蛋白质和蛋白质/磷脂微胶囊及其制备方法 本发明所属技术领域
本发明涉及生物兼容性微胶囊及其制备方法，尤其涉及蛋白质和蛋白质/磷脂微胶囊及其制备方法。
与本发明相关的背景技术
微胶囊技术是一种用成膜材料把固体或液体包覆，使形成微小粒子的技术。利用微胶囊技术所得到的微小粒子称为微胶囊，一般而言，粒子大小在微米或毫米范围。把包在微胶囊内部的物质称为囊心(也有的称为芯材、包容物、内核、或封闭物)。囊心可以是固体，也可能是液体或气体。把微胶囊外部由成膜材料形成的包覆膜称为壁材(也有的称为外膜、壳体、囊壁、或包膜)。
微胶囊能保护物质免受环境影响，具有屏蔽味道、颜色，改变物质重量、体积、状态、或表面性能，隔离活性成分，降低挥发性和毒性，控制释放等多重作用，因而可广泛应用于医药、食品、农药、化妆品、金属切削、涂料、和油墨等多个领域。
在现有技术关于利用界面聚合法制备微胶囊的介绍中，是把分散后溶解得很好的囊芯、单体溶于一种溶剂所获得溶液，并将该溶液加入具有毛细管针头的注射器，把该注射器针头放在离液面很近的距离，再在针头与液面之间施加高压直流电。液体通过毛细管针头在电动马达的驱动下进入具有第二反应单体的溶液，在液滴表面引发缩聚反应。现有技术还公开了一种单体发生自聚反应，参见中国工业出版社梁治齐编著的《(微胶囊技术及其应用》，P143。
其他现有技术还公开了利用凝聚相分离法制备微胶囊，其过程是首先把囊心分散到含有是聚合物(壁材)的胶体溶液中，通过机械搅拌等方法形成一个稳定的、分散相呈细小微粒的分散体系。其中，分散相是囊心的溶液或固体颗粒，连续相是壁材的胶体溶液。然后，根据壁材胶体溶液的性质改变各种条件，如在连续相中加入电解质无机盐、壁材的非溶剂、或改变胶体溶液的温度、浓度、pH值等方法使得连续相发生相分离，形成两个新相，一个是聚合物(壁材)丰富相，另一个是聚合物(壁材)缺乏相，使原来的两相体系转变为三相体系。由于体系存在降低表面自由能地自发倾向，可以自由流动的是聚合物丰富相，而且聚合物丰富相会在囊心分散相表面聚集，并逐渐把囊心包覆。最后，使沉积在囊心周围的壁材形成连续的包膜，经固化而形成微胶囊。
现有技术已披露的微胶囊壁材，通常是由天然的、或合成的高分子材料形成。许多高分子材料都不能生物降解，因此对人体和环境有害。以蛋白质、磷脂为主要成分的微胶囊具有良好的生物兼容性，并具有独特的释放速度和降解特性，为特殊药物的制备提供更多的选择。但是，由于蛋白质的不稳定性，其易变性和降解，从而使利用蛋白质制备这类生物兼容性的微胶囊大大受到限制。
【发明内容】
发明要解决的技术问题
针对现有技术所存在的上述问题，本发明的目的是利用蛋白质制备生物兼容性的微胶囊。
本发明利用蛋白质在弯曲的液/液界面上吸附、成膜来制备蛋白质微胶囊的方法是在常温常压下进行，所用条件温和，易于控制，因此在胶囊化工程中不易破坏蛋白质分子间的各种相互作用力，有效地解决了蛋白质胶囊化的稳定性问题。采用这种方法可以得到稳定的蛋白质微胶囊、蛋白质/磷脂复合膜微胶囊。
本发明的发明人已申请的中国专利申请(申请号：02130265.0)中，披露了利用悬吊液滴技术在液/液界面上制备蛋白质微胶囊。液/液界面制备微胶囊，条件更为温和，对于制备具有敏感材料的囊芯或囊壁构成的微胶囊具有重要意义，尤其对于制备药物水剂、精确控制靶向给药、药物的缓释，以及仿生物膜制备等方面具有特殊意义。
基于在先提出的中国专利申请02130265.0，本发明在解决蛋白质膜微胶囊在活性体系中和流体界面上的稳定性之后，进一步提供制备蛋白质微胶囊、蛋白质/磷脂复合膜微胶囊的新方法，提高生产效率，降低生产成本。
本发明进一步的目的在于实施微胶囊化药物的应用。
本发明的技术方案
根据本发明的第一个方面，是提供一种制备蛋白质微胶囊的方法，包括以下步骤：
a.将油相溶液加入水溶性的蛋白质缓冲溶液中；
b.使油相均匀地分散到蛋白质缓冲溶液中，形成小液滴；
c.水溶性的蛋白质缓冲溶液中的蛋白质在油相小液滴表面上吸附成膜；以及
d.形成蛋白质微胶囊。
根据本发明的另一个方面，是提供一种制备蛋白质/磷脂微胶囊的方法，包括以下步骤：
e.将溶有磷脂的油相溶液加入水溶性的蛋白质缓冲溶液中；
f.使油相均匀地分散到蛋白质缓冲溶液中，形成小液滴；
g.水溶性的蛋白质缓冲溶液中的蛋白质，以及油相中的磷脂，分别在小液滴与缓冲溶液的界面上吸附成膜；以及
h.形成蛋白质/磷脂微胶囊。
进一步，上述油相溶液中包括油溶性的药物，已采用的模型药物是布洛芬。
同时，根据本发明还提供了一种蛋白质或磷脂/蛋白质在油相和缓冲液的界面上吸附成膜得到的微胶囊。该微胶囊中可包裹有油溶性药物，如布洛芬。
本发明的有益效果
本发明实现了两种互不相溶的液体界面上进行蛋白质或蛋白质/磷脂复合膜的有序组装工作，并制得了具有良好生物兼容性的微胶囊。
根据本发明的方法容易控制微胶囊尺寸在很小的范围内，而胶囊尺寸分布越窄，其对特殊的药物制备更有应用价值。
根据本发明的方法特别适合制备敏感材料的囊芯或囊壁构成的微胶囊，可应用于制备药物水剂、精确控制靶向给药、药物的缓释，以及仿生物膜制备等方面。
尤其特别的是，根据本发明制备微胶囊的方法，无需固态的囊芯，所用的液态囊心也极易除去。
根据本发明利用乳化方法，可更简便、快捷地制备大量的蛋白质微胶囊及蛋白质/磷脂微胶囊，并能用于油溶性药物的包裹和释放，有效降低了成本，容易实现规模化的生产。
为了更容易理解本发明的目的及实施和优点，在下文提供了更详细的描述，以及优选实施例和附图。应当明了的是，对本发明的详细描述是为了解释本发明的原理，不能构成对本发明的限制。
附图简要描述
图1是乳化法制备蛋白质微胶囊的示意图；
图2是用人血清白蛋白(HSA)制备的微胶囊；
图3是用人血清白蛋白(HSA)和双十六烷酰磷脂酸(DPPA)制备的微胶囊；以及
图4是用人血清白蛋白(HSA)制备的微胶囊，并包裹了药物布洛芬。
【具体实施方式】
除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。
制备蛋白质微胶囊
水相为蛋白质的缓冲溶液，可以是pH值在2-8之间的磷酸盐缓冲溶液。油相溶剂为化学惰性且易挥发的有机溶剂，优选氯仿。
将浓度为0.1mg/mL-2mg/mL的蛋白质缓冲溶液加入容器中，再将有机溶剂加入其中。有机相和水相是不互溶的，这两相间存在明显的界面(如图1所示)。
利用振荡(或超声)处理，使有机相分散到缓冲溶液中，形成油性小液滴。缓冲溶液中的蛋白质分子在油滴表面迅速吸附并发生分子间的相互作用(包括静电作用、疏水相互作用、氢键等)，形成蛋白质膜，包裹在小油滴的表面，使油性小液滴能够稳定地分散到缓冲溶液中，而不再是融合为一个连续的有机相。
常温下，利用油性小液滴的尺寸差异和油水两相的密度差异，进行油性小液滴和水相沉降分离，需要几分钟到两天时间完成。沉降完全之后，将分离澄清的蛋白质缓冲溶液，放入另一容器中。该沉降分离技术是本领域技术人员熟知的。该蛋白质缓冲溶液可以重复使用。
用缓冲溶液洗涤所获得的油性小液滴3-5次。通过自然蒸发或强制蒸发的方式，可以除去微胶囊内的有机溶剂，强制蒸发包括但不限于加热蒸发或减压旋转蒸发等方法。除去有机溶剂后，就形成了中空的微胶囊。
可以利用振荡(或超声)处理的频率或时间来控制小油滴的尺寸，从而控制微胶囊的尺寸。根据本发明的一个实施例，将混合的两相溶液超声处理5-20分钟，得到分布均匀，尺寸小的微胶囊，其直径在1-200微米之间。进而，通过沉降分离方法，可以获得10到100微米之间的胶囊。沉降分离方法是本领域技术人员应知的。
制备蛋白质/磷脂微胶囊
采用溶有磷脂的有机溶液代替纯的有机溶剂加入蛋白质缓冲溶液中，同样能够得到稳定的微胶囊。当所采用的蛋白质缓冲溶液的pH值在其等电点之下时，一般可选用带负电荷的磷脂，如：磷脂酸(PA)，磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰甘油(PG)等；当所采用的蛋白质缓冲溶液pH在其等电点之上时，一般选用中性的磷脂，如：磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)等。
采用振荡(或超声)处理形成小油滴后，蛋白质和磷脂分子分别从两个亚相(水相和油相)到达液/液界面上，在界面上相遇并发生相互作用。界面上的蛋白质和蛋白质分子之间以及蛋白质和磷脂分子之间发生相互作用，一段时间后，在界面上形成稳定的磷脂/蛋白质的复合多层膜，这层膜将溶有磷脂的液滴包裹起来，形成磷脂/蛋白质微胶囊。控制微胶囊尺寸的方法与根据本发明制备蛋白质胶囊的方法相同。
通过自然蒸发或强制蒸发的方式，微胶囊内的有机溶剂可以被除去，可形成了中空的微胶囊。
药物模型的应用
也可以采用溶有油溶性药物的有机溶剂代替纯的有机溶剂加入蛋白质缓冲溶液中，同样能够得到稳定的微胶囊。通过振荡(或超声)处理，使溶有药物的油相分散到缓冲溶液中，形成油性小液滴。缓冲溶液中的蛋白质分子在油滴表面迅速吸附，并发生相互作用，形成蛋白质膜，包裹在小油滴的表面，使油性小液滴能够稳定地分散到缓冲溶液中，而不是再融合为一个连续的油相。之后，通过自然蒸发或强制蒸发除去微胶囊内的有机溶剂，溶在有机溶剂中的药物则在微胶囊内结晶析出，形成包裹了药物的蛋白质微胶囊。
同样的方法，可采用溶有磷脂和药物的有机溶液代替纯的有机溶剂，得到包裹了药物的蛋白质/磷脂微胶囊。
本发明采用布洛芬(Ibuprofen)作为模型药物，溶于氯仿中制备蛋白质微胶囊以及蛋白质/磷脂微胶囊。当微胶囊内的氯仿挥发后，布洛芬在微胶囊内结晶析出，就制得了包裹药物的微胶囊。
实施例1
根据本发明的方法(如图1所示)，将1.0-1.5mL浓度为0.5mg/mL的人血清蛋白(HSA)的磷酸盐缓冲溶液(NaH2PO4-Na2HPO4，pH＝3.8)加入玻璃试管中，再将0.5-1.0mL氯仿加入其中。为了能用荧光显微镜观察制得的微胶囊，在氯仿中溶解了少量(10-6M)荧光试剂罗丹明(Rhodamine 6G)。氯仿和水相是不互溶的，这两相间存在一个明显的相界面。然后，通过振荡(或超声)处理5分钟左右，使氯仿分散到缓冲溶液中，形成氯仿小液滴。
缓冲溶液中的蛋白质分子在氯仿小液滴表面迅速吸附并发生分子间相互作用，形成蛋白质膜。这样氯仿小液滴之间就不会相互融合为一个连续的氯仿油相，从而使它们能够稳定地分散于缓冲溶液中。常温下，氯仿小液滴和水相沉降分离30分钟左右，吸出上层澄清的蛋白质缓冲溶液放入另一玻璃试管中，并可以再次使用。
用缓冲溶液洗涤下层的氯仿小液滴3-5次，将它们转移到荧光显微镜下观察内部的有机相挥发、微胶囊的形成过程(如图2A-E所示)。蛋白质膜内的氯仿全部挥发后，得到了10-40微米的人血清蛋白微胶囊。
实施例2
根据本发明的方法(如图1所示)，将1.0-1.5mL浓度为0.5mg/mL的人血清蛋白(HSA)的磷酸盐缓冲溶液(NaH2PO4-Na2HPO4，pH＝3.8)加入玻璃试管中，再将0.5-1.0mL溶有双十六烷基酰磷脂酸(DPPA：10-4M)的氯仿加入其中，并用DPPE-N-NBD(10-6M)作荧光试剂。振荡(或超声)处理5分钟左右，使油相分散到缓冲溶液中，形成油性小液滴。磷脂分子和蛋白质分子分别从油、水两个亚相小液滴界面上迅速吸附，并发生蛋白质分子间和蛋白质和磷脂分子间的相互作用，形成蛋白质/磷脂复合膜，使小液滴稳定地分散在缓冲溶液中。常温下，小液滴和水相沉降分离30分钟左右，吸出上层澄清的蛋白质缓冲溶液放入另一玻璃试管，并可以再次使用。洗涤下层的小液滴3-5次后，置于荧光显微镜下观察(如图3所示)，得到了5-20微米的蛋白质/磷脂微胶囊。
实施例3
根据本发明的方法(如图1所示)，用溶有药物布洛芬的氯仿溶液(0.1g/mL)代替实施例1中的纯氯仿，其原理和步骤与实施例1基本相同。随着有机溶剂氯仿的挥发，药物布洛芬在蛋白质微胶囊内结晶并析出，制得了包裹了药物的蛋白质微胶囊(如图4所示)。
实施例4
根据本发明的方法(如图1所示)，用溶有药物布洛芬(0.1g/mL)和磷脂DPPA(10-4M)的氯仿溶液代替实施例1中的纯氯仿，其原理和步骤与实施例1基本相同。随着有机溶剂氯仿的挥发，药物布洛芬在蛋白质微胶囊内结晶并析出，制得了包裹了药物的蛋白质/磷脂微胶囊。
实施例5
根据本发明的方法(如图1所示)，用溶有双十四烷基酰磷脂酸(DMPA：10-4M)的氯仿溶液代替实施例2中的DPPA的氯仿溶液，其原理和步骤与实施例2基本相同。得到HSA/DMPA微胶囊。
实施例6
根据本发明的方法(如图1所示)，用0.5mol/L的乳球蛋白(β-lactoglobulin)代替实施例1中的人血清蛋白(HSA)，其原理和步骤与实施例1基本相同，得到了乳球蛋白微胶囊。
尽管本发明已经参照附图和优选实施例进行了说明，但是，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本发明的各种更改，变化，和等同物由所附的权利要求书的内容涵盖。