与受干扰的膜结合的化合物及其应用方法.pdf

本发明涉及可选择性地与正在经历其正常质膜组织的干扰及改变的细胞如正在经历凋亡的细胞或活化的血小板结合的化合物。本发明进一步提供在医疗实践中利用所述化合物用于诊断及治疗目的的方法。

1.  一种将化合物选择性地靶向其质膜的正常组织正在经历干扰的细胞(PNOM细胞)的方法，其包括以下步骤：
(i)将包含所述PNOM细胞的细胞群体与一种化合物或包含所述化合物的结合物接触，其中所述化合物如式(I)结构所示，包括如式(I)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中每个R和R’基团各自独立地选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表氢、或C₁、C₂、C₃或C₄烷基；x和z分别独立地代表0、1或2的整数，其中x和z可相同或不同；y是0、1或2的整数，其中当y＝2时各取代基R’可相同或不同；并且D是用于诊断的标记物、氢、羟基、F或药物；
(ii)从而选择性地将所述化合物靶向于所述细胞种群中的所述PNOM细胞。

2.  一种探测细胞种群中PNOM细胞的方法，所述方法包括：
(i)将所述细胞群体与一种化合物或包含所述化合物的结合物接触，
其中所述化合物如式(I)结构所示，包括如式(I)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中每个R和R’基团各自独立地选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表氢、或C₁、C₂、C₃或C₄烷基；x和z分别独立地代表0、1或2的整数，其中x和z可相同或不同；y是0、1或2的整数，其中当y＝2时各取代基R’可相同或不同；并且D是用于诊断的标记物；以及
(ii)测定与所述细胞结合的所述化合物的量，其中显著量的所述化合物与某细胞结合提示其为PNOM细胞。

3.  一种探测患者或者动物中PNOM细胞的方法，其包括：
(i)给药一种化合物或包含所述化合物的结合物，其中所述化合物如式(I)结构所示，包括如式(I)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中每个R和R’基团各自独立地选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表氢、或C₁、C₂、C₃或C₄烷基；x和z分别独立地代表0、1或2的整数，其中x和z可相同或不同；y是0、1或2的整数，其中当y＝2时各取代基R’可相同或不同；并且D是用于诊断的标记物、氢、羟基、F或药物；以及
(ii)对患者或动物造影，从而测定与细胞结合的所述化合物的量，其中显著量的所述化合物与某细胞结合提示其为PNOM细胞。

4.  一种将化合物选择性地靶向其质膜的正常组织正在经历干扰的细胞(PNOM细胞)的方法，其包括以下步骤：
(i)将包含所述PNOM细胞的细胞群体与一种化合物或包含所述化合物的结合物接触，其中所述化合物如式(II)结构所示，包括如式(II)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表氢、C₁、C₂、C₃或C₄烷基；D是用于诊断的标记物、氢或药物；
(ii)从而选择性地将所述化合物靶向于所述细胞种群中的所述PNOM细胞。

5.  一种探测细胞种群中PNOM细胞的方法，所述方法包括：
(i)将所述细胞群体与一种化合物或包含所述化合物的结合物接触，其中所述化合物如式(II)结构所示，包括如式(II)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表不存在、氢、C₁、C₂、C₃或C₄烷基；D是用于诊断的标记物；以及
(ii)测定与所述细胞结合的所述化合物的量，其中显著量的所述化合物与某细胞结合提示其为PNOM细胞。

6.  一种探测患者或者动物中PNOM细胞的方法，其包括：
(i)给药一种化合物或包含所述化合物的结合物，其中所述化合物如式(II)结构所示，包括如式(II)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表氢、C₁、C₂、C₃或C₄烷基；D是用于诊断的标记物；以及
(ii)对患者或动物造影，从而测定与细胞结合的化合物的量，其中显著量的所述化合物与某细胞结合提示其为PNOM细胞。

7.  如权利要求4-6之一所述的方法，其中所述化合物如式(III)结构所示，包括如式(III)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R³为羟基或F；R⁴选自C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀直链或支链烷基，并且k为选自0、1、2、3、4和5的整数。

8.  如式(IV)结构所示的化合物，包括如式(IV)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：


9.  如式(V)结构所示的化合物，包括如式(V)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中J选自-F或-OH，并且r代表4、5、6、7、8、9或10的整数。

10.  如式(VI)结构所示的化合物，包括如式(VI)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中J选自氢、F和OH。

11.  如权利要求10所述的化合物，其中J为F。

12.  如式(VII)结构所示的化合物，包括如式(VII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、和溶剂化物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中Q选自锝、氧合锝、铼和氧合铼，R⁴选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链烷基，并且p代表选自1、2、3、4和5的整数。

13.  如权利要求12所述的化合物，其如式(VIII)结构所示，包括如式(VIII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、和溶剂化物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中Q选自锝、氧合锝、铼和氧合铼。

14.  如权利要求4-6之一所述的方法，其中所述化合物如式(IX)结构所示，包括如式(IX)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R⁵选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链烷基、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链氟代烷基、和C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链羟基烷基；q代表选自1、2、3、4和5的整数；以及Y为荧光标记物。

15.  如式(X)结构所示的化合物，包括如式(X)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：


16.  如权利要求4-6之一所述的方法，其中所述化合物如式(XI)结构所示，包括如式(XI)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合。

17.  如式(XII)结构所示的化合物，包括如式(XII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中F为¹⁸F或¹⁹F。

18.  如式(XIII)结构所示的化合物，包括如式(XIII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；m代表0、1、2、3或4的整数；D是用于诊断的标记物或者将被靶向于PNOM细胞的药物。

19.  如式(XIV)结构所示的化合物，包括如式(XIV)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中F为¹⁸F或¹⁹F。

20.  包含或连接至用于造影的标记物的如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物，其中所述用于造影的标记物为Tc、Tc＝O、In、Cu、Ga、Xe、Tl、Re及Re＝O、¹²³I、¹³¹I、Gd(III)、Fe(III)、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Mn(II)、¹⁸F、¹⁵O、¹⁸O、¹¹C、¹³C、¹²⁴I、¹³N、⁷⁵Br、Tc-99m或In-111。

21.  一种药物或者诊断组合物，其包含有效量的如权利要求8-13、l5、17、18及19之一所述的化合物作为活性成分以及药物学或者诊断可接受的载体。

22.  用于将药物靶向于人类或非人类患者中的凋亡中心或血液凝固中心的药物组合物，其中所述药物组合物包含如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物以及药物学可接受的载体，其中所述化合物包含药物或连接至药物。

23.  一种探测受检个体的可疑身体区域的肿瘤内凋亡细胞的方法，所述方法包括：
(i)给药一种化合物或包含所述化合物的结合物，其中所述化合物如式(I)结构所示，包括如式(I)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中每个R和R’基团各自独立地选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表氢、或C₁、C₂、C₃或C₄烷基；x和z分别独立地代表0、1或2的整数，其中x和z可相同或不同；y是0、1或2的整数，其中当y＝2时各取代基R’可相同或不同；并且D是用于诊断的标记物；以及
(ii)测定与肿瘤中或者包含所述肿瘤的器官中的细胞结合的所述化合物的量，其中显著量的所述化合物与可疑区域内的细胞结合提示这些肿瘤细胞正在经历凋亡。

24.  一种将抗癌药物靶向于凋亡细胞中心的方法，所述方法包括以下步骤：给药包含细胞毒性药物或连接至细胞毒性药物的如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV之一结构所示的化合物，从而实现将所述药物靶向于肿瘤内的细胞死亡中心。

25.  一种将抗凝血剂或纤溶剂靶向于血栓的方法，所述方法包括以下步骤：给药包含所述抗凝血剂或纤溶剂的如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV之一结构所示的化合物，从而实现将所述药物靶向于血栓。

26.  如权利要求1-6之一所述的方法，其中所述用于诊断的标记物为用于造影的标记物或者经标记的金属螯合物，其中所述用于造影的标记物或者螯合的金属可通过颜色、荧光、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、或放射性同位素扫描、或单光子发射断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)探测。

27.  如权利要求1-6以及22-26之一所述的方法，其中所述用于造影的标记物为¹⁸F。

与受干扰的膜结合的化合物及其应用方法
技术领域
本发明涉及可选择性地与正在经历其正常质膜组织的干扰及改变的细胞相结合的化合物，即，正在经历细胞死亡的细胞、凋亡(apoptotic)细胞或活化的血小板。本发明进一步提供在医疗实践中利用所述化合物用于诊断及治疗目的的方法。
背景技术
完好的真核细胞的质膜(外膜)的特点在于其高度组织的结构。膜组织的高水平尤其取决于组成所述膜的特定脂质的分子结构；组成所述膜的各种脂质之间的比例；所述膜的外小叶与内小叶之间的磷脂分布；以及膜蛋白成分。
虽然维持质膜组织的高水平对正常细胞生理学很重要，但细胞质膜的正常组织的相当的干扰及改变(PNOM)存在于许多的生理及病理状况中，而且表征着许多疾病。这种变更及干扰可既在形态学水平(在正在经历细胞凋亡的细胞中观察到的膜起泡(blebbing))显著又在分子水平显著。PNOM尤其包括随着氨基磷脂——主要是通常几乎全部局限于膜双分子层的内小叶的磷脂酰丝氨酸(PS)及磷脂酰乙醇胺(PE)——运动至细胞表面以及鞘磷脂(SM)及磷脂酰胆碱(PC)从所述膜的外小叶到内小叶的交互运动的膜磷脂的争夺及重新分配。该重新分配于此处被称作细胞膜脂质不对称性(CMLA)的丧失。除CMLA丧失之外，PNOM还经常与膜磷脂堆积(packing)水平的降低以及膜流体性的增大有关。
这些变更在赋予细胞表面用于组装若干凝血因子复合物如tenase和凝血酶原酶蛋白复合物的催化平台方面起重要作用。因此，血小板活化与正在经历PNOM的血小板膜有关，并且这些变更构成正常血液凝固以及许多疾病中异常、过度的血液凝固的引发和/或蔓延的重要因素。这些疾病尤其包括动脉或静脉血栓或血栓栓塞[例如脑卒中、心急梗塞、深静脉血栓、弥散性血管内凝血(DIC)、血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenic purpura)等]、不稳定的动脉粥样硬化斑块(unstableatherosclerotic plaques)、镰状细胞病、β-珠蛋白生成障碍性贫血、抗磷脂抗体综合症[包括于系统性红斑狼疮中的]、以及与膜微粒脱落有关的疾病如与旁路(bypass)有关的神经功能紊乱。
凋亡是其中发生细胞膜变更/干扰的主要情形。凋亡是每个细胞内固有的细胞自我破坏或“自杀”的内在程序。作为对触发刺激的反应，细胞经历细胞收缩、细胞膜起泡、染色质浓缩以及断裂事件的高度特征性的级联，并终极于细胞到结合于膜的颗粒簇(凋亡体)的转化，其继而被巨噬细胞吞噬。PNOM是凋亡的普遍现象，其发生于可能接近细胞投入死亡过程时的凋亡级联的早期，并且被证实是凋亡细胞被巨噬细胞识别并清除的重要因素。
最近发现PNOM与凋亡细胞的有效的促凝血活性间存在高度相关性。凋亡的内皮细胞中的PNOM例如动脉粥样硬化斑块中发生的PNOM可能在病理发生疾病(pathogenesis plaques)中起重要的作用。
由于凋亡和血栓症对大部分医学疾病均具有重要作用，因此需要有能够探测这些生物学过程并靶向有关细胞的工具。可选择性地与PNOM膜结合的化合物还有可能随后进入这些具有这种PNOM膜的细胞(PNOM细胞)中，因此可用作探测并将造影剂或药物靶向于正在经历破坏或死亡过程特别是由凋亡引起的破坏或死亡过程的细胞、或正在经历活化的血小板。
发明内容
在一个方面中，本发明提供能够选择性地与正在经历其质膜的正常组织的干扰的细胞(PNOM细胞)结合而与维持其质膜的正常组织的、于此处定义为“正常细胞”的细胞的结合程度较低的化合物。在本发明的一个具体实施方案中，所述PNOM细胞是正在经历死亡过程的细胞。在本发明的一个具体实施方案中，所述细胞是凋亡细胞，且在另一具体实施方案中，所述细胞可被血小板活化。本发明进一步涉及通过应用这些可选择性地与PNOM细胞结合的化合物以探测PNOM细胞的方法。在本发明的另一个具体实施方案中，所提供化合物具有如下式I-XIV所示的结构。
术语“与受干扰的膜结合的化合物”(PMBC)是指能选择性地靶向于PNOM细胞而与正常细胞结合的程度较低的化合物。根据本发明，PMBC与PNOM细胞的结合应该比其与正常细胞的结合至少高30％。
本发明中术语“选择性的靶向”是指化合物与PNOM细胞选择性的结合，即，以比与正常细胞结合至少高30％的程度与PNOM细胞结合。
术语“诊断型的与受干扰的膜结合的化合物”(诊断型PMBC)是指能够选择性地靶向PNOM细胞的化合物，其中所述化合物包含标记物(marker)或连接至标记物，而由本领域普通技术人员即可探测到所述标记物。
术语“治疗型的与受干扰的膜结合的化合物”(治疗型PMBC)是指可用于治疗疾病的包含药物的如上所定义的PMBC。
术语“固体载体”在本发明内容中是指固体基质、不溶性基质、或不溶性载体。可以如微粒、微过滤器(micro-filter)、或微毛细管(micro-capillara)的堆叠各种结构形成本发明的固体载体。
在本发明的一个具体实施方案中，所述PMBC用于制备用于选择性地靶向PNOM细胞的药物。
在一个方面中，本发明提供如式(I)结构所示的可选择性地靶向PNOM细胞的化合物(即PMBC)，或如式(I)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中每个R和R’基团各自独立地选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表氢、或C₁、C₂、C₃或C₄烷基；x和z分别独立地代表0、1或2的整数，其中x和z可相同或不同；y是0、1或2的整数，其中当y＝2时各取代基R’可相同或不同；并且D是用于诊断的标记物、氢、羟基或药物；其中所述用于诊断的标记物选自用于造影的标记物如F，其中所述F原子可为¹⁸F或¹⁹F，或放射标记的金属螯合物；所述用于造影的标记物可通过颜色、荧光、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、或放射性同位素扫描如单光子发射断层扫描(Single Photon Emission Tomography，SPECT)或正电子发射断层扫描(Positron Emission Tomography，PET)被检测。或者，D为要被靶向于所述PNOM细胞的药物。
所述药物可为可用于预防、改善或治疗特定疾病的医学上有用的物质，并且可为例如但不限于：凋亡抑制剂(胱天蛋白酶抑制剂、抗氧化剂、Bc1-2系统调节剂)；细胞死亡的活化剂(例如抗癌药物)；或血液凝固调节剂，其可为抗凝剂、抗血栓剂或溶血栓剂。在这种情况下，所述药物优选地选自抗血小板剂、肝素、低分子量肝素、糖蛋白IIb/IIIa的拮抗剂、组织纤溶酶原活化剂(tPA)、或凝血因子抑制剂如凝血酶抑制剂或Xa因子抑制剂；或抗炎药或免疫调节剂。在一个具体实施方案中，本发明提供改善抗癌治疗的方法，其通过将药物靶向于自发地或作为对治疗的反应而发生于肿瘤内的凋亡的中心而将抗癌药物靶向于肿瘤。在另一具体实施方案中，本发明提供通过将抗凝血剂靶向于血栓从而预防、减少或中止凝血的治疗血栓形成的方法。
在本发明的另一具体实施方案中，D可为固体载体。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(II)结构所示的可选择性地靶向PNOM细胞的化合物，包括如式(II)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表不存在、氢、或C₁、C₂、C₃或C₄烷基；D是氢或用于诊断的标记物。在本发明的具体实施方案中，所述用于诊断的标记物可为用于造影的标记物如F，其中所述F原子可为¹⁸F或¹⁹F，或标记的金属螯合物；所述用于造影的标记物可通过颜色、荧光、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、或放射性同位素扫描如单光子发射断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)来检测。或者，D为要被靶向于所述PNOM细胞的药物。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(III)结构所示的化合物，包括如式(III)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R³为羟基或F；R⁴为C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀直链或支链烷基，并且k为选自0、1、2、3、4和5的整数。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(IV)结构所示的化合物，包括如式(IV)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

所述化合物被命名为NST200。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(V)结构所示的化合物，包括如式(V)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中J是-F或-OH，并且r代表4、5、6、7、8、9或10的整数。在r为4且J为-F的情况下，所述化合物被命名为NST201。在r为5且J为-F的情况下，所述化合物被命名为NST-ML-10。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(VI)结构所示的化合物，包括如式(VI)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中J选自氢、-F和-OH。在J为-F的情况下，所述化合物被命名为NST204。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(VII)结构所示的化合物，包括如式(VII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、和溶剂化物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中Q选自锝、氧合锝(oxo-Technetium)、铼和氧合铼(oxo-Rhenium)，R⁴选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链烷基，并且p代表选自1、2、3、4和5的整数。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(VIII)结构所示的化合物，包括如式(VIII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、和溶剂化物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中Q选自锝、氧合锝、铼和氧合铼。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(IX)结构所示的化合物，包括如式(IX)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R⁵选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链烷基、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链氟代烷基、和C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链羟基烷基；q代表选自1、2、3、4和5的整数；以及Y为荧光标记物。在本发明的一个具体实施方案中，Y选自丹磺酰基—酰胺基团和荧光黄。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(X)结构所示的化合物，包括如式(X)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

所述化合物被命名为NST203。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(XI)结构所示的化合物，包括如式(XI)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(XII)结构所示的化合物，包括如式(XII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中F可为¹⁸F或¹⁹F。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(XIII)结构所示的化合物，包括如式(XIII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、G₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；m代表0、1、2、3或4的整数；D是用于诊断的标记物，在本发明的具体实施方案中，其可为用于造影的标记物如F，其中所述F可为¹⁸F或¹⁹F，或标记的金属螯合物；所述用于造影的标记物可通过颜色、荧光、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、或放射性同位素扫描如单光子发射断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)探测。或者，D为如上所定义的要被靶向于所述PNOM细胞的药物。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(XIV)结构所示的化合物，包括如式(XIV)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中F可为¹⁸F或¹⁹F。
在另一具体实施方案中，本发明提供用于将药物靶向于患者中的凋亡中心或血液凝固中心的药物组合物，其中所述患者可为人类或非人类的哺乳动物，其中所述药物组合物包含如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物，其中所述化合物包含药物或连接至药物。
在一个方面，本发明提供将医学上有用的化合物选择性地靶向于在细胞群体中的PNOM细胞的方法，所述方法包括：将所述细胞群体与如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物接触，从而将所述医学上有用的化合物选择性地靶向于细胞群体中的PNOM细胞。
在另一具体实施方案中，本发明提供探测细胞群体中的PNOM细胞的方法，所述方法包括：(i)将所述细胞群体与如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物或如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物以及所述盐的溶剂化物和水合物接触；以及(ii)测定与细胞结合的化合物的量，其中显著量的化合物与细胞结合提示所述细胞为PNOM细胞。
在另一具体实施方案中，本发明提供探测患者或动物中的PNOM细胞的方法，所述方法包括：(i)向所述患者或动物给药如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物或如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物以及所述盐的溶剂化物和水合物；以及(ii)对受检患者或动物造影，从而测定与细胞结合的化合物的量，其中显著量的化合物与细胞结合提示所述细胞为PNOM细胞。
在另一具体实施方案中，本发明提供用于将药物靶向于患者或动物中的凋亡中心或血液凝固中心或血液凝固中的活化的血小板的药物组合物，所述药物组合物包含如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物，其中所述化合物包含药物或连接至药物。
在另一具体实施方案中，本发明提供探测受检个体中肿瘤内的正在经历死亡过程的细胞的方法，所述方法包括：(i)向所述受检患者给药包含如式(I)结构所示的化合物或如式(I)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物、以及所述盐的溶剂化物和水合物的混合物(compound)或结合物：

其中R或R’之一为氢且R或R’中的另一个代表C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表氢、或C₁、C₂、C₃或C₄烷基；x和z分别独立地代表0、1或2的整数，其中x和z可相同或不同；y是0、1或2的整数，其中当y＝2时各取代基R’可相同或不同；并且D是用于诊断的标记物。在本发明的一个具体实施方案中，所述用于诊断的标记物可为用于造影的标记物如F，其中所述F可为¹⁸F或¹⁹F，或标记的金属螯合物；所述用于造影的标记物选自荧光标记、放射标记、x射线标记物、MRI标记物、PET扫描标记物以及能够经历酶促反应而产生可探测的颜色的标记；以及(ii)测定与受检患者的肿瘤结合的化合物的量，其中探测到显著量的化合物与肿瘤中的细胞结合提示这些肿瘤细胞正在经历死亡过程。
在另一具体实施方案中，本发明提供探测受检个体肿瘤内正在经历死亡过程的细胞的方法，所述方法包括：(i)向所述的受检个体给药如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物，其中所述化合物包含或连接至用于造影的标记物或标记的金属螯合物；以及(ii)测定与肿瘤内细胞结合的化合物的量，其中探测到显著量的化合物与肿瘤内的细胞结合提示这些肿瘤细胞正在经历死亡过程。
在另一具体实施方案中，本发明提供将抗癌药物靶向于具有凋亡细胞中心的肿瘤的方法，所述方法包括以下步骤：给药含有细胞毒性药物或连接至细胞毒性药物的如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物，从而将药物靶向于肿瘤内细胞死亡的中心。
在另一具体实施方案中，本发明提供将抗凝血剂或纤溶剂靶向于血栓的方法，其包括以下步骤：给药包含抗凝血剂或纤溶剂如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物，从而将药物靶向于血栓。
附图说明
图1所示为本发明化合物的作用机制示意图：NST-ML-作用基元(motif)。
图2(A和B)所示为氚标记的NST200与正在经历由CD95诱导的凋亡的培养Jurkat细胞的选择性结合(A)以及氚标记的NST205与正在经历由CD95诱导的凋亡的培养Jurkat细胞的选择性结合(B)。
图3(A和B)为显示NST203与正在经历凋亡的培养HeLa细胞的选择性结合的荧光显微图(图3A)。具有相同的荧光团但缺乏NST-ML作用基元的对照化合物正丁基丹磺酰基酰胺(BDA)未表现出该选择性(图3B)。
图4(A和B)为显示NST203与正在经历由小鼠体内化疗导致的细胞死亡的细胞的选择性结合的荧光显微图：(A)黑素瘤细胞的凋亡；(B)胃肠道上皮细胞的凋亡。
图5A-C所示为由氚标记的NST200探测的化疗对黑素瘤细胞死亡的作用。
图6所示为NST200在经化疗处理的患有结肠癌的小鼠中的放射自显影图。
图7为显示在化疗前后癌肿瘤与其它身体器官中吸收的比例的表格。
图8(A和B)所示为氚标记的NST200被结肠癌吸收以及化疗对其的作用(图8A)。图8B显示结肠重量的变化。
图9(A和B)为显示氚标记的NST200靶向于脑中凋亡性死亡区域(A)以及H&E染色(B)的放射自显影图分析。
图10(A和B)所示为氚标记的NST200的大鼠肾缺血再灌注的放射自显影图：(A)受损肾；(B)完好肾。
图11(A和B)所示为在放射性对比剂诱导的急性远端肾小管坏死大鼠模型中氚标记的NST205的放射自显影图：(A)受损肾；(B)完好肾。
图12所示为实验性自身免疫性脑脊髓炎的脑和脊髓中放射自显影图的³H-200造影。
具体实施方案
本发明涉及能够选择性地与正在经历其质膜的正常组织的干扰的细胞(PNOM细胞)结合而与维持其质膜的正常组织的细胞的结合程度较低的化合物。所述PNOM细胞选自正在经历死亡过程的细胞、凋亡细胞以及活化的血小板。本发明进一步涉及使用选择性地与PNOM细胞结合的化合物探测PNOM细胞的方法。
本发明的化合物的优势在于具有选择性地靶向PNOM细胞的活性，其还具有分子量相对较低以及潜在的有益的药动学性质的特征。在一个具体实施方案中，本发明提供如式(I)结构所示的可选择性地靶向于PNOM细胞的化合物(即PMBC)或如式(I)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中每个R和R’基团各自独立地选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表氢、或C₁、C₂、C₃或C₄烷基；x和z分别独立地代表0、1或2的整数，其中x和z可相同或不同；y是0、1或2的整数，其中当y＝2时各取代基R’可相同或不同；并且D是用于诊断的标记物，在本发明的一个具体实施方案中，其可为用于造影的标记物如F，其中所述F可为¹⁸F或¹⁹F，或标记的金属螯合物；所述用于造影的标记物可通过颜色、荧光、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、或放射性同位素扫描如单光子发射断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)来探测。在另一个具体实施方案中，D为要被靶向于所述PNOM细胞的药物。
所述药物可为可用于预防、改善或治疗特定疾病的医学上有用的物质，并且可为例如但不限于：凋亡抑制剂(胱天蛋白酶抑制剂、抗氧化剂、Bc1-2系统调节剂)；细胞死亡的活化剂(例如抗癌药物)；或血液凝固调节剂，其可为抗凝剂、抗血栓剂或溶血栓剂。在这种情况下，所述药物优选地选自抗血小板剂、肝素、低分子量肝素、糖蛋白IIb/IIIa的拮抗剂、组织纤溶酶原活化剂(tPA)、或凝血因子抑制剂如凝血酶抑制剂或Xa因子抑制剂；或抗炎药或免疫调节剂。在一个具体实施方案中，本发明提供将药物靶向于目标区域如肿瘤内的凋亡中心以杀死肿瘤细胞的方法。在另一具体实施方案中，本发明提供通过将抗凝血剂或纤溶剂靶向于血栓形成区域从而预防、减少或中止凝血的治疗血栓形成的方法。
在本发明的另一个具体实施方案中，D可为固体载体。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(II)结构所示的可选择性地靶向PNOM细胞的化合物，包括如式(II)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；n和m分别代表0、1、2、3或4的整数；n和m可以相同或不同；M选自不存在、氢、-O-、-S-、和-N(U)，其中U代表不存在、氢、或C₁、C₂、C₃或C₄烷基；D是氢或用于诊断的标记物，所述用于诊断的标记物选自用于造影的标记物如¹⁸F，或标记的金属螯合物；所述用于造影的标记物可通过颜色、荧光、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、或放射性同位素扫描如单光子发射断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)来探测。或者，D为如上所述的要被靶向于所述PNOM细胞的药物。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(III)结构所示的化合物，包括如式(III)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R³为羟基或F；R⁴为C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀直链或支链烷基，并且k为选自0、1、2、3、4和5的整数。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(IV)结构所示的化合物，包括如式(IV)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

所述化合物被命名为NST200。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(V)结构所示的化合物，包括如式(V)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中J是-F或-OH，并且r代表4、5、6、7、8、9或10的整数。在r为4且J为-F的情况下，所述化合物被命名为NST201。在r为5且J为-F的情况下，所述化合物被命名为NST-ML-10。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(VI)结构所示的化合物，包括如式(VI)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中J选自氢、-F和-OH。在J为-F的情况下，所述化合物被命名为NST204。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(VII)结构所示的化合物，包括如式(VII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、和溶剂化物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中Q选自锝、氧合锝、铼和氧合铼，R⁴选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链烷基，并且p代表选自1、2、3、4和5的整数。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(VIII)结构所示的化合物，包括如式(VIII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、和溶剂化物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中Q选自锝、氧合锝、铼和氧合铼。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(IX)结构所示的化合物，包括如式(IX)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R⁵选自氢、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链烷基、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链氟代烷基、和C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆直链或支链羟基烷基；q代表选自1、2、3、4和5的整数；以及Y为荧光标记物。在本发明的一个具体实施方案中，Y选自丹磺酰基—酰胺基团和荧光黄。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(X)结构所示的化合物，包括如式(X)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

所述化合物被命名为NST203。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(XI)结构所示的化合物，包括如式(XI)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(XII)结构所示的化合物，包括如式(XII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中F可为¹⁸F或¹⁹F。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(XIII)结构所示的化合物，包括如式(XIII)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

R代表氢或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆直链或支链烷基、直链或支链羟基烷基、直链或支链氟代烷基、由1个或2个环组成的芳基或杂芳基、或它们的组合；m代表0、1、2、3或4的整数；D是用于诊断的标记物，在本发明的具体实施方案中，其可为用于造影的标记物如F，其中所述F可为¹⁸F或¹⁹F，或标记的金属螯合物；所述用于造影的标记物可通过颜色、荧光、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、或放射性同位素扫描如单光子发射断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)来探测。或者，D为如上所定义的要被靶向于所述PNOM细胞的药物。
在另一具体实施方案中，本发明提供如式(XIV)结构所示的化合物，包括如式(XIV)结构所示的化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物：

其中F可为¹⁸F或¹⁹F。
在本发明的另一具体实施方案中，如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的各化合物可包含用于诊断的标记物或连接至用于诊断的标记物，所述用于诊断的标记物为例如但不限于Tc、Tc＝O、In、Cu、Ga、Xe、Tl、Re及Re＝O、¹²³I、¹³¹I、Gd(III)、Fe(III)、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Mn(II)、¹⁸F、¹⁵O、¹⁸O、¹¹C、¹³C、¹²⁴I、¹³N、⁷⁵Br、Tc-99m或In-111。
在另一方面中，本发明提供探测细胞群体中的PNOM细胞的方法，所述方法包括：(i)将所述细胞群体与如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物或如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物以及所述盐的溶剂化物和水合物接触；以及(ii)测定与细胞结合的化合物的量，其中显著量的化合物与细胞结合提示所述细胞为PNOM细胞。
根据本发明，术语“显著量的化合物与细胞结合”是指本发明的包含用于诊断的标记物或连接至用于诊断的标记物的化合物的量，其以比与正常细胞结合的量至少高30％的量与PNOM细胞结合。在另一具体实施方案中，所述量可为高50％。在另一具体实施方案中，所述量可为高75％。在另一具体实施方案中，所述量可为高150％。在另一具体实施方案中，所述量可为高约2倍。在另一具体实施方案中，所述量为高至少2倍。在另一具体实施方案中，所述量为高至少5倍。在另一具体实施方案中，所述量为高至少10倍。
在另一具体实施方案中，本发明涉及本发明的化合物在通过经由PET或SPECT进行放射性核素成像(radio-nuclide imaging)而得到正在经历死亡过程的细胞的图像中的应用，通过比较由遭受死亡过程的组织得到信号的幅度或强度与由未遭受所述过程的器官得到幅度/强度比较从而计算同PNOM细胞结合的化合物的量与同正常细胞结合的量之间的比例。
根据另一个方面，本发明提供探测患者或动物中的PNOM细胞的方法，所述方法包括：(i)向所述患者或动物给药如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物或如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的化合物的药物学可接受的盐、金属螯合物、溶剂化物和水合物以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中所述化合物包含或连接于用于造影的标记物如¹⁸F；以及(ii)对受检患者或动物造影，从而测定与细胞结合的化合物的量，其中显著量的化合物与细胞结合提示所述细胞为PNOM细胞。
本发明化合物的作用机制至少部分包括所有化合物共有的如通式XV所示且被命名为NST-ML-作用基元的模块：

其中R代表烷基。在本发明的一个具体实施方案中，R为丁基。
所述NST-ML-作用基元被设计为对应于凋亡细胞的质膜中所经历的将这些膜区别于健康细胞的膜的结构变化。膜变化的这种复合包括：
(i).搅乱膜磷脂并将磷脂酰乙醇胺(PE)和荷负电的磷酯酰丝氨酸(PS)暴露于细胞表面。PS暴露于细胞表面导致表面具有负电位，并且将质子从本体(bulk)吸引至膜界面。
(ii).膜的外小叶内氨基磷脂(PE和PS)分数的增加导致膜外小叶的界面内的质子流(界面质子流，Interfacial proton currents，IPC)的增强。该增强归因于易于参与质子转移反应如PE和PS替换外膜小叶中的磷酯酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)的官能团的数目显著增加。PE包含伯胺，而PS包含伯胺以及羧基。相比之下，PC和SM各包含携带有永久性正电荷的季铵，因此不能参与质子转移反应。
(iii).此外，凋亡的膜的特征为膜成分堆积水平的降低以及膜流体性的增大。
在对NST-ML-作用基元的作用模式的非限制性假设中，其包含在接近具有上述特征的膜即凋亡细胞的质膜时被选择性地活化的开关部分(switch moiety)(图1)。由于所述作用基元具有两个荷负电的羧酸根(烷基丙二酸盐的pKa为约5.6和2.8)，从而在生理条件下的形式电荷为-2，因此其在生理pH中可溶。然而，在接近凋亡的膜时，由于表面酸性更强，并且由于起提高羧基pKa值作用的界面环境的介电常数降低，因此质子被丙二酸根部分捕获。
质子被丙二酸根的捕获中和了负电荷之一，从而使得总电荷为-1的分子更为疏水。此外，质子的捕获进一步导致更为独特的情况，其包括以下方面：
(i).形成酸—阴离子对，其中在质子化的羧基与未质子化的羧基之间形成异常强的氢键。该氢键较强、对称且经共振及互变异构化稳定化。
(ii).这导致负电荷分布于四个羧基原子，即其部分离开原位(partiallydelocalized)。
(iii).强的酸—阴离子氢键使分子刚性化，生成大体积、刚性、扁平的六元环，携带有部分离开原位的负电荷，并且在羧基双键上包含π电子云。根据对本发明化合物作用机制的非限制性假设，这种元件(element)能够相对有利地穿透至膜界面之中。然而，其大体积、刚性的结构将其结合选择性地指向松散地堆积的膜，即凋亡的膜，而阻止了与高度堆积的膜如健康细胞的质膜的结合。这些空间特征从而提高了与凋亡膜结合的选择性。
在所述单质子化的丙二酸盐选择性地穿透入凋亡细胞的膜界面时，其遭受增强的界面质子流的影响，并在增强的界面氢键网络中整合(integrated)。丙二酸根部分获得第二个质子的可能性在这些情况下显著增加。这将进一步导致电荷的中和以及与相邻磷脂分子进一步形成酸—阴离子对。总之，这些事件都将稳定化所述分子与凋亡膜的界面的结合。
质子化的丙二酸根部分穿透入膜界面中以及其与界面的结合的稳定化允许烷基链R穿过膜界面并到达其最佳结合环境，即膜的烃核，于此其将通过疏水性相互作用进一步促进化合物结合(compound binding)的自由能增加。
通过与用于造影的标记物或治疗药物(通式I的部分D)经由烃连接基[式I或2的(CH₂)_m]结合，NST-ML-作用基元被用于有用的诊断或治疗目的。根据该方法的NST-ML-作用基元起靶向部分的作用，使得所述用于造影的标记物或连接于其上的所述药物选择性地靶向于遭受细胞死亡、特别是凋亡的细胞和组织，或遭受血小板活化和血栓形成的组织。
图1所示为NST200(式IV)，并且描述了其在生理条件下接近并与PNOM膜结合的三个阶段：
A：所述化合物在水溶液中，从而两个羧基均去质子化即荷负电，并且所述化合物为高度水溶性。
B：在接近所述荷负电的凋亡膜时，所述化合物获得质子。阴离子-酸二聚体得以形成，从而生成稳定的、经共振稳定化的六元环，该环透入膜界面。由于所述大体积、刚性环结构的空间特征有利于与凋亡细胞的更松散地堆积的质膜而不是健康细胞的紧密堆积的质膜的结合，因此该结构有益于选择性。
C：在所述化合物透入至所述膜界面中时，其遭受界面氢键网络以及存在于凋亡膜的界面的增大的界面质子流的影响。所导致的质子化以及氢键结合进一步起稳定化所述化合物与界面结合的作用(箭号)。这种穿透进一步允许烷基链到达其在膜中的最佳位置，从而通过与膜的烃核形成疏水性相互作用而进一步对结合能作出贡献。
本发明的化合物可用于以本发明的三种不同的途径将医药学上有用的物质选择性地靶向于包含PNOM细胞的组织和器官：
(i).根据下文称作“探测途径”的第一种途径，所述选择性的结合可用于将用于造影的标记物靶向于PNOM细胞。如下文将解释的，这可在体内、体外或离体的临床实践中用于其中出现这种细胞的疾病的诊断。
(ii).根据下文称作“治疗途径”的第二种途径，选择性结合的性质用于将治疗药物选择性地靶向于其中出现PNOM细胞的身体器官和组织，例如细胞死亡、血栓形成或炎症区域。
(iii).根据下文称作“清除途径”的第三种途径，通过将本发明的化合物连接至固体载体，所述化合物与PNOM细胞的选择性结合被用于自体液如血液中清除由于其促凝血性质而潜在地有害的PNOM细胞。
根据所述探测途径，本发明涉及用于体内、体外或离体探测PNOM细胞的包含含有或连接于用于造影的标记物的PMBC作为有效成分的组合物。这种PMBC在下文中被称作“诊断型PMBC”。所述诊断型PMBC能够与待测样品中存在的PNOM细胞选择性地结合。随后，所述结合可被本领域公知的手段鉴别。本发明的诊断型PMBC使得通过PMBC将标记物以选择性的方式靶向于PNOM细胞成为可能。随后，根据所用的特定标记，可以本领域公知的方式例如荧光、放射性发射(radioactiveemission)或生成颜色、MRI、x射线等探测所述可探测的标记。在一个具体实施方案中，所述诊断型PMBC通过共价或非共价(例如静电)结合连接至所述可探测的标记。
在一个具体实施方案中，所述可探测的标记可为金属离子Tc、氧合Tc、In、Cu、Ga、Xe、Tl、和Re、氧合Re、以及共价地连接的原子各自的放射性同位素；用于放射性同位素扫描如SPECT的¹²³I和¹³¹I；用于MRI的Gd(III)、Fe(III)或Mn(II)；以及用于正电子发射断层扫描(PET)的¹⁸F、¹⁵O、¹⁸O、¹¹C、¹³C、¹²⁴I、¹³N和⁷⁵Br。
在一个具体实施方案中，本发明的PMBC旨在通过PET扫描提供凋亡的临床成像，所述PMBC包括¹⁸F原子。
由于某些用作造影标记物的放射性同位素如¹⁸F的半衰期短，可在即将马上向患者给药所述诊断化合物之前连接这种用于临床PET成像的标记物。因此，合成一种PMBC-PET前体可以是有益的，其包括将在向患者给药之前被放射性同位素如¹⁸F取代的部分。在一个具体实施方案中，所述将被¹⁸F取代的部分选自羟基、硝基、或卤素原子如溴或氯。这种PMBC-前体PMBC-PET前体同样包括在本发明范围之内。
所述采用用于PET成像的¹⁸F标记可为上述结构的任意PMBC的PMBC的方法包括将¹⁸F原子连接至PMBC从而用用于PET成像的¹⁸F放射性标记所述PMBC的步骤。任选地，在所述的连接¹⁸F原子的步骤之前，可由适宜的保护基团将所述PMBC的官能团加以保护。然后所述保护基团在所述连接¹⁸F原子的步骤之后被任选地除去。
在所述标记物为金属原子(例如分别用于MRI或SPECT的Gd、^99mTc或氧合^99mTc)的情况下，所述PMBC包括金属螯合剂。所述螯合剂的金属配位原子可为氮、硫或氧原子。在本发明的一个具体实施方案中，所述螯合剂为二氨基二硫醇、单氨基-单酰胺-双硫醇(MAMA)、三酰胺-单硫醇、以及单氨基-二酰胺-单硫醇。在这种情况下，在与金属原子络合之前为连接至螯合剂或者包含螯合剂的PMBC的PMBC-螯合剂前体以及包括所述金属原子的络合物均包括在本发明的范围之内。
对于荧光探测而言，所述诊断型PMBC可包括选自本领域已知的任意的荧光探针的荧光基团。这种探针的实例为5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰胺(丹磺酰基-酰胺)、以及荧光黄。
本发明的化合物可用于探测并诊断各种不同的以PNOM细胞的生成为特征的医学状况。以PNOM细胞为特征的临床状况的实例如下：
以过度凋亡的发生为特征的疾病，如退行性疾病(degenerativedisorder)、神经退行性疾病(例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病)、AIDS、ALS、朊病毒疾病、骨髓增生异常综合征、缺血性或中毒性损伤、移植排斥过程中的移植细胞损失、肿瘤、以及特别是高度恶性/侵蚀性肿瘤不仅以过度的组织增殖为特征还具有凋亡增强的特征。
本发明实施例3以及图2例证了本发明化合物在探测正在经历死亡过程的脑细胞中的性能。所述细胞死亡的诱因为局部缺血/再灌注。与对侧未受损的半球相比，受损的脑半球表现出明显的高水平的氚标记的NST200吸收。
表现为过度的血液凝结的疾病，其中PNOM存在于血小板活化过程中和/或其他细胞(如内皮细胞)的活化或损伤过程中。这些疾病包括动脉或者静脉血栓形成、血栓栓塞、例如心肌梗塞、脑卒中、肾静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血(DIC)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、镰状细胞病、地中海贫血、抗磷脂抗体综合征、系统性红斑狼疮。
炎症性疾病和/或与免疫介导的病因或者发病机制有关的疾病，自身免疫性疾病如抗磷脂抗体综合征、系统性红斑狼疮、结缔组织疾病如类风湿性关节炎、硬皮病；甲状腺炎；皮肤病如天疱疮或结节性红斑；自身免疫性血液病；自身免疫性神经病如重症肌无力；多发性硬化；炎症性肠疾病如溃疡性结肠炎；血管炎。
动脉粥样硬化斑块，以及特别是不稳定、脆弱以及易于破碎的斑块同样以PNOM细胞为特征，如凋亡的巨噬细胞、凋亡的平滑肌细胞、凋亡的内皮细胞、以及活化的血小板。这种活化的血小板存在于血栓症中，通常与不稳定的动脉粥样硬化斑块有关。
所述探测可在已知患有相应的疾病的患者中实施，以评价疾病的严重性以及监控疾病进程和/或对各种治疗形式的反应。这种监控的非限制性的实例为对抗癌治疗的反应的评价。由于多数抗癌治疗如化疗或者放疗均通过诱导凋亡发挥作用，因此通过诊断型PMBC探测由治疗诱导的肿瘤细胞的凋亡可提供肿瘤对所述抗肿瘤药物的敏感程度的信息。这可显著地缩短在给药抗癌治疗与对其效力正确评价之间的延迟期。
此外，所述探测还可用于监控抗癌治疗的副作用。大部分的这种副作用是由于不当的治疗导致正常但是敏感的细胞如胃肠道上皮细胞或者骨髓造血系统细胞的凋亡。
并且，所述探测可用于表征通常与肿瘤侵蚀性水平有关的肿瘤内的内在凋亡负荷(intrinsic apoptotic load)；通过探测经常发生于转移瘤中的内在凋亡还可能有助于探测转移瘤。
类似地，由于凋亡在移植排斥过程中的细胞损失中起主要作用，因此本发明所述诊断型PMBC可用于监控在器官移植后的移植存活(graftsurvival)。
此外，所述探测可用于监控对细胞保护性治疗的反应，并因此通过使估测细胞死亡成为可能而有助于筛选和开发能够在(例如如上所述的)各种疾病中抑制细胞损失的药物。
动脉粥样硬化斑块的去稳定化使得它们脆弱、易于破碎、生成血栓并生成栓塞，由于其特征为若干种PNOM细胞包括凋亡细胞(凋亡的巨噬细胞、平滑肌细胞以及内皮细胞)以及活化的血小板的参与，因此所述探测还可用于探测动脉粥样硬化斑块。
根据该方法，本发明涉及一种探测选自全身、器官、组织、组织培养物或任意的其他细胞种群中的细胞种群中的PNOM细胞的方法，所述方法包括：(i)将所述细胞种群与根据本发明任意具体实施方式的诊断型PMBC相接触；(ii)测定与细胞种群结合的PMBC的量，其中显著量的化合物与种群内的细胞结合提示所述细胞为PNOM细胞。
实施例部分显示了氚标记的NST 200、NST 203以及NST 205与凋亡细胞以比对照非凋亡细胞更多的量结合的能力，证明了本发明的化合物在选择性的结合以及探测凋亡细胞中的性质。
在另一个具体实施方式中，本发明进一步涉及一种在患者或动物体内探测PNOM细胞的方法，所述方法包括：(i)向接受检查的患者或动物给药诊断型PMBC；所述给药以本领域公知的任意方法进行如非胃肠道给药(如静脉内给药)或口服给药；以及(ii)通过本领域公知的方法(例如PET扫描、SPECT、MRI)对接受检查的患者或者动物造影，以探测并测定与细胞结合的诊断型PMBC的量，其中显著量的化合物与细胞结合提示所述细胞为PNOM细胞。
在本发明的另一个具体实施方式中，本发明涉及一种用于体外或离体探测组织或者细胞培养物样品中的PNOM细胞的方法，所述方法包括：(i)在使得所述诊断型PMBC能够结合至PNOM细胞的生物膜的条件下将所述样品与诊断型PMBC接触，其中所述诊断型PMBC可为本发明所述的任意PMBC化合物；以及(ii)探测与细胞结合的诊断型PMBC的量，存在显著量的结合的诊断型化合物提示所述组织或者细胞培养物中存在PNOM细胞。
体外或离体试验中的探测步骤例如可为，在荧光标记的本发明化合物的情况下，不限于通过应用流式细胞仪分析，其允许在普遍可商购的仪器上实现细胞可视化。在使用荧光可视化细胞的实施例中，单束15mW的氩离子激光束(488nm)用于激发FITC荧光，且使用530nm带通滤光器采集荧光数据制成柱状图。例如可使用Lysis II软件或者其他软件计算荧光细胞的百分比。所述探测方法可用于本发明用于筛选治疗药物如抗癌药物的具体实施方式中。
根据本发明，术语“显著量”是指与PNOM细胞结合的PMBC的量比与非PNOM细胞结合的量至少高30％。实际的量可随所采用的成像方法以及设备、以及随接受检查的器官或者组织而变化。在另一个具体实施方式中，与PNOM细胞结合的PMBC的量比与非PNOM细胞结合的量至少高50％。在另一个具体实施方式中，与PNOM细胞结合的PMBC的量比与非PNOM细胞结合的量至少高75％。在另一个具体实施方式中，与PNOM细胞结合的PMBC的量是与非PNOM细胞结合的量的至少2倍。在另一个具体实施方式中，与PNOM细胞结合的PMBC的量是与非PNOM细胞结合的量的至少4倍。在另一个具体实施方式中，与PNOM细胞结合的PMBC的量是与非PNOM细胞结合的量的至少6倍。在另一个具体实施方式中，与PNOM细胞结合的PMBC的量是与非PNOM细胞结合的量的至少8倍。在另一个具体实施方式中，与PNOM细胞结合的PMBC的量是与非PNOM细胞结合的量的至少10倍。
所述结合作用尤其取决于用于测定结合差异的方法。本发明的方法可用于诊断以PNOM细胞的出现为特征的疾病，例如但不限于如上所述的任意疾病。
本发明的方法还可用于监控如上所述用于治疗疾病或者医学状况或者用于基础科学研究目的的各种治疗形式的作用。
根据本发明的称作“治疗途径”的第二种途径，本发明涉及用于将活性药物或者前药靶向PNOM细胞的包含PMBC的药物组合物。本发明的治疗型PMBC是指包含药物的PMBC或者与可用于医疗用途的物质相结合的PMBC。术语“结合物”是指两个分子通过本领域公知的方法连接到一起。
所述可用于医疗用途的药物与其中包含于所述治疗型PMBC或者连接至所述治疗型PMBC的PMBC之间的结合可通过共价结合、非共价结合(例如静电力)或者通过形成包含药物并在其表面具有将复合物靶向于PNOM细胞的PMBC的载体颗粒(如脂质体)。一旦药物到达靶标，当其仍为所述PMBC结合物的一部分时、在(例如通过天然酶的断裂、破坏等作用)自所述PMBC单位脱离后、通过在其膜上具有PMBC的含药脂质体的吞噬作用、或者通过任意其他的已知机制，所述药物应当能够发挥其生理活性。
应当根据所述组合物即将用于的特定疾病选择所述药物。
本发明的所述药物组合物以及所述诊断型组合物可通过任意已知的途径给药，尤其是口服给药、静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、皮下给药、舌下给药、眼内给药、鼻内给药或局部给药、或者脑内给药。所述载体可根据所需的给药模式选择，并且包括任意的已知成分，例如溶剂、乳化剂、赋形剂、滑石、矫味剂、着色剂等。若需要，所述药物组合物还可包括用于治疗疾病、消除副作用或增强活性成分的活性的其他药物学活性化合物。
根据这方面，本发明进一步涉及一种治疗表现出PNOM细胞的疾病的方法，其包括向需要这种治疗的个体给药有效量的治疗型PMBC，所述治疗型PMBC包含具有治疗所述疾病的活性的药物或者将在靶区域被转化为活性药物的前药。所述治疗型PMBC允许将药物选择性地靶向于包含PNOM细胞的组织，从而增加其局部浓度，并潜在地提高其在靶部位的治疗效果。这种医疗疾病为如上所述的疾病。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种杀死肿瘤内癌细胞的方法，其包括通过给药治疗型PMBC而靶向肿瘤内的凋亡细胞从而杀死癌细胞的步骤，其中所述治疗型PMBC包含如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的各化合物以及细胞毒性药物。在一个具体实施方式中，所述杀死肿瘤细胞的方法包括一种“自催化机制”(autocatalytic mechanism)，其中由于细胞毒性药物的细胞毒性作用使肿瘤内的凋亡细胞负荷增加，从而为所述治疗型PMBC的下一剂量的靶向创造出更多的位点，因此靶向于肿瘤的细胞毒性药物的量随连续的剂量而增加。这种策略可提高抗癌治疗的效力并增加根除肿瘤的机会。
术语治疗型PMBC的“有效(的)量”是指能够将所述疾病的至少一种表现减少至可测量水平的量，该量应当根据所使用的药物、给药方式、患者的年龄和体重、疾病的严重程度等加以选择。
在另一具体实施方式中，本发明的治疗型PMBC包括或者被连接至具有治疗作用的放射性同位素。这种放射性同位素的非限制性实例为钇90、碘131、铼188、钬166、铟111、镥(Leutitium)177、或可用于治疗目的的其他发出辐射的放射性同位素。
在另一具体实施方式中，本发明提供一种通过给药治疗型PMBC从而将所述治疗药物靶向于血液凝块中的活化的血小板并减少/预防血栓生成的减少/预防血液凝结的方法，所述治疗型PMBC包含被连接至抗凝血剂或纤溶剂的如式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV结构所示的任一化合物。
该方法还可用于治疗或者预防表现为过度血液凝结的疾病的方法，其中PNOM发生于血小板活化、和/或其他细胞(例如内皮细胞)的活化或者损伤过程中。这些疾病尤其包括心肌梗塞、脑卒中、深静脉血栓、弥漫性血管内凝血(DIC)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、镰状细胞病、地中海贫血、抗磷脂抗体综合症、系统性红斑狼疮。
根据本发明称作“清除途径”的第三种途径，本发明的PMBC特异性地与PNOM细胞结合的性质被用于将所述细胞自体液中清除。在本发明的一个具体实施方式中，所述体液是血液或者血液产品。
许多需要体外循环的外科手术或者药物干涉与将血液成分暴露于外源性人造环境有关。这常常导致血细胞的活化及损伤、系统性炎症、以及血栓栓塞现象，在微栓子存在于脑血管中时可能具有严重的临床后果如神经功能紊乱。因此探测并自血液中清除所述受损的、活化的或者凋亡的细胞是有利的。
因此，根据其一方面，本发明涉及一种固定于固体载体的PMBC。该固定可通过直接连接、或者通过共价或者非共价连接、或者通过间隔基连接。所述固定的PMBC用于将PNOM细胞自体液中清除。
根据本发明的另一个具体实施方式，所述固体载体的特征为具有连接有PMBC的多个珠粒。优选地，所述珠粒为由树脂包覆的珠粒。或者所述珠粒可为磁性珠粒。
在所述固体载体包括体液沿着和/或通过其流动的许多纤维或者微毛细管的情况下，其内表面和/或外表面包覆有所述PMBC。
所述固定于固体载体的化合物构成过滤装置的一部分。因此，根据所述清除途径，本发明进一步涉及一种过滤装置，其包括含有所述固定于固体载体上的PMBC的框架(housing)以及液体入口及液体出口。如血液或者血液产品的体液通过入口进入所述框架，与包含于所述框架中的经固定的PMBC接触并与其连接。从而，自所述体液中清除了具有干扰的膜的循环着的细胞如受损或者将死的细胞，或者清除了更大的结构如具有PNOM膜的栓塞物。因此，自出口出来的液体的PNOM细胞含量降低或者基本不含有PNOM细胞。
所述过滤装置可构成体外循环设备的可置换的、永久的、或者附加的部分。因此，本发明还涉及一种包含所述过滤装置的体外循环设备，其中通过所述设备循环的血液也通过所述装置。
这种设备的实例为心肺旁路设备(cardiopulmonary bypassapparatus)、血液透析设备、血浆去除设备(plasmapheresis apparatus)以及输血设备如现有技术中的输血袋。
实施例
为了理解本发明并了解其如何实际实施，记载了以下实施例：本发明化合物合成的实施例、本发明化合物在与正在经历细胞死亡过程的细胞选择性地结合的性能的实施例。为了探测本发明化合物，将他们用氚放射性标记，并通过测定受损区域的吸收或者通过放射自显影方法探测。在某些实施例中，通过将其连接至荧光标记物即丹磺酰基团标记所述化合物，并通过荧光显微术探测。在体外于组织培养物中以及在体内于其中细胞死亡是由大脑中动脉的闭塞导致的脑卒中的鼠模型中、在肾缺血性和中毒性损伤的鼠模型中、在黑素瘤鼠模型中、在结肠癌鼠模型中以及在与多发性硬化有关的鼠模型试验自身免疫脑脊髓炎(EAE)中证实了所述化合物与凋亡细胞结合的选择性。
实施例1：
NST-ML-F-4(2-丁基-2(3-氟代丙基)-丙二酸)的合成(路线1)
用1eq二甲基甲酰胺中的NaH将丙二酸二叔丁酯(5mL)去质子化，在氢释放(hydrogen evolution)停止后加入1eq正丁基碘。将反应混合物加热到50℃，持续14小时。应用柱色谱以95％的收率得到5.8克丁基丙二酸二叔丁酯(2)。用NaOCH₃(0.05eq，cat.)以及甲苯中的丙烯醛(1.1eq)处理2(3.8g)得到1.26g醛(3)，收率为30％。然后将化合物3与乙醚/水(8∶1v/v)混合物中的NaBH₄(1.05eq)反应2小时。在精制(work-up)以及快速色谱后，得到纯的醇4(93％)。用1.1eq甲磺酰氯(MsCl)以及2.2eq三乙胺(Et₃N)处理所得到的产品，得到甲磺酸酯化合物5，收率97％。该产品基本纯净，并且未经进一步纯化而直接用于下一反应。
在氮气流下将2mL乙腈中的KF(5eq)、kryptofix(5eq)以及K₂CO₃(2.5eq)的混合物气提至干燥4次。然后加入2mL乙腈中的甲磺酸酯化合物5(167mg)。在120℃的沙浴中搅拌反应10分钟。在精制时，粗产物的¹H-NMR显示为所需的化合物6与kryptofix的混合物。采用(474mg)以及三氟乙酸(TFA)(17mL)在10℃下使二叔丁酯6去质子化30分钟，然后蒸发至干燥。将残余物质自氯仿中蒸发2次，并在真空管道中干燥得到NST-ML-F-4白色固体(312mg，99％)。所述化合物的NMR数据为：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ4.41(dt，J_t＝5.9Hz，J_d＝47.4Hz，2H)，1.97-1.91(m，2H)，1.89-1.83(m，2H)，1.69-1.60(m，1H)，1.58-1.52(m，1H)，1.33(p，J＝6.9Hz，2H)，1.25-1.14(m，2H)，0.92(t，J＝7.2Hz，3H)；¹³CNMR(75MHz，CD₃OD)δ175.8，86.2，84.1，58.6，34.1，30.1，30.0，27.9，27.3，27.0，24.5，14.6；¹⁹F NMR(282 MHz，CD₃OD)δ-220.9；MS(EI)m/z219(M-H)。
路线1：

实施例2：NST-ML-F：2-甲基-2(3-氟代丙基)-丙二酸的合成(路线2)
用1.5eq的3，4-二氢-2H-比喃以及135mL的CH₂Cl₂中的对甲苯磺酸吡啶(PPTS)处理3g的4-溴-1-丁醇(1)。在精制和提纯后，得到1.45g(33％)的产物2。用1eq的NaH使1.0eq的二乙基甲基丙二酸酯去质子化，并在50℃下一同加入催化量的KI。10小时后观察到转化完全，并得到90％的收率。在55℃下采用PPTS使四氢吡喃去保护顺利进行。在精制后，得到定量收率的醇4，并直接用于甲磺酰化反应(如上所述)。利用手头的甲磺酸酯5如上所述与kryptofix进行反应。以68％的收率得到化合物6。在50℃用2N NaOH/EtOH(30mL/5mL)处理化合物6(233mg)得到NST-ML-F，收率约为99％(190mg)。
所述化合物的NMR数据为：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ11.89(bs，2H)，4.46(dt，J_t＝5.9Hz，J_d＝47.2Hz，2H)，1.99-1.92(m，2H)，1.82-1.64(m，2H)，1.50(s，3H)，1.50-1.40(m，2H)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ178.6，85.1，82.9，54.2，35.5，31.0，30.8，20.8，20.7，20.2；¹⁹F NMR(282MHz，CDCl₃)δ-219.0；MS(EI)。
路线2：

实施例3：
氚标记的NST 200以及NST 205与正在经历由CD95诱导的凋亡的培养的Jurkat细胞的选择性结合
试验步骤：
使培养的Jurkat细胞(人类成年T细胞白血病细胞)于补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1mM HEPES以及抗生素(100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、以及12.5单位/ml制霉菌素)的RPMI培养基(Beit-Haemek，Israel)中的混悬物内生长。然后通过用CD95(0.1μg/10⁷细胞/ml)处理触发凋亡。结果，显著百分比的细胞凋亡。未处理的细胞作为对照。然后在室温下将对照细胞以及凋亡细胞均温育40分钟，然后在冰上与(2μCi/10⁷细胞/0.5ml)氚标记的NST200以及NST205温育30分钟。
将细胞洗涤2次后，向小球中加入1ml的SOLVABLE^TM试剂(GNE9100，Packard Biosciences)。于60℃下温育一小时后，将萃取物转移至玻璃闪烁瓶中并向各瓶中加入10ml闪烁液(Ultima gold 6013329，Packard Biosciences)。在冷却至室温并适应黑暗1小时后对放射性计数。计算放射性值并表示为总共加入的放射性标记的NST200以及NST205的百分比。
试验结果：
由图2A中清晰可见，与非凋亡细胞相比，凋亡细胞显示出显著更高的NST200吸收(8倍以上)。该试验证明，NST200能够与凋亡细胞选择性地结合并可用作探测其的标记物。相似地，如图2B所示，与非凋亡细胞相比，凋亡细胞显示出更高的NST205吸收，而该作用在加入胱天蛋白酶抑制剂ZVAD(氟代甲基酮肽(V-缬氨酸、A-丙氨酸、D-天冬氨酸)胱天蛋白酶抑制剂)后完全逆转。
实施例4：NST203与正在经历凋亡的培养的HeLa细胞的选择性结合
使HeLaS3细胞(ATCC CCL-2.2)在补充有2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、12.5单位/ml制霉菌素以及10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)中生长。在10cm³的培养皿中将细胞以5×10⁶细胞/皿的密度播种10ml体积，并通过不更换生长培养基而温育培养物96小时使其老化(age)。结果，显著百分比的细胞凋亡。使用细胞刮棒收获细胞，由使其通过具有18G针头的注射器而分离为单独的细胞，并以10⁶细胞/ml的密度重新混悬于pH＝7.4的PBS缓冲液中。如前所示，NST203包含能够使单个细胞的荧光可视化的丹磺酰基酰胺基团。图3A中所示为NST203与凋亡细胞的选择性结合，其证明NST203被吸收入凋亡细胞种群之中(绿色、颜色鲜艳的(glowing color)细胞，分别以箭号标记)，而在非凋亡细胞中观察到非荧光(蓝色、颜色不鲜艳的细胞，以箭头标记)。
相比之下，具有相同荧光团但不具备所述NST-ML作用基元的对照化合物正丁及丹磺酰基酰胺(BDA)未表现出这种选择性，从而证实了所述NST-ML作用基元在与凋亡细胞的选择性结合中的活性。因此，NST203可用作与凋亡细胞选择性地结合的标记物。
实施例5：
NST203在小鼠体内与正在经历由化疗诱导的死亡过程的黑素瘤细胞的选择性结合
试验步骤：
向小鼠(c57/黑；8周龄雄性小鼠)侧腹双侧皮下注射源自鼠黑素瘤的B16-F10细胞(ATCC CRL-6475；10⁵细胞/小鼠，体积100μl)。在注射之前将细胞系在补充有4mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、12.5单位/ml制霉菌素以及10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)中的培养物内维持。10天后，当肿瘤直径达到5-7mm的尺寸时，对小鼠进行化疗(紫杉醇(Taxol)20mg/Kg以及环磷酰胺(Cyclophosphomide)300mg/Kg，腹膜内注射200μl体积)。24小时后，静脉内注射tris碱缓冲剂内10％发色团中的NST-203，剂量为2.8mg/小鼠。两小时后，牺牲小鼠并收获肿瘤以及其他器官，并立即于液氮中冷冻。通过对各种组织冷冻切片的荧光显微术评价肿瘤以及其他器官对NST-203的吸收。
试验结果：
图4A所示为对肿瘤的荧光显微术。可以观察到NST203大量与许多经历凋亡的肿瘤细胞结合。还证实了所述化合物的细胞内累积(图片右侧)以及选择性的高水平，其反映在大量吸收入凋亡细胞中，而周围的存活细胞却保持未被染色(图片的左上侧)。
化疗不仅在肿瘤靶组织导致细胞死亡，还在非靶组织如胃肠道的上皮诱发细胞死亡。图4B所示为NST203选择性地探测这些经历凋亡的细胞的能力(见箭号)。与肿瘤中的发现相似，在胃肠道中的存活细胞未表现出对NST203的吸收，因此保持黑暗。
因此，这些结果显示本发明的化合物NST203具有在体内特异性地靶向凋亡细胞的能力，其中所述死亡过程是由化疗导致。所述凋亡细胞是以通用的方式得以探测，与所涉及的组织无关。相比之下，所述组织的存活细胞并不表现出这种结合。
实施例6：
利用³H-NST200通过放射自显影对小鼠结肠癌模型对化疗的反应成像
试验步骤：
在Balb/c雄性小鼠的腹部建立结肠癌模型。在第12-14天当肿瘤大小为直径6-8mm时，在通过静脉内注射两剂量的多柔比星(20mg/kg，间隔72小时)对结肠癌肿瘤处理后测定吸收入肿瘤中的NST200。化疗后48小时，向对照未处理动物以及化疗处理的动物均静脉内注射放射标记的NST200(80μCi/动物)。4小时后，牺牲动物。制备10μm的冷冻切片，风干并暴露于氚敏感型胶片。使胶片暴露7周的时间，显影并通过测量光密度进行分析。通过TINA软件估算从而测定缺血核对对侧半球的信号中光密度/mm²形式的³H-DDC密度。按照微量放射自显影标准转化信号并以nCi/mg单位表示。
试验结果：
未处理的肿瘤表现出未吸收NST200，因此，不能通过放射自显影探测到图像(图5A)。然而，在通过化疗诱导细胞死亡时，NST200的吸收显著增加，提示具有大量经放射诱导的细胞死亡过程(图5B和C)。可在肿瘤表面多个焦点处探测到强烈的暗斑形式的NST200吸收。NST-200标记局部化至肿瘤内凋亡区域的特定焦点而不扩散至整个肿瘤。经处理的肿瘤的其他区域未被标记，提示为活肿瘤组织。该结果强调了NST200作为大量在濒死细胞而并非活细胞内选择性地累积的靶向分子的有益之处(图5B)。图5C中显示了甚至相同的肿瘤内对治疗的反应的不一致性(heterogeneous nature)：NST200的吸收特别地在显示出更多的细胞死亡的肿瘤的一片大的区域内累积，而并不在未对化疗做出反应的其他肿瘤区域内累积。
实施例7：
结肠癌模型对³H-NST200的吸收：化疗的作用
试验步骤：
将结肠癌模型鼠结肠癌细胞(CT-26)(ATCC CRL-2638)维持于RPMI(Gibco，UK)、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、12.5单位/ml制霉菌素以及10％加热的未活化的(inactivation)胎牛血清(FCS)。在8-10周龄的成年雄性Balb/C小鼠中进行试验(体重20-25克)。
肿瘤的接种：
将细胞胰蛋白酶化，用HBS(140mM NaCl、0.5M Hepes、PH7.4)洗涤两次，然后离心(5分钟、1000rpm、4℃)并浓缩至在甲基纤维素和盐水(1∶3)的混合物(2％)中2×10⁶细胞/毫升。将小鼠麻醉时，将体积为0.2ml的上述溶液(含有4×10⁵细胞/剂量)皮下注射如小鼠腹部两侧。麻醉储备液是由0.85ml的氯胺酮(100mg/ml)+0.15ml Xilazine(2％)以1∶10稀释制备。每10克体重注射(i.p.)0.1ml稀释的溶液。
肿瘤追踪：
每日检查小鼠的可触知肿瘤形成。肿瘤注射7-10天后，可见到小肿瘤。
结肠癌肿瘤对³H-NST200的吸收的评价
在通过静脉内注射两剂量的多柔比星(20mg/kg，间隔72小时)对结肠癌肿瘤处理后测定吸收入肿瘤中的³H-NST200。在第二次剂量48小时后，向小鼠静脉内注射³H-NST200(10μCi/动物)。4小时后，收集肿瘤，称重并加工组织：在60℃下，在20ml闪烁玻璃瓶中以每150mg肿瘤组织1ml试剂的比例用SOLVABLE试剂(GNE9100，PackardBioscience)溶解肿瘤。在2-4小时后，将1ml各组织萃取物转移至玻璃闪烁瓶中。为了减少颜色猝灭(color quenching)问题，用0.4ml的30％H2O2在0.066M EDTA的存在下处理样品。于室温下温育15分钟时间后，在60℃下温育萃取物1小时，然后于室温下温育15分钟。将十(10)ml闪烁液(Ultima gold，6013329，Packard Bioscience)加入各瓶中。在室温下将各瓶温育1小时，然后在β-计数仪中分析(TRI-CARB 2100TR，液体闪烁分析仪，Packard Bioscience)。一式三份测定所有样品。计算各样品的注射的剂量的百分比值(％ID/g组织)。
试验结果：
对³H-NST200在经多柔比星处理的结肠癌肿瘤中的累积对在未处理的对照肿瘤中的累积的定量分析揭示，在处理后48小时时³H-NST200大量累积。尽管在对照组中，所有的肿瘤累积了相似的少量的³H-NST200，但在化疗处理的肿瘤中所述累积值不定，某些肿瘤显示出比对照组高40-50倍的吸收增长。处理组的吸收平均值为1.28％ID/gr，比对照组的平均值高12.1倍(见图6)。³H-NST200累积值的宽谱表明不同的肿瘤各自对抗癌治疗的反应。上述试验清楚地表明³H-NST200可用于探测肿瘤并用于探测细胞毒性剂对肿瘤细胞的作用。
实施例8：
³H-NST200在带有结肠癌肿瘤的小鼠中的生物分布
试验步骤：
如前述实施例所述，在Balb/c雄性小鼠的腹部建立结肠癌模型，并向以多柔比星处理的动物注射³H-NST200(10μCi)。四小时后，牺牲动物，收集并处理各器官/组织以测定³H-NST200于其中的累积。如所附图7所示，在各器官中的累积表示为注射剂量(ID)的百分比，并计算肿瘤中的吸收与其他器官中吸收的比例。
试验结果：
由多柔比星对肿瘤组织造成的损伤的确超过对其他非靶向器官包括心脏和小肠造成的损伤。肿瘤中的吸收对表中所有器官的吸收的比例为＞1，表明肿瘤中增加的凋亡以及³H-NST200在靶向组织相对于非靶向组织中的选择性累积。
实施例9
在肿瘤尺寸减小之前，³H-NST200可探测由BiCNU处理的肿瘤中发生的细胞死亡
试验步骤：
如实施例No.10所述在Balb/c雄性小鼠腹部建立结肠癌模型。在第12-14天，当肿瘤大小为直径6-8mm时，向小鼠静脉内注射多柔比星。总共给予2剂量的多柔比星，间隔3天(每剂量为20mg/Kg)。在第二次注射多柔比星2天后，静脉内注射于体积为0.2ml盐水中的10μCi³H-NST200。注射³H-NST200四小时后，通过过量剂量的三甲基乙烯牺牲小鼠。将肿瘤收集于微量离心管中，称重并于-20℃冷冻。在60℃下，在20ml闪烁玻璃瓶中以每150mg肿瘤组织1ml试剂的比例用SOLVABLE^TM试剂(GNE9100，Packard Bioscience)溶解肿瘤。在2-4小时后，将1ml各组织萃取物转移至玻璃闪烁瓶中。为了减少颜色猝灭问题，用0.4ml的30％H₂O₂在0.066M EDTA的存在下处理样品。于室温下温育15分钟后，在60℃下温育萃取物1小时，然后于室温下温育15分钟。将十(10)ml闪烁液(Ultima gold，6013329，Packard Bioscience)加入各瓶中。在室温下将各瓶温育1小时，然后在β-计数仪中分析(TRI-CARB 2100TR，液体闪烁分析仪，Packard Bioscience)。计算各样品的注射的剂量的百分比值(％ID/g组织)。在NST200吸收与肿瘤体积之间进行对比。在各剂量后，NST200的吸收值与肿瘤体积相关，其通过式(假定为球形肿瘤)V＝πD³/6，其中D为平均肿瘤直径。
试验结果：
在用多柔比星处理过程中(最后5天)，肿瘤质量并未减少(见图8A)。相反，肿瘤继续生长，与在经处理的肿瘤5天之间收集的对照未处理的肿瘤相比，表现出50％的体积增大。该增大经发现为非显著性的。尽管在2剂量的多柔比星处理后肿瘤体积发生该非显著性的变化，但探测到³H-NST200吸收急剧增加18.5倍，表明³H-NST200是甚至在不能探测到肿瘤体积减小的情况下亦可感知到肿瘤内细胞死亡的灵敏工具(见图8B)。
实施例10
通过放射自显影方法应用氚标记的NST200探测小鼠大脑中动脉闭塞后的凋亡损伤
试验步骤：
通过颞下途径在Balb/C小鼠中诱导p-MCA，得到明显的局部缺血性损伤。p-MCA 22小时后，评价动物的神经学得分(从0-无临床症状到3-偏瘫、转圈以及紧张症)，并且在牺牲动物前连续2小时静脉内注射放射标记的NST200(80μCi/动物)。制备10μm的冷冻切片，风干并暴露于氚敏感型胶片(Hyperfilm-3h，RPN535B Amersham-Pharmacia，Eu)。使胶片暴露7周的时间，显影(GBX Developer&Fixer，Kodak，USA)并通过测量光密度进行分析。通过TINA软件估算从而测定缺血核对对侧半球的信号中的光密度/mm²形式的³H-DDC密度。按照微量放射自显影标准(RPN510 Amersham-Pharmacia，Eu)转化信号并以nCi/mg单位表示。
试验结果：
如由显示³H-NST200(a)和H&E染色(b)的累积的图9中可见，放射自显影图片分析揭示了在凋亡/坏死性细胞死亡区域内³H-NST200靶向损伤的特异性。该结果由H&E染色进一步证实。因此，³H-NST200可用作放射自显影图片分析中脑凋亡性损伤的标记物。
实施例11
大鼠肾缺血性再灌注(I/R)的³H-NST200放射自显影
试验步骤：
在由腹膜内给药氯胺酮(80mg/kg)和Xilazine(10mg/kg)的组合诱导的全身麻醉下对大鼠进行手术步骤。肾缺血是由使用小的无创伤血管钳钳夹左侧单侧肾动脉45分钟造成的。同一动物的对侧未处理的肾设计用作伪手术对照。由清除夹钳引起再灌注。肾再灌注时间为24小时。在再灌注期间，静脉内注射100μCi of ³H-NST205，并且在1小时后，切除双肾，在液氮中冷冻并储存于-70℃待用。制备10μm的冷冻切片，风干并暴露于氚敏感型胶片(Hyperfilm-3h，RPN535B Amersham-Pharmacia，Eu)。使胶片暴露7周的时间，显影(GBX Developer&Fixer，Kodak，USA)并通过测量光密度进行分析。通过TINA软件估算从而测定缺血肾对对侧肾的信号中的光密度/mm²形式的³H-DDC密度。按照微量放射自显影标准(RPN510 Amersham-Pharmacia，Eu)转化信号并以nCi/mg单位表示。
试验结果：
如图10所示，在大鼠肾缺血再灌注损伤期间，在外髓质(outermedulla，OM)和皮质-髓质区域(cortico-medullary region)的远端小管中观察到凋亡，而在OM的近端小管直部观察到严重的坏死。在皮质中观察的较少的损伤。在对侧伪手术肾中未观察到损伤。放射自显影图片分析揭示了在凋亡/坏死性细胞死亡区域内³H-NST205靶向损伤的特异性，并由形态学分析进一步证实。相比之下，证实无³H-NST205被吸收到对侧的肾中，强调了³H-NST205仅吸收入受损肾中的特异性。
实施例12
³H-NST205在由放射性对比剂诱导的急性肾远端小管坏死(ATN)大鼠模型中的放射自显影
试验步骤：
通过给药吲哚美辛(Sigma Chemical Co.)、10mg/kg、i.v.，N^ω硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，Sigma Chemical Co.)、10mg/kg、i.v.以及放射性对比剂碘酞钠(sodium-iothalamate)80％(Angio-Conray，MallinckrodtInc)、6mL/kg、i.a.的组合诱导具有选择性髓质缺氧性肾小管损伤的肾病。向其他大鼠注射载体作为对照。损伤24小时后，向对照以及试验大鼠静脉内注射100μCi ³H-NST 205，在1小时后切除肾并与液氮中冷冻。
试验结果：
如图11所示，肾形态学分析揭示髓质(即外髓的外部和内部条带)损伤程度范围较广。
³H-NST205的自导(homing)主要限制于外髓内的受损区域。未在特定无形态学损伤的区域发现³H-NST205吸收。
实施例13
通过³H-200对试验自身免疫脑脊髓炎(EAE)的成像；放射自显影
试验步骤：
通过免疫6-8周龄的C3H.SW/C57/b1雌性小鼠诱导EAE。用包含大鼠髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的氨基酸35-55的肽免疫动物。所述肽是利用固相技术于肽合成器上合成。在小鼠肋腹一侧皮下注射在完全弗氏佐剂(CFA)中的含有75μl MOG肽的200μl乳剂以及200μg结核分枝杆菌。一周后在另一肋腹的一侧进行相同的注射。在致脑炎刺激后，每日观察小鼠并对EAE临床表现打分(0＝无临床症状到5＝四肢完全瘫痪)。在选定的疾病阶段(症状前或末期)向动物静脉内注射放射标记的NST200(100μCi/动物)，在牺牲动物前温育1小时。制备10μm的冷冻切片，风干并暴露于氚敏感型胶片。使胶片暴露7-9周的时间，显影并通过测量光密度进行分析。通过TINA软件估算从而测定缺血肾对对侧肾的信号中的光密度/mm²形式的³H-DDC密度。
试验结果：
多发性硬化疾病的EAE动物模型模拟了以中枢神经系统的白质为目标的慢性致残性自身免疫神经疾病。在如图12所示的放射自显影中观察到试验动物中白质的严重损伤。在大脑水平，冠状切片表现出大脑底部的锥体束染为暗色并且与染为亮色的对照未免疫小鼠相比过量的放射性配体在整个大脑中累积。在脊髓水平同样观察到放射性标记的³H-200的明显累积。与对照未处理的动物相比，脊髓的纵切片显示经免疫的小鼠中自质的侧束(lateral tracts)被高水平标记。