一种血管紧缩素I转换酶活性抑制剂及其应用 【技术领域】
本发明涉及用于治疗和预防高血压的药物，具体地说是一种血管紧缩素I转换酶(angiotensin I coverting enzyme，略称为ACE)活性抑制剂及其应用。
背景技术
高血压的发病与肾素-血管紧缩素系统有着深深的相关性。肾素-血管紧缩素系统对存在于血管内皮细胞膜等的ACE起着重要的作用；即从肝脏分泌的血管紧缩素肽原被肾脏产生的肾素切断，由此产生了血管紧缩素I，血管紧缩素I由ACE切断成血管紧缩素II；这个血管紧缩素II使血管收缩造成血压升高，并且作用于副肾上皮质，促进了醛固酮分泌。
另一方面，血浆中激肽释放酶切断了激肽原蛋白，产生了舒缓激肽。舒缓激肽具有血管扩张作用，使血压下降。ACE使舒缓激肽分解成碎片，失去其使血管扩张的作用。
综上所述，ACE一方面产生使血压上升的血管紧缩素II；另一方面，使具有血管舒张作用的舒缓激肽分解；两个方面都造成了血压的上升。所以，如果抑制了ACE的活性，就可以抑制血压的上升，或者使血压下降。
作为ACE的活性阻碍物质，如广为人知的合成物卡普托普利，作为高血压的治疗药物被广泛使用。而且，最近几年从各种食品当中也发现和确定了多种具有ACE阻碍活性的肽；其中牛乳酪蛋白，发酵乳以及由鱼类由来的多种肽添加到食品中作为保健食品，在日本已经由国家批准作为特定地保健食品，实现了商品化(例如，日本的发明专利：特公昭60-23085；特公昭61-51562；特公昭61-51564)。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种安全性高的血管紧缩素I转换酶活性抑制剂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种血管紧缩素I转换酶活性抑制剂，其有效成份至少含有一种以Ala-Pro、Thr-Pro、Val-Pro、Glu-Pro、Lys-Pro、Arg-Pro，Gly-Pro所表示的氨基酸序列形成的二肽或这六种具有ACE抑制活性肽的盐类。
由于手相不同而定义为L型氨基酸和D型氨基酸；所述二肽(可形成的不同构型)包括L型和L型，L型和D型，D型和D型氨基酸组成的二肽。
所述血管紧缩素I转换酶活性抑制剂可用于治疗和预防高血压的药物或保健食品中。
以下，对上述ACE的抑制剂进行具体的说明，但是本发明的权利要求不受该说明的拘束和限制。
本发明的ACE抑制剂，是Ala-Pro，Thr-Pro，Val-Pro，Glu-Pro，Lys-Pro，Arg-Pro，Gly-Pro所表示的氨基酸序列形成的肽，以及由它们的盐类中至少一种作为有效成分；所述二肽的盐类可以用通常的方法生产；1)与酸反应产生的盐类：比如说盐酸，硫酸，硝酸，磷酸等无机酸；蚁酸，乙酸，丙酸，甘氨胆酸，苹果酸，柠檬酸，酒石酸，琥珀酸等有机酸等形成的盐类；2)与金属离子形成的盐类，包括钠盐，钾盐，钙盐，铵盐；以及3)与氨基乙醇，三乙氨，二环乙氨等形成的胺类盐等没有特别的限制。
本发明ACE抑制剂用于治疗和预防高血压的药物中，其可为加入各种充填剂所形成的散剂，颗粒剂，片剂，胶囊，悬浮液，乳化液，喷剂，粉剂等，通过口腔摄取或者是注射液的形式使用；本发明ACE抑制剂可经口腔和非经口腔投入使用；非经口腔的投入方法比如皮下和静脉注射，肛肠投入等；可以任意选用生理盐水，葡萄糖，安定剂，防腐剂，悬浮剂，乳化剂等制成的注射液。
本发明ACE抑制剂可以添加到各种食品当中，作为抑制血压保健食品；食品的形态可以是清凉饮料，乳酸饮料，调味品，汤类，奶酪，火腿，点心等。
本发明ACE抑制剂的使用量是没有特别的限制，具体的要根据高血压的程度，患者的年龄，体重，身体状况和给与的方法等因素适当地确定。比如对高血压的患者经口服摄取的场合，Ala-Pro，Thr-Pro，Val-Pro，Glu-Pro，Lys-Pro，Arg-Pro，Gly-Pro所表示的氨基酸序列而形成的肽以及它的盐类至少一种，每日按每公斤体重0.1-50毫克服用，如果使用其中两种以上活性肽的方式，可以按总和计量来考虑。
本发明具有如下优点：
1.药效期长。本发明六种抑制ACE二肽，分子量小，在消化道里非常容易吸收，六种活性肽的肽链的C端均是脯氨酸(其C末端是脯氨酸与前一个氨基酸形成的肽)，在肠道内不容易被蛋白酶消化分解掉，可以长时间在体内存在，在体内难以被分解，可以维持较长时间的抑制血压升高的效果。
2.安全性高。本发明的活性肽来源于天然(食品)蛋白质，作为药品和保健品对人体没有毒害等副作用，不会对身体造成危害，其在血管内的吸收性和吸收后的安定性都比较高，安全、廉价的，具有可生产性。
3.应用效果好。本发明应用现代分子生物学技术对鱼蛋白的酶解产物(对鱼蛋白质的蛋白水解酶的处理)进行了分离和纯化，通过氨基酸分析，得到了Gly-Pro，Ala-Pro，Thr-Pro，Val-Pro，Glu-Pro，Lys-Pro，Arg-Pro所表示的氨基酸序列形成的肽，这6种肽(或者其盐类中任何一种成份)抑制了肾素-血管紧缩素系统中的血管紧缩素I转换酶(angiotensin Icoverting enzyme，略称为ACE)的活性，阻止了血管紧缩素I转换成血管紧缩素II；从而可以降低动物血压，或者抑制动物血压的升高趋势。
4.用途广泛，意义深远。本发明的肽和其盐是从来没有的新发现的物质，有各种各样的作用和效果，如对ACE的抑制作用，前列腺素E2的合成促进作用，环前列腺素合成促进作用以及降低血压作用等；具体应用为ACE抑制剂的有效成分，降血压的有效成分，动脉硬化预防剂的有效成分；可以作为治疗高血压的药物或者是抑制血压升高趋势的药物以及健康保健品；此发明提示如果通过酶处理，从多种食品蛋白质中可以得到具有ACE抑制作用的生物活性肽；也提示从食品蛋白质中可以提取具有其他生理活性的肽类物质。
【具体实施方式】
实施例1
文献(1)阐述了从蛋白质的酶加水分解产物中分离肽的步骤和方法，以及活性肽对血管紧缩素I转换酶活性抑制的测定方法；[文献1.SusumuMaruyama，Hajime Itachi，Hideoki Tanaka，Noboru Tomizuka and HideoSuzuki.，Studies on the Active Site and Antihypertensive Activityof Angiotensin I-Coverting Enzyme Inhibitors Derivered from Casein，Agric.Biol.Chem.，51(6)，1581-1586，1987.]参照文献(1)的蛋白质降解和分离的方法，由鲢鱼蛋白的胰蛋白酶水解液体10毫升经SephadexLH 20柱进行层析分离，30％甲醇溶液洗脱，回收具有ACE活性抑制作用的分馏部分。这个过程重复了3次，即从总量30毫升中，把层析得到的活性部分减压浓缩后，加样至DEAE Toyopearl 650M column离子交换柱，通过蒸馏水的洗脱得到的活性分馏部分A，以及0-1摩尔氯化钠溶液的直线梯度洗脱得到的弱活性分馏部分B。
A部分加样至SP Toyopearl 650M column离子交换柱，通过蒸馏水的洗脱得到的活性分馏部分A-1，以及0-1摩尔氯化钠溶液的直线梯度洗脱得到的活性分馏部分A-2。A-1分馏部分再通过使用Symmetry C18 column的HPLC，用含有0.1％三氟乙酸的0-32％乙腈直线梯度洗脱得到了二肽的分馏部分A-1-1，A-1-2，A-1-3，A-1-4，A-1-5；同样的方法从A2得到了A-2-1，A-2-2；从B活性分馏部分得到了B-1，B-2，B-3，B-4。回收的11种肽经过减压干燥成为最终的测定氨基酸序列的样品。
这些测定氨基酸序列的样品经过Applied Biosystem公司制造的491型蛋白质序列测试仪的分析，确定A-1-1为Gly-Pro，A-1-2为Ala-Pro，Glu-Pro，Thr-Pro的混合体，A-1-3，A-1-4，A-1-5分别为Val-Pro，Gly-Ile，Gly-Leu；A-2-1，A-2-2分别为Lys-Pro，Arg-Pro；化学合成的上述肽的在HPLC溶出的时间与从鱼蛋白中精致的肽在HPLC上的溶出时间是一致的。由附表1来表示其中6种肽对ACE的抑制活性。
实施例2
文献(2)阐述了抑制血管紧缩素I转换酶的活性肽，对抑制遗传性管血压动物模型SHR大白鼠血压升高的测定方法[文献2.Hiroyuki Fujita，Masaaki Yoshikawa.，LKPNM：a prodrug-Type ACE-inhibitory peptidederived from fish protein.Immunopharmacology(44)，123-127，1999.]。
实施例1中的ACE抑制活性的测定方法参考文献(2)，从Sigma公司购入的兔肺由来的ACE，用22毫摩尔硼酸缓冲液(pH8.3)溶解，使它成为浓度为60毫单位每毫升浓度的溶液作为酶溶液。从Sigma公司购入的Hip-His-Leu(Hippuryl-L-histidyl-L-leucine)用上述的硼酸缓冲液溶解，作为浓度是7.6毫摩尔基质溶液。在0.5毫升的离心管内，加入测试液体，即鱼蛋白质的酶加水分解液，或者是活性肽50微升，在摄氏37度5分钟反应后，加入上述的基质溶液125微升，充分混合以后进行摄氏37度30分钟反应。之后，用10％的三氟乙酸20微升来停止反应。由ACE作用分离的马尿酸通过以下的HPLC条件来定量。
HPLC的测定条件
柱：μBondasphere 5μC8 300 column
洗脱液：含有0.1％三氟乙酸的0-32％乙腈直线梯度洗脱
流速：每分钟一毫升
检波波长：228nm的紫外检测
这个实验进行多次重复实验，抑制率由以下公式来算出
抑制率＝(A-B)/A×100(％)
公式中A：为不含抑制剂的马尿酸面积，B：含抑制剂的马尿酸面积。50％的抑制率浓度用IC50来表示。
附表1.鱼蛋白由来的活性肽对血管紧缩素I转换酶的抑制肽的种类50％ACE抑制率的浓度IC50(μMol)Gly-Pro 360Ala-Pro 29Glu-Pro 1000Thr-Pro 320Val-Pro 570Lys-Pro 22