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1、10申请公布号CN104120084A43申请公布日20141029CN104120084A21申请号201410335748722申请日20140715CGMCCNO902020140408C12N1/14200601A01N63/04200601A01P7/04200601C12R1/64520060171申请人云南农业大学地址650201云南省昆明市盘龙区黑龙潭72发明人陈斌杜广祖肖关丽和淑琪张立敏桂富荣李正跃严乃胜74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称一种黄绿绿僵菌MFYY090714及其应用57摘要本发明提供了一种黄绿绿僵菌METARHI。
2、ZIUMFLAVOVIRIDEMFYY090714及其应用，其中，该黄绿绿僵菌MFYY090714于2014年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO9020。该菌株是从白背飞虱体上分离得到的新菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对白背飞虱成虫致病力较好，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛用于白背飞虱的防治实践中。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页10申请公布号CN104120084ACN104120084A1/1页21一种黄绿绿。
3、僵菌METARHIZIUMFLAVOVIRIDEMFYY090714，于2014年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO9020。2权利要求1所述的黄绿绿僵菌MFYY090714在白背飞虱防治方面的应用。权利要求书CN104120084A1/5页3一种黄绿绿僵菌MFYY090714及其应用技术领域0001本发明属于微生物农药技术领域，尤其涉及一种黄绿绿僵菌MFYY090714及其应用。背景技术0002白背飞虱是一种水稻重要害虫，常与褐飞虱和灰飞虱统称为稻飞虱。近年来白背飞虱已成为我国西南地区，尤其在云南稻区稻飞虱的优势种，由于其有繁殖快、迁飞性和抗药。
4、性强等特点，大发生时可造成水稻严重减产，甚至绝收，严重制约着水稻的生产。对白背飞虱的防治一直以来都是害虫防治研究的重要内容，但长期以来主要依靠化学农药防治，大量使用化学农药对人类健康和环境造成威胁，因而探求环境友好的白背飞虱生物防治替代化学防治，极大减少化学农药的使用量已成为白背飞虱防治研究的重要课题。因白背飞虱隶属于刺吸式口器害虫，而绿僵菌、白僵菌等虫生真菌是以独特的方式侵入，其分生孢子主要通过表皮萌发侵入昆虫体壁，这为利用绿僵菌和白僵菌生物防治白背飞虱提供了基础。黄绿绿僵菌METARHIZIUMFLAVOVIRIDE作为一种重要的昆虫病原真菌，属于半知菌亚门丝孢纲绿僵菌属真菌，其寄主范围包。
5、括直翅目、同翅目、鞘翅目、半翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目等昆虫目前英国已广泛用于蝗虫的生物防治。目前，有关稻田自然感染褐飞虱的黄绿绿僵菌菌株及其致病性测定已有研究，但自然条件下侵染白背飞虱的黄绿绿僵菌及其对白背飞虱的致病致病性及其防治应用方面的相关研究报道还未见到。0003黄绿绿僵菌遗传稳定性较好，对人、畜、禽类、植物均未发现毒害，本菌在白背飞虱防治方面还未见报道。因此，在防治稻飞虱时又有很大的发展前景。发明内容0004本发明的目的在于提供一种黄绿绿僵菌METARHIZIUMFLAVOVIRIDEMFYY090714及其应用，旨在以该黄绿绿僵菌高效、无毒、安全、无残留、使用简便地防治白背飞虱。。
6、0005本发明是这样实现的，一种黄绿绿僵菌METARHIZIUMFLAVOVIRIDEMFYY090714已于2014年4月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，保藏号为NO9020，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编为100101。0006本发明从罹病白背飞虱成虫上分离获得黄绿绿僵菌野生菌株MFYY090714，将野生菌株MFYY090714回接于白背飞虱成虫上复壮得到黄绿绿僵菌菌株，对该菌株按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的黄绿绿僵菌。在PDA培养基上菌落圆形展开，黄绿色，气生菌丝绒毛状致密如絮，背面略显黄色。分生孢。
7、子梗疏松轮状分枝，其上着生12个瓶梗，瓶梗杆状，与孢子梗成宽的夹角，顶部剧尖72120481561830M，分生孢子单胞，广卵圆形，具不同的端部，大小为72933040M，分生孢子在瓶梗上形成向基性的链。该黄绿绿僵菌MFYY090714菌株属于快生长类型，菌落直径平均每天都有1CM以上的生长速度。产孢快、产孢量大，在PDA培养基上培养第5天时产孢量说明书CN104120084A2/5页4就可达1108孢子/ML。24小时孢子的萌发率达85以上。在26时，该菌分生孢子对白背飞虱成虫致死中浓度LC50为343105孢子/ML，LT50为415天。0007本发明的有益效果为该菌株是从白背飞虱体上分离。
8、得到的新菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对白背飞虱成虫致病力较好，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛用于白背飞虱的防治实践中。具体实施方式0008为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。0009实施例一、病原菌的分离、鉴定00101、材料与方法001111材料0012在云南省元阳梯田稻田采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病白背飞虱SOGATELLAFURCIFERAHORVTH成虫。0013马铃薯葡萄糖PDA培养基去皮马铃薯200G，切成小。
9、块，加水1L，20MIN后纱布过滤，滤液中加葡萄糖20G、琼脂1520G，加热溶化，定溶至1000ML无菌操作条件所有的器皿和用具均经高温灭菌锅121，30MIN，接种等操作均在超净工作台内进行。0014培养条件置于26光照12L12D恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到试管PDA斜面，培养34天，转入4冰箱储存。001512病原菌的分离和纯化0016分离从罹病白背飞虱成虫尸体上分离病原菌。将白背飞虱成虫尸体按顺序依次经过70酒精浸泡30秒、再经过01升汞溶液浸泡3分钟彻底消毒、最后用无菌水冲洗三次，将处理好的白背飞虱成虫尸体接种于PDA培养基上。在温度为26条件下培养，长出菌丝后按常规方法进行。
10、单孢分离、培养得到纯的、致病力强的黄绿绿僵菌菌株，转移到PDA斜面上生长34天，在4冰箱储存。0017复壮将分离到的菌株在PDA培养基上培养710天后，加入含1吐温80的无菌水收集孢子，后转移到烧杯内，用玻璃棒搅拌均匀，得到适当浓度108孢子/ML的孢子悬浮液，用小型喷雾器均匀喷于白背飞虱成虫体表以虫体表面湿润为度，保持相对湿度90以上。收集死虫并保湿，得到的成虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。0018纯化挑取培养基上菌落上的菌丝，再次接种在新的培养基上。如此多培养几代，菌株就得到了纯化。001913病原菌的鉴定0020根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。在4010倍。
11、生物显微镜，镜检菌丝和分生孢子的形态。00212、结果0022从被虫生真菌自然侵染的白背飞虱成虫虫体上分离获得野生菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA上培养，并回接于白背飞虱成虫复壮获得一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株，即黄绿僵菌METARHIZIUMFLAVOVIRIDEMFYY090714，CGMCC说明书CN104120084A3/5页5NO9020。0023在PDA培养基上菌落圆形展开，黄绿色，气生菌丝绒毛状致密如絮，背面略显黄色。分生孢子梗疏松轮状分枝，其上着生12个瓶梗，瓶梗杆状，与孢子梗成宽的夹角，顶部剧尖72120481561830M，分生孢子单胞，广卵圆形，具不同。
12、的端部，大小为72933040M，分生孢子在瓶梗上形成向基性的链。0024根据观察到的菌落、菌丝和孢子形态，与昆虫真菌学上的有关黄绿绿僵菌的形态特征描述和图谱进行对比分析，鉴定为黄绿绿僵菌。0025实施例二、黄绿绿僵菌纯化菌株生物学特性00261、材料与方法002711供试菌株选择纯化后长得均匀且生长旺盛的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到PDA培养基上，于26的恒温光照12L12D培养箱中培养。002812菌落生长速率和产孢量的测定将事先培养好的黄绿绿僵菌取一皿用8MM的打孔器打孔取菌，接种于新的培养基上，做三个重复，置于26的恒温光照12D12L培养箱中培养，每天定时测定其直径并记录，直到。
13、菌落长满培养基为止。用直径为8MM的打孔器在培养基相同的位置取菌饼，加1吐温80和20ML无菌水，将孢子洗下，制成孢子悬浮液，用血球计数板测定产孢量。002913孢子萌发率的测定将菌株培养510天，分别用无菌水收集分生孢子，制成悬浮液，用带凹槽的载玻片测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底铺滤纸的培养皿内，滴加几滴无菌水保持湿度在100RH，培养24小时后镜检，每个处理三次重复。00302、结果0031由表1可以看出，黄绿绿僵菌菌株MFYY090714属于快速生长的类型。第一天生长缓慢，是因为菌株刚接种时需要一段时间适应，菌落从第2天生长速度较快。由表2可以看出，在PDA培养。
14、基上培养至第5天产孢量就可达1108孢子/ML。产孢量较高。由表3可以看出，24小时孢子的萌发率可达85以上。这些均说明该菌株生长繁殖较快，生物学特性良好。0032表1菌落直径的生长速度00330034说明书CN104120084A4/5页60035表2产孢量测定结果00360037表3分生孢子萌发率24小时00380039实施例三、黄绿绿僵菌纯化菌株对白背飞虱的室内致病性测定00401、材料与方法004111供试虫源0042选择羽化后24小时同一批次、无病、大小一致的白背飞虱成虫作为试虫，将供试白背飞虱成虫置于养虫笼中种植的水稻苗上，在261和12L12D的光周期条件下饲养。004312孢子。
15、悬浮液的制备0044取长势良好的纯化黄绿绿僵菌用无菌水将分生孢子洗下并过滤配制成108孢子/ML分生孢子菌悬液，用无菌毛细滴管取滤液一滴滴于血细胞计数板上，在显微镜下数孢子并记录数据，用含05吐温80的无菌水依次稀释为108、107、106、105、104五个浓度梯度的说明书CN104120084A5/5页7孢子悬浮液，以含05吐温80的无菌水为空白对照，用于致病力测定。004513喷雾法0046将制备的浓度梯度孢子悬浮液用小型喷雾器均匀喷于白背飞虱成虫体表以虫体表面湿润为度，每个剂量三次重复，每个重复30头试虫，按下述方法进行接种吸取10ML黄绿绿僵菌孢子悬浮液于小型喷雾器中，用喷雾法对试虫。
16、喷雾接种，喷雾后将养虫笼置于26、相对湿度控制在85以上，12D12L光周期的养虫室。每天记录观察试虫的死亡虫量，并计算死亡率。00472、结果0048对白背飞虱成虫进行了毒力测定，黄绿绿僵菌METARHIZIUMFLAVOVIRIDE菌株MFYY090714分生孢子侵染白背飞虱的生活史过程。实验结果表明黄绿绿僵菌对白背飞虱成虫有明显的致病效果，累计校正死亡率为885，致死中时LT50为415D，致死中浓度LC50为343105孢子/ML。表明黄绿绿僵菌METARHIZIUMFLAVOVIRIDE菌株MFYY090714具有开发为控制水稻白背飞虱的微生物农药的潜力。0049该菌株是我们首次从白。
17、背飞虱上分离纯化获得的黄绿绿僵菌METARHIZIUMFLAVOVIRIDE菌株MFYY090714，CGMCCNO9020，该菌株在温度为26、相对湿度80以上在PDA培养基上生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对白背飞虱成虫致病力较好，可以广泛地用于白背飞虱的防治。同时，该菌株培养原料来源广泛，价格便宜，培养方法简单，易大量进行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治白背飞虱，即为典型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药性及环境污染等问题，将为白背飞虱绿色防控提供依据。0050以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104120084A。