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1、10申请公布号CN104186321A43申请公布日20141210CN104186321A21申请号201410419152522申请日20140822A01H4/0020060171申请人江苏省农业科学院地址210014江苏省南京市玄武区钟灵街50号72发明人王宏蔺经常有宏74专利代理机构南京汇盛专利商标事务所普通合伙32238代理人袁静54发明名称梨试管苗的生根培养方法及培养基57摘要本发明提供梨试管苗的生根培养方法及培养基，属于植物细胞工程技术领域。生根培养方法为将梨试管苗依次进行增殖培养、壮苗培养、诱导生根培养、大量生根培养；诱导生根培养将壮苗培养后获得的组培苗依次接种至生根培养基A。
2、和生根培养基B中进行培养，得到生根苗；大量生根培养将生根苗接种至生根培养基C中进行培养；生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基；生根培养基B是1/4QL培养基；生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基。本发明还提供上述方法中的培养基。本发明生根培养方法，能够获得具有较高增殖率、生根率、平均生根数和较长平均根长的生根试管苗。51INTCL权利要求书2页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图1页10申请公布号CN104186321ACN104186321A1/2页21梨试管苗的生根培养方。
3、法，其特征在于将梨试管苗依次进行增殖培养、壮苗培养和诱导生根培养、大量生根培养；所述诱导生根培养的方法为将壮苗培养后获得的组培苗依次接种至生根培养基A和生根培养基B中进行培养，得到生根苗；所述大量生根培养的方法为将所述生根苗接种至生根培养基C中进行培养；所述生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基,PH为5558，所述IAA的终浓度为0406MG/L，所述BA的终浓度为0812MG/L，所述NAA的终浓度为005015MG/L；所述生根培养基B是1/4QL培养基；所述生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基，PH为5558，所述IBA的终浓。
4、度为2535MG/L。2根据权利要求1所述梨试管苗的生根培养方法，其特征在于所述增殖培养的方法为将梨试管苗采用增殖培养基进行培养，所述增殖培养基是在MS培养基中添加BA和NAA后得到的培养基，PH值为5558，所述BA的终浓度为0207MG/L，NAA的终浓度为001003MG/L；所述增殖培养的条件为培养温度2225，每天光照1516H，黑暗89H，光照强度15002000LX，培养时间为2832天。3根据权利要求1或2所述梨试管苗的生根培养方法，其特征在于所述壮苗培养方法为将增殖培养后的梨试管苗剪掉基部，转接到继代培养基中进行培养，得到组培苗；所述继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基；。
5、所述壮苗培养的条件为培养温度2225，每天光照1516H，黑暗89H，光照强度15002000LX，每隔1416天更换新鲜的继代培养基，培养时间为2832天。4根据权利要求3所述梨试管苗的生根培养方法，其特征在于所述诱导生根培养的方法为将壮苗培养后获得的组培苗转接到生根培养基A中，在2226、黑暗条件下培养712D，转入生根培养基B中，在2225条件下，每天光照1516H，黑暗89H，光照强度15002000LX，培养2535天，获得生根苗。5根据权利要求4所述梨试管苗的生根培养方法，其特征在于所述大量生根培养的方法为将所述生根苗转接至生根培养基C中进行培养，获得生根试管苗；所述大量生根培养的。
6、条件为培养温度为2225，每天光照1516H，黑暗89H，光照强度15002000LX，培养时间为4050D。6用于梨试管苗生根培养的培养基，由如下培养基中的全部或部分组成（1）增殖培养基所述增殖培养基是在MS培养基中添加BA和NAA后得到的培养基，PH值为5558，所述BA的终浓度为0207MG/L，NAA的终浓度为001003MG/L；（2）继代培养基继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基；（3）生根培养基所述生根培养基包括生根培养基A、B和C；所述生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基,PH为5558，所述IAA的终浓度为0406MG/L，所述BA的终。
7、浓度为0812MG/L，所述NAA的终浓度为005015MG/L；权利要求书CN104186321A2/2页3所述生根培养基B是1/4QL培养基；所述生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基，PH为5558，所述IBA的终浓度为2535MG/L。权利要求书CN104186321A1/6页4梨试管苗的生根培养方法及培养基技术领域0001本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及梨试管苗的生根培养方法及培养基。背景技术0002梨PYRUSSPP是重要的木本经济果树，在我国水果产量中，仅次于苹果、柑橘，居第三位。近几年，根据各地目前品种中存在的主要问题和将来发展的需要，梨树育种工作取。
8、得初步成果，育成众多优良品种。如何大规模扩大新品种栽培面积，推广新品种在市场的上应用，成为目前亟待解决的问题。近几十年来，植物组织培养技术，尤其是脱毒和微繁殖技术已被广泛地应用于农业，并成为现代农业生产中一项最基本的技术。利用此技术可使苗木繁殖世代短、繁殖系数高，还可保持原来品种的优良特性。但许多植物材料离体生根技术还未解决，其理论体系还不完善，从而阻碍了脱毒和微繁殖技术在生产中推广。目前有关梨及其砧木的离体培养已有部分探索，但梨属于难生根果树，繁殖系数低，试管苗生根困难，不能适应生产发展的需要。发明内容0003本发明的目的是提供梨试管苗的生根培养方法，能够获得具有较高增殖率、生根率、平均生根。
9、数和较长平均根长的生根试管苗。0004本发明的另一目的是梨试管苗的生根培养方法中的培养基。0005本发明的目的采用如下技术方案实现。0006梨试管苗的生根培养方法，将梨试管苗依次进行增殖培养、壮苗培养、诱导生根培养、大量生根培养；所述诱导生根培养的方法为将壮苗培养后获得的组培苗依次接种至生根培养基A和生根培养基B中进行培养，得到生根苗；所述大量生根培养的方法为将所述生根苗接种至生根培养基C中进行培养；0007所述生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基,PH为5558，所述IAA的终浓度为0406MG/L，所述BA的终浓度为0812MG/L，所述NAA的终浓度为。
10、005015MG/L；0008所述生根培养基B是1/4QL培养基；0009所述生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基，PH为5558，所述IBA的终浓度为2535MG/L。0010在本发明中，所述增殖培养的方法为将梨试管苗采用增殖培养基进行培养，所述增殖培养基是在MS培养基中添加BA和NAA后得到的培养基，PH值为5558，所述BA的终浓度为0207MG/L，NAA的终浓度为001003MG/L；所述增殖培养的条件为培养温度2225，每天光照1516H，黑暗89H，光照强度15002000LX，培养时间为2832天。0011在本发明中，所述壮苗培养方法为将增殖培养后的梨。
11、试管苗剪掉基部，转接到继代培养基中进行培养，得到组培苗；所述继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基；所述壮苗培养的条件为培养温度2225，每天光照1516H，黑暗89H，光照强度15002000LX，每隔说明书CN104186321A2/6页51416天更换新鲜的继代培养基，培养时间为2832天。0012在本发明中，所述诱导生根培养的方法为将壮苗培养后获得的组培苗转接到生根培养基A中，在2226、黑暗条件下培养712D，转入生根培养基B中，在2225条件下，每天光照1516H，黑暗89H，光照强度15002000LX，培养2535天，获得生根苗。0013在本发明中，所述大量生根培养的方法为将。
12、所述生根苗转接至生根培养基C中进行培养，获得生根试管苗；所述大量生根培养的条件为培养温度为2225，每天光照1516H，黑暗89H，光照强度15002000LX，培养时间为4050D。0014本发明还提供用于梨试管苗生根培养的培养基，由如下培养基中的全部或部分组成00151增殖培养基0016所述增殖培养基是在MS培养基中添加BA和NAA后得到的培养基，PH值为5558，所述BA的终浓度为0207MG/L，NAA的终浓度为001003MG/L；00172继代培养基0018继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基；00193生根培养基0020所述生根培养基包括生根培养基A、B和C；0021所述生根。
13、培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基,PH为5558，所述IAA的终浓度为0406MG/L，所述BA的终浓度为0812MG/L，所述NAA的终浓度为005015MG/L；0022所述生根培养基B是1/4QL培养基；0023所述生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基，PH为5558，所述IBA的终浓度为2535MG/L。0024本发明梨试管苗的生根培养方法，克服了梨苗扦插繁殖系数低、高度杂合、取样难等缺点，经过增殖培养和壮苗培养后，利用诱导生根和大量生根两步法培养，可以获得大量无性系生根试管苗，其遗传性状稳定、叶片深绿色，与只采用第一步或第。
14、二步生根法比较，本发明所获得的生根试管苗的增殖率和生根率显著提高，平均根长和平均根数显著增加，同时具有取材容易，移栽后成活率高等特点，为理论研究、生产推广和扩大栽培面积提供了大量的生根试管苗。附图说明0025图1是经过增殖培养后的梨试管苗。0026图2是壮苗培养后获得的组培苗。0027图3诱导生根培养后获得的生根苗。0028图4经过大量生根培养后获得的生根试管苗。0029图5生根试管苗经炼苗后的图片。0030图6生根试管苗移栽后的图片。0031具体实施实例0032BA苄氨基腺嘌呤；NAA1萘乙酸；IAA吲哚3乙酸；IBA3吲哚丁酸。0033MS培养基的组成1大量元素NH4NO31650MG/L。
15、，KNO31900MG/说明书CN104186321A3/6页6L，CACL22H2O440MG/L，MGSO47H2O370MG/L，KH2PO4170MG/L；2微量元素MNSO44H2O223MG/L，ZNSO47H2O86MG/L，COCL26H2O0025MG/L，CUSO45H2O0025MG/L，NA2MOO42H2O025MG/L，KI0083MG/L，H3BO362MG/L；3铁盐NA2EDTA373MG/L，FESO47H2O278MG/L；4有机物质烟酸05MG/L，盐酸硫胺素01MG/L，盐酸吡哆醇05MG/L，肌醇100MG/L，甘氨酸2MG/L。MS培养基的溶剂为水。
16、。00341/3MS培养基成分与MS培养基相同，其中大量元素的浓度取MS培养基中相同成分的1/3，其他成分的浓度同MS培养基。0035QL培养基的组成1大量元素NH4NO3400MG/L，KH2PO4270MG/L，CANO383377MG/L，MGSO417579MG/L；2微量元素H3BO362MG/L，COCL26H2O0025MG/L，CUSO45H2O0025MG/L，MNSO4H2O076MG/L，NA2MOO42H2O025MG/L，KI008MG/L，ZNSO47H2O86MG/L；3铁盐NA2EDTA373MG/L，FESO47H2O278MG/L；4有机物质肌醇2961MG。
17、/L，盐酸硫胺素0118MG/L。QL培养基的溶剂为水。00361/4QL培养基成分与QL培养基相同，其中大量元素的浓度取QL培养基中相同成分的1/4，其他成分的浓度同QL培养基。0037实施例10038以梨试管苗进行生根培养。进行试验的梨为砧木杜梨、豆梨以及品种苏翠1号和苏翠2号。采用如下方法获得砧木杜梨、豆梨以及品种苏翠1号和苏翠2号的试管苗在1/3MS培养基中添加终浓度为2030G/L蔗糖和终浓度为57G/L琼脂，取各品种组培苗，剪取2CM新稍接种于上述培养基中，在2225条件下培养，每天光照16H、黑暗8H，光照强度为15002000LX，每15D继代一次，继代2次，得到各品种的生根备。
18、用试管苗。0039将砧木杜梨、豆梨以及品种苏翠1号和苏翠2号的生根备用试管苗，分别进行生根培养，具体方法如下00401增殖培养剪取生根备用试管苗的新稍，转接到增殖培养基中进行增殖培养。增殖培养基是在MS培养基中添加BA、NAA、蔗糖和琼脂后形成的固体培养基，其中BA终浓度为05MG/L、NAA终浓度为002MG/L、蔗糖终浓度为2030G/L、琼脂终浓度为57G/L，PH5558。培养条件在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，培养时间为30天。从图1可以看出，经增殖培养后的试管苗长出许多丛生芽，增殖系数较高。00412壮苗培养将增殖培养后的梨试管苗剪掉基部，。
19、转接到继代培养基中进行培养，获得组培苗。继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基中添加蔗糖和琼脂后获得的固体培养基，其中蔗糖的终浓度为2030G/L，琼脂的终浓度为57G/L，PH5558。培养条件为在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，每隔15天更换新鲜的继代培养基，培养时间为30天。从图2可以看出，壮苗培养后获得的组培苗茎干健壮，叶片平展、深绿色，植株生长正常。00423诱导生根培养将步骤2获得的组培苗转接到生根培养基A中，在25、黑暗条件下培养10D，转入生根培养基B中，在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，培养30。
20、天，获得生根苗。生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA、NAA、蔗糖和琼脂后得到的培养基,PH5558，IAA的终浓度为05MG/L，所述BA的终浓度为10MG/L，NAA的终浓度为01MG/L，蔗糖终浓度为2030G/L，琼脂终浓度为57G/L。生说明书CN104186321A4/6页7根培养基B是1/4QL培养基。从图3可以看出，组培苗被诱导生根，且组培苗根基部生长正常无膨大现象。00434大量生根培养将步骤3获得的生根苗转接至生根培养基C中进行培养，获得大量生根的试管苗。大量生根培养的条件为在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，培养45D。。
21、生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA和蔗糖后得到的液体培养基，PH5558，IBA的终浓度为30MG/L、蔗糖的终浓度为2030G/L。从图4可以看出，经大量生根培养获得的生根试管苗平均根长、平均根数得到显著提高。0044各品种梨的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长如表1所示。可以看到，采用本发明生根培养方法获得的各品种梨的增殖率为100，生根率较高，平均生根数较多，平均根长较长。0045表1各品种梨生根试管苗的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长0046品种增殖率生根率平均生根数个平均根长CM杜梨1009298211045豆梨1009245191125苏翠1号10089751898。
22、5苏翠2号1009145189650047将各品种生根试管苗，在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，空气湿度8090，开瓶炼苗。开瓶炼苗时间为810D，从图5可以看出植株生长正常，无污染。0048将大量生根的试管苗，经开瓶炼苗后，移栽于蛭石珍珠岩营养土111的营养盒中，25D后统计成活率，植株的成活率为8092，生长状况良好，从图6可以看出植株地上部生长旺盛、叶片深绿色。0049实施例20050将砧木杜梨、豆梨以及品种苏翠1号和苏翠2号的生根备用试管苗实施例1中方法获得，分别进行生根培养，具体方法如下00511增殖培养剪取生根备用试管苗的新稍，转接到增殖培养。
23、基中进行增殖培养。增殖培养基是在MS培养基中添加BA、NAA、蔗糖和琼脂后形成的固体培养基，其中BA终浓度为05MG/L、NAA终浓度为002MG/L、蔗糖终浓度为2030G/L、琼脂终浓度为57G/L，PH5558。培养条件在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，培养时间为30天。00522壮苗培养将增殖培养后的梨试管苗剪掉基部，转接到壮苗培养基中进行培养，获得组培苗。壮苗培养基是1/3MS或1/4QL培养基中添加蔗糖和琼脂后获得的固体培养基，其中蔗糖的终浓度为2030G/L，琼脂的终浓度为57G/L，PH5558。培养条件为在2225条件下，每天光照16H。
24、、黑暗8H，光照强度15002000LX，每隔15天更换新鲜的壮苗培养基，培养时间为30天。说明书CN104186321A5/6页800533诱导生根培养将步骤2获得的组培苗转接到生根培养基A中，在25、黑暗条件下培养10D，转入生根培养基B中，在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，培养30天，获得生根苗。生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA、NAA、蔗糖和琼脂后得到的培养基,PH5558，IAA的终浓度为05MG/L，所述BA的终浓度为10MG/L，NAA的终浓度为01MG/L，蔗糖终浓度为2030G/L，琼脂终浓度为57G/L；生根培养基B。
25、是1/4QL培养基。0054各品种梨的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长如表1所示。可以看到，采用上述生根培养方法获得的各品种梨的增殖率为100，生根率较低，平均生根数较少，平均根长较短，显著影响了移栽后的成活率。0055表2各品种梨生根试管苗的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长0056品种增殖率生根率平均生根数个平均根长CM杜梨1008112448豆梨1006825452苏翠1号1007579346苏翠2号100786735000570058实施例30059将砧木杜梨、豆梨以及品种苏翠1号和苏翠2号的生根备用试管苗实施例1中方法获得，分别进行生根培养，具体方法如下00601增殖培养剪取生。
26、根备用试管苗的新稍，转接到增殖培养基中进行增殖培养。增殖培养基是在MS培养基中添加BA、NAA、蔗糖和琼脂后形成的固体培养基，其中BA终浓度为05MG/L、NAA终浓度为002MG/L、蔗糖终浓度为2030G/L、琼脂终浓度为57G/L，PH5558。培养条件在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，培养时间为30天。00612壮苗培养将增殖培养后的梨试管苗剪掉基部，转接到壮苗培养基中进行培养，获得组培苗。壮苗培养基是1/3MS或1/4QL培养基中添加蔗糖和琼脂后获得的固体培养基，其中蔗糖的终浓度为2030G/L，琼脂的终浓度为57G/L，PH5558。培养条件。
27、为在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，每隔15天更换新鲜的壮苗培养基，培养时间为30天。00623大量生根培养将步骤2获得的组培苗转接到生根培养基C中进行培养，获得大量生根的试管苗。大量生根培养的条件为在2225条件下，每天光照16H、黑暗8H，光照强度15002000LX，培养45D。生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA和蔗糖后得到的液体培养基，PH5558，IBA的终浓度为30MG/L、蔗糖的终浓度为2030G/L。0063各品种梨的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长如表3所示。可以看到，采用本发明生根培养方法获得的各品种梨的增殖率为100，。
28、生根率不高，平均生根数较少，平说明书CN104186321A6/6页9均根长较短，显著影响了移栽后的成活率。0064表3各品种梨生根试管苗的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长0065品种增殖率生根率平均生根数个平均根长CM杜梨10054691062豆梨10049581058苏翠1号10045361061苏翠2号1004962106000660067通过对比实施例1、2和3，可以看出经增殖培养和壮苗培养后得到的同样生长状况的组培苗，实施例1采用诱导生根和大量生根两步法，相较于实施例2和实施例3的方法，试管苗的生根率、平均根长、平均生根数均显著高于后两者，同时较好的根部生长状况也有利于提高其移栽成活率。说明书CN104186321A1/1页10图1图2图3图4图5图6说明书附图CN104186321A10。