一种快速制备PCR扩增模板的方法.pdf

本发明涉及一种快速制备扩增模板的方法，本发明的技术方案是：将3毫米×3毫米鱼的鳍条与100微升TE buffer置于1.5毫升离心管中，离心、于-20℃冷冻30min、水浴加热、离心分离、取上清液。本发明的方法优点在于：1、取样量少，只需3毫米×3毫米的组织样品，对受试材料几乎没有伤害，完全可以满足受试材料活体分析的需要；2、简单、切实可行，只需将样品于PCR板中冷冻、融化、离心、吸上清，可使用96孔PCR板进行批量制备；3、快速高效，整个制备过程只需40分钟，没有复杂和要求苛刻的分子生物学实验操作步骤，不需要使用昂贵的仪器；4、避免了传统方法中氯仿、异戊醇等对人体有害的化学试剂。

权利要求书
1.  一种快速制备PCR扩增模板的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向1.5毫升离心管中加入100微升TE buffer；
(2)将测试材料置于1.5毫升离心管中，进行离心；
(3)离心后，将离心管置于-20℃冰冻30min；
(4)取出冰冻的离心管，水浴加热10分钟；
(5)水浴后，将离心管置于离心机中离心分离；
(6)取离心后的上清液于新离心管，即得到用于PCR扩增的模板。

2.  根据权利要求1所述的快速制备PCR扩增模板的方法，其特征在于， 所述TE buffer为0.01mol的Tris-HCl和0.001mol的EDTA二钠盐定容至1升， 调节PH至8.0，经高压蒸汽灭菌。

3.  根据权利要求1所述的快速制备PCR扩增模板的方法，其特征在于， 所述测试材料为3毫米×3毫米草鱼鳍条。

4.  根据权利要求1所述的快速制备PCR扩增模板的方法，其特征在于， 所述步骤4中水浴加热温度为37-95℃。

5.  根据权利要求1所述的快速制备PCR扩增模板的方法，其特征在于， 所述步骤4中水浴加热温度为55℃。

6.  根据权利要求1所述的快速制备PCR扩增模板的方法，其特征在于， 所述步骤5中离心条件为：13000转/分、常温、2分钟。

说明书一种快速制备PCR扩增模板的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，是一种快速制备PCR扩增模板 的方法。
背景技术
随着生物技术的飞速发展，以DNA为基础的研究已经成为生物技术的核 心，能够快速提取出基因组DNA是进行PCR检测、构建DNA文库及其他许 多分子生物学研究操作的的基本前提。
传统的DNA提取步骤主要分为：破坏细胞膜(植物等还有细胞壁)、除蛋 白、沉淀DNA、除杂和溶解。最为经典的DNA提取方法是酚抽提法、异丙醇 沉淀法以及甲酰胺裂解法，此外有很多方法是在这些基础上进行改进的。这三 种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞，在前两种方法 中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA；甲酰胺 法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理 DNA样品。此外，目前应有较多的还有CTAB法、SDS法、高盐法、试剂盒 法等。
上述这些方法虽能提取出较高纯度的DNA，但操作繁琐、耗时长、且所 用试剂(如苯酚、异丙醇等)具有一定的毒性，会对环境造成污染；试剂盒虽 能较快提取高质量的DNA，但成本较高，不适合大规模应用。而在进行数量 遗传学相关研究及动植物育种时，常常需要较大的样本量及批量提取DNA， 以上所述的DNA提取方法已不能很好地满足这一要求。中国专利文献 CN200810071267.4，公告日2008年10月29日公开了一种大批量快速制备PCR 模板的方法，其方法是：将微量植物叶片放入一定体积的裂解液中加热裂解， 然后中和，反应混合液可直接作为PCR反应的模板，能够快速大批量的制备 PCR反应模板。但是该种方法在需要用到KOH水溶液、Tween-20水溶液、TE 缓冲液和BSA水溶液，而且BSA水溶液需要用20-25μm孔径的微孔滤膜过 滤后使用，过程繁琐，成本较高。因此，提供一种取样少，成本低、快速高效 的制备PCR扩增模板的方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种快速制备PCR扩增模 板的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种快速制备PCR扩增模板的方法，包括以下步骤：
(1)向1.5毫升离心管中加入100微升TE buffer；
(2)将测试材料置于1.5毫升离心管中，进行离心；
(3)离心后，将离心管置于-20℃冰冻30min；
(4)取出冰冻的离心管，水浴加热10分钟；
(5)水浴后，将离心管置于离心机中离心分离；
(6)取离心后的上清液于新离心管，即得到用于PCR扩增的模板。
所述TE buffer为0.01mol的Tris-HCl和0.001mol的EDTA二钠盐定容至 1升，调节PH至8.0，经高压蒸汽灭菌。
所述测试材料为3毫米×3毫米草鱼鳍条。
所述步骤4中水浴加热温度为37-95℃
所述步骤4中水浴加热温度为55℃。
所述步骤5中离心条件为：13000转/分、常温、2分钟。
注：本发明制备方法中测试材料的大小、冰冻温度及时间、水浴温度及时 间、离心条件等参数是发明人在大量的实验基础上总结得出的，在保证所制备 的模板满足PCR扩增条件的同时，最大程度的降低制备时间，不应视为本领 域常规技术手段。
本发明优点在于：
1、取样量少，只需3毫米×3毫米的组织样品，对受试材料几乎没有伤 害，完全可以满足受试材料活体分析的需要。
2、本发明的方法简单、切实可行，只需将样品于PCR板中冷冻、融化、 离心、吸上清，可使用96孔PCR板进行批量制备。
3、快速高效，整个制备过程只需40分钟，没有复杂和要求苛刻的分子生 物学实验操作步骤，不需要使用昂贵的仪器。
4、避免了传统方法中氯仿、异戊醇等对人体有害的化学试剂。
附图说明
附图1是实施例1的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上的电泳结果。其中点 样孔1-6分别为水浴温度为37、55、60、72、80、95℃得到的PCR扩增产物， 点样孔7为D2000，点样孔8-13为传统方法提取DNA后的PCR扩增产物， 最下面一条较弱条带为引物二聚体。
附图2是实施例2中制备得到的PCR扩增模板浓度及OD值。
附图3是实施例2的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上的电泳结果。其中点 样孔0为D2000；点样孔1-6、7-12、13-18、19-24分别为一个个体对应的6 对不同引物(表1)。点样孔1、7、14、19为引物Cid1529对应的不同个体，2、 8、15、20为引物Cid1525对应的不同个体，3、9、13、21为引物Cid0909对 应的不同个体，4、10、16、22为引物Cid0058对应的不同个体，5、11、17、 21为引物Cid0036对应的不同个体，6、12、18、24为引物Cid0004对应的不 同个体。最下面的较弱条带为引物二聚体。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1快速制备PCR扩增模板及效果验证(一)
一、PCR扩增模板的制备
(1)在1.5毫升灭菌离心管中加入100微升TE buffer，TE buffer为0.01mol 的Tris-HCl和0.001mol的EDTA二钠盐定容至1升，调节PH至8.0，经高压 蒸汽灭菌锅灭菌；
(2)取3毫米×3毫米草鱼鳍条于步骤1离心管中，用剪刀将组织剪碎；
(3)将步骤2中离心管在离心机上进行离心，并置于-20摄氏度冰箱中冰 冻0.5小时；
(4)取出冰冻的离心管，在水浴锅中水浴(温度梯度分别为37、55、60、 72、80、95℃)融化10分钟，期间可轻摇试管，将组织混匀；
(5)将步骤4中离心管在离心机上进行离心，离心条件为：13000转/分、 常温、2分钟；
(6)取步骤5离心后离心管中的上清液于新离心管，即得到用于PCR扩 增的模板。
二、效果验证
a.对PCR扩增模板进行扩增。反应体系为20μL体系：10μL的2×Taq PCR Master Mix(不含染料)，2μL的DNA模板，7μL的dd H2O，上下游引物0.5μL。 反应条件为：94℃预变性2min；；94℃变性50S，58℃退火30S，72℃延伸30S， 共2个循环；94℃变性50S，55℃退火30S，72℃延伸30S，共35个循环；72℃ 延伸10min。PCR扩增所使用的引物CID0001(引用Fu J,Shen Y,Xu X,et al. Multiplex microsatellite PCR sets for parentage assignment of grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J].Aquaculture International,2013,21(6):1195-1207) 见表1：
表1PCR扩增所使用的引物

b.制备1.5％的琼脂糖凝胶，在1×TAE中对步骤a的PCR扩增产物进行检 测。检测结果如图1所示，其中点样孔1-6分别为水浴温度为37、55、60、72、 80、95℃得到的PCR扩增产物，点样孔7为D2000，点样孔8-13分别为传统 方法提取DNA后的PCR扩增产物，最下面一条较弱条带为引物二聚体。从图 中可以看到，使用本发明的方法分别在6个水浴温度梯度均能得到清晰的条带。
实施例2快速制备PCR扩增模板及效果验证(二)
一、PCR扩增模板的制备
(1)在1.5毫升灭菌离心管中加入100微升TE buffer；
(2)取3毫米×3毫米草鱼鳍条于步骤1离心管中，用剪刀将组织剪碎；
(3)将步骤2中离心管在迷你离心机上进行离心，并置于-20摄氏度冰箱 中冰冻0.5小时；
(4)取出冰冻的离心管，在水浴锅中55℃水浴融化10分钟，期间可轻摇 试管，将组织混匀；
(5)将步骤4中离心管在离心机上进行离心，离心条件为：13000转/分、 常温、2分钟；
(6)取步骤5离心后离心管中的上清液于新离心管，即得到用于PCR扩 增的模板。
二、效果验证
(1)将PCR扩增模板在Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000C分光光 度计上进行检测，产物浓度为153.1～555.9ng/μL、A260/A280为1.27～1.50(如 图2)。
(2)对PCR扩增模板进行扩增。反应体系为20μL体系：10μL的2×Taq  PCR Master Mix(不含染料)，2μL的DNA模板，7μL的dd H2O，上下游引物 0.5μL。反应条件为：94℃预变性2min；；94℃变性50S，58℃退火30S，72℃ 延伸30S，共2个循环；94℃变性50S，55℃退火30S，72℃延伸30S，共35 个循环；72℃延伸10min。PCR扩增所使用的引物(引用Fu J,Shen Y,Xu X,et  al.Multiplex microsatellite PCR sets for parentage assignment of grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J].Aquaculture International,2013,21(6):1195-1207) 见表1。
(3)制备1.5％的琼脂糖凝胶，在1×TAE中对步骤2的PCR扩增产物进 行检测。检测结果如图3所示，其中点样孔0为D2000；点样孔1-6、7-12、 13-18、19-24分别为一个个体对应的6对不同引物。点样孔1、7、14、19为 引物Cid1529对应的不同个体，2、8、15、20为引物Cid1525对应的不同个体， 3、9、13、21为引物Cid0909对应的不同个体，4、10、16、22为引物Cid0058 对应的不同个体，5、11、17、21为引物Cid0036对应的不同个体，6、12、18、 24为引物Cid0004对应的不同个体。最下面的较弱条带为引物二聚体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。