122131位氨基酸序列为FR4，第132238位。
31、氨基酸序列为恒定区。0051单克隆抗体2H7重链核苷酸序列为SEQIDNO5，氨基酸序列为SEQIDNO6，其中第2244位氨基酸序列为FR1，第4552位氨基酸序列为CDR1，第5368位氨基酸序列为FR2，第6977位氨基酸序列为CDR2，第78115位氨基酸序列为FR3，第116130位氨基酸序列为CDR3，第131141位氨基酸序列为FR4，第142465位氨基酸序列为恒定区。0052单克隆抗体2H7轻链核苷酸序列为SEQIDNO7，氨基酸序列为SEQIDNO8，其中第2045位氨基酸序列为FR1，第4656位氨基酸序列为CDR1，第5773位氨基酸序列为FR2，第7476位氨基酸序列。
32、为CDR2，第77112位氨基酸序列为FR3，第113121位氨基酸说明书CN104098693A6/7页8序列为CDR3，第122131位氨基酸序列为FR4，第132238位氨基酸序列为恒定区。00537重组单链抗体的制备0054分别以基因克隆得到的23和2H7单克隆抗体的质粒为模板，用P15CATATGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC3、P25GCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC3引物扩增23单克隆抗体重链，用P35GGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGA。
33、TGTTTTGATGACCCAAACTCCA3、P45GAGCTCTTTTAGCTCCAGTTTGGTCCCAGC3引物扩增23单克隆抗体轻链；用P55CATATGCAGCTGCTGCAGTCTGGGTCTGAG3、P65GCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC3引物扩增2H7单克隆抗体重链、用P75GGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGATGTTTTGATGACCCAAAGTCCA3、P85GAGCTCTTTTAGCTCCAGTTTGGTCCCAGC3引物扩增2H7单克隆抗体轻。
34、链划线部分为重链和轻链之间引入的连接肽GLY4SER3的DNA序列。以此扩增出的重链、轻链基因为模板，分别加入P1、P4引物对和P5、P8引物对进行PCR扩增，对应得到23和2H7单链抗体的基因。通过传统的分子生物学技术将基因片段连入表达载体PET21ANOVAGEN，CATNO697403，并转化大肠杆菌表达菌株BL21DE3NOVAGEN，CATNO69450，经IPTG诱导表达，包涵体变性后采用镍柱纯化，最后透析复性。WESTERNBLOT检测显示重组表达的23和2H7单链抗体与其鼠源的单克隆抗体类似，依然能够结合SASA蛋白不同的结构域图6，表明本发明提供的抗体可变区序列具有特异识别金。
35、黄色葡萄球菌SASA蛋白的能力，能够根据需要设计不同的恒定区序列，制备出具有活性的嵌合单克隆抗体和人源化抗体。0055实施例2ELISA检测单克隆抗体23和2H7与SASA蛋白的结合活性0056以2G/ML的浓度100L每孔包被SASA蛋白片段，4放置过夜。ELISA洗液PBSTPBS01吐温20清洗3次后每孔加入100L固定液PBST2BSA，37封闭1H。PBST洗3遍，用稀释液PBST02BSA梯度稀释单克隆抗体样品后每孔加入100L，37孵育1H。PBST洗4遍，每孔加入110,000倍稀释的马抗鼠HRP二抗CST,7076100L，37孵育1H。PBST洗4次，加入TMB进行显色反应。
36、，显色5分钟后用2MOL/L硫酸终止反应。最后在酶标仪上检测450NM处的吸光值，结果见图7。梯度稀释的单抗1000、500、250、125、625、313、156、781、391、195NG/ML与包被的重组SASA蛋白片段反应，呈现剂量效应反应，单克隆抗体23的灵敏度为4NG/ML，单克隆抗体2H7的灵敏度为8NG/ML，而与重组炭疽保护性抗原PA、重组破伤风抗原等不发生反应，显示本发明提供的单克隆抗体23、2H7对SASA蛋白具有高度特异的结合活性。0057实施例3小鼠体内单克隆抗体23和2H7对金黄色葡萄球菌USA300菌株攻毒的保护效果0058使用6周龄BALB/C雌小鼠，分为5组2。
37、3单抗组，2H7单抗组，232H7单抗组，同型单抗对照组，PBS对照组，每组8只。23单抗组腹腔注射单克隆抗体23400UG/只，2H7单抗组腹腔注射单克隆抗体2H7400UG/只，232H7单抗组腹腔注射23和2H7单克隆抗体各200UG/只，同型单抗对照组腹腔注射IGG1和IGG2B同型对照单克隆抗体各200UG/只，PBS对照组注射同体积PBS200UL。注射单克隆抗体24H后腹腔攻毒培养好的金黄色葡萄球菌USA300菌株BAA1556TM。USA300如下培养挑取单克隆接种至5ML营养肉汤培养液中，37、220RPM培养过夜，1100转接至200ML营养肉汤培养液37、220RPM说明。
38、书CN104098693A7/7页9培养5H，离心收集菌体后100MLPBS洗两遍，10MLPBS重悬并用比浊法测定菌体浓度。调整菌体浓度为2X1010CFU/ML，每只小鼠腹腔注射100L。0059观察小鼠存活情况，观察时间5D，232H7单克隆抗体组小鼠的存活率为8757/8，23单克隆抗体组小鼠的存活率为6255/8，2H7单克隆抗体组小鼠的存活率为504/8，同型单抗对照组小鼠的存活率为1251/8，PBS对照组小鼠的存活率为252/8图8。LOGRANKMANTELCOXTEST检验显示232H7单克隆抗体组小鼠存活率显著高于与PBS对照组P00303和同型单抗对照组P00075，而。
39、23单抗组和2H7单抗组与PBS对照组没有显著差异。因此，针对SASA蛋白不同结构域的单克隆抗体23和2H7联合使用时对金黄色葡萄球菌的感染具有良好的保护效果。说明书CN104098693A1/19页1000010002序列表CN104098693A102/19页110003序列表CN104098693A113/19页120004序列表CN104098693A124/19页130005序列表CN104098693A135/19页140006序列表CN104098693A146/19页150007序列表CN104098693A157/19页160008序列表CN104098693A168/19页。
40、170009序列表CN104098693A179/19页180010序列表CN104098693A1810/19页190011序列表CN104098693A1911/19页200012序列表CN104098693A2012/19页210013序列表CN104098693A2113/19页220014序列表CN104098693A2214/19页230015序列表CN104098693A2315/19页240016序列表CN104098693A2416/19页250017序列表CN104098693A2517/19页260018序列表CN104098693A2618/19页270019序列表CN104098693A2719/19页28序列表CN104098693A281/3页29图1图2图3说明书附图CN104098693A292/3页30图4图5图6说明书附图CN104098693A303/3页31图7图8说明书附图CN104098693A31。