干燥粉末组合物 【发明领域】
本发明涉及采用疏水衍生的糖类制备的稳定治疗剂的生产，和治疗组合物。
【发明背景】
目前临床应用中可利用多数治疗蛋白质和肽。存在多种递送方法和途径，其中肠道外途径最为广泛应用。通过肺途径递送是一种有吸引力的可选择途径，其主要原因在于患者的可接受性。而且有证据表明较大的分子如蛋白质可以通过肺表面被容易地吸收到血流中。用于肺递送的技术仍处在研发的早期，其结果是存在可观的新的治疗蛋白和肽的肺制剂的范围。
一种制备治疗蛋白质的方法是采用用于在存储期间稳定蛋白质并辅助递送的糖类。这种稳定糖类的一个实例为海藻糖。
最近，对在制备蛋白质过程中采用疏水衍生的糖类(HDCs)引起了兴趣。WO-Aα-96/03978公开了包括HDC和治疗剂，并被制成用于直接递送的固体剂型的组合物。该组合物可以是用于肺递送的粉末、显微操作针或用于射击、透皮递送的微粒，或者植入组合物。
拥有由HDC制备的治疗剂的好处在于存在用于研制控释递送系统的可能性。此外，HDC本身可能具有期望的有助于递送，尤其是递送到深肺的性质。
但是，治疗蛋白质一般亲水性，而且由于HDC分子地疏水性，因而将蛋白质混入HDC是有问题的。
因此，需要一种有效的方法，通过它可以将亲水性活性剂混入HDCs。
发明概述
本发明基于采用亲水性离子对(HIP)可以将亲水性活性剂有效地混入HDCs的认识。
根据本发明的第一方面，制备治疗组合物的方法包括在有机溶剂中形成疏水衍生的糖类和亲水性治疗剂与离子物质的离子对配合物(ion-pair complex)的溶液；并干燥该溶液。
在一个实施方案中，该方法包括步骤：
(i)在含水介质中混合该治疗剂与离子物质形成沉淀；
(ii)将该沉淀和HDC溶于有机溶剂；和
(iii)干燥所得的有机溶液。
在进一步的实施方案中，该方法包括步骤：
(i)在水溶液中混合该治疗剂与离子物质形成离子对配合物；
(ii)加入与水不可混溶的有机活性剂形成有机相，并使该离子对配合物进入有机相；
(iii)分离该有机相；
(iv)将HDC加到该有机相；和
(v)干燥该有机溶液。
根据第二方面，组合物包括，固体剂型，疏水衍生的糖类，治疗剂和药用离子洗涤剂。
根据第三方面，本发明的组合物可以用于制备通过肺途径给予患者以治疗疾病的药物。
该产品期望用于治疗用途，且该活性活性剂在递送时是治疗学有效的。
将亲水性活性剂有效地混入HDC赋予了欲制备的有用治疗剂期望的控释性质。
发明详述
本发明的方法基于疏水离子对是一种可用于用疏水糖类配制亲水性活性剂的有用的方法的认识。
总之，该方法包括在活性物质如蛋白质上的正电荷和所选择的阴离子表面活性剂上的负电荷之间产生疏水离子对。或者，将蛋白质和表面活性剂上的电荷的极性反转。
本发明的方法可以在本领域技术人员已知的条件下进行。已知可以采用低浓度的阴离子洗涤剂从溶液中沉淀出亲水性蛋白质。似乎沉淀是来自蛋白质离子对的相反离子被洗涤剂取代的结果。然后可以将沉淀通过例如离心分离，随后将其溶于含有HDC的有机溶剂。然后该亲水性活性剂与HDC处在溶液中，并可以将其干燥形成固体。活性物质的总回收率是很高的，因此本发明的方法提供了一种可发展的商业规模方法。
或者，采用相分离而不经沉淀而制备离子对。将含水相中的蛋白质与适宜的洗涤剂混合形成离子对。加入适宜的有机溶剂形成有机相，并将该离子对配合物引入到该有机相中。然后分离该有机相并与任选地被包括在进一步的有机溶剂中的HDC混合。
亲水性活性剂(agent)
可以用于本发明的亲水性活性剂包括任何治疗学活性蛋白质、肽、多核苷酸或离子药物。特别地这种活性剂可以是酶或激素。实例包括但不限于胰岛素、干扰素、生长因子、α-胰凝乳蛋白酶白介素、降钙素、生长激素、亮丙瑞林(leuprolide)、集落刺激因子和DNase。胰岛素是优选的实施方案，并且是用于肺递送的理想治疗剂。
离子物质
任何适宜的离子物质可以用于本发明。优选的物质为洗涤剂。在将蛋白或肽引入HDCs中时，该物质优选为阴离子的。当多核苷酸或带负电的蛋白质为活性剂时，该物质应优选为阳离子的。适宜的离子物质包括盐如硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐或羧酸盐。
适宜的阴离子洗涤剂的实例包括十二烷基硫酸钠(SDS)、多库脂钠(AOT)、磷脂酰肌醇(PPI)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酸钠盐(DPPA.Na)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油钠盐(DPPG.Na)和油酸钠。适宜的阴离子洗涤剂的实例包括苯甲烃铵氯化物(BAC)、六癸基三甲基铵溴化物(CTAB)和十二烷基三甲基铵溴化物(DoTAB)。
优选该洗涤剂应该是药学上可接受的。特别地，该洗涤剂应该适于肺递送。
有机溶剂
任何适宜的有机溶剂可用于本发明。可以根据活性剂使用极性或非极性溶剂。一般而言，该溶剂是药学上可接受的溶剂。适宜的溶剂包括但不限于乙醇、丙醇、异丙醇、1-辛醇、丙酮、醚、乙酸乙酯、甲酸乙酯、二氯甲烷(DCM)、己烷和甲醇。
疏水衍生的糖类(HDCs)
该HDC可以是任何现有技术中已知的HDC。优选该HDC在干燥时形成高Tg的无定形玻璃态。
优选该HDC能形成Tg大于20℃，选大于30℃，最优选大于40℃的玻璃。
本文所用的″HDC″指各种的疏水衍生的糖类，其中至少一种羟基被包括但不限于酯和醚的疏水部分取代。
在WO-A-96/03978 and WO-A-99/01463中描述了多种适宜的HDCs的实例。HDC的具体的实例包括但不限于山梨醇六乙酸酯(SHAC)、α-葡萄糖五乙酸酯(α-GPAC)、β-葡萄糖五乙酸酯(β-GPAC)、1-O-辛基-β-D-葡萄糖四乙酸酯(OGTA)、海藻糖八乙酸酯(TOAC)、海藻糖八丙酸酯(TOPR)、β-4’，6’-二异丁酰六乙酰乳糖、蔗糖八乙酸酯(SOAC)、纤维二糖八乙酸酯(COAC)、棉子糖十一乙酸酯(RUDA)、蔗糖八丙酸酯、纤维二糖八丙酸酯、棉子糖十一丙酸酯、四-O-甲基海藻糖、二-O-甲基-六-O-乙酰蔗糖和海藻糖6，6-二异丁酸六乙酸酯。
已发现纯的单一HDC玻璃在室温和多达至少60％的湿度下是稳定的。但是，混有某种活性物质的HDC玻璃混合物意外地在室温和多达至少95％的湿度下是稳定的。不同的HDCs的混合物可能是期望的，以获得不同的控释曲线。
许多因素影响提取至有机溶液中的蛋白质，即缓冲剂PH和离子强度、蛋白质分子量、洗涤剂：蛋白质比率、PI和电荷分布，以及表面活性剂性质和溶剂性质。可以要求这些参数变化至使该方法步骤的效率最大。这对于领域技术人员来说是显而易见的。
还可以改变这些参数以获得所得产品的不同控释性质。例如HIP配合物：HDC比率或溶剂混合变化可能影响释放性质。这些参数的变化对本领域技术人员来说也是显而易见的。
可以采用任何适宜的方法干燥这些制剂，这些方法包括但不限于冷冻干燥、烘干、超临界流体处理，和优选的喷雾干燥。优选喷雾干燥，因为它使溶剂的蒸发迅速，留下具有低残留溶剂水平的玻璃状无定形产品。该玻璃状无定形产品应该优选在室温或室温以上是稳定的，以容易地存储这些组合物而不损失活性。
该干燥的产品优选为在室温或室温以上存储稳定的固体形式。其稳定性可能归因于在干燥时形成玻璃状无定形结构的糖类。在一个实施方案中，该产品的玻璃转化温度(Tg)大于20℃，优选大于30℃。该产品可以是适于直接递送给患者的固体形式。优选地，该产品是直径小于30μm，优选小于10μm，最优选小于5μm的干燥粉末或″微球体″。这些粉末适于肺递送。该产品还可以是用于射击或透皮递送的显微操作针。
以下的实施例例举本发明。
实施例1α-胰凝乳蛋白酶(CMT)
α-胰凝乳蛋白酶(CMT)是一种PI为8.5而净正电荷在PH5和6之间的非膜结合蛋白。已在PH5的10mM乙酸钠/CaCl2缓冲剂中混合CMT与40当量的多库脂钠时实现将CMT有效地分配至有机溶剂。还注意到离子强度在提取的效率中起到了非常重要的作用，它主要通过控制乳剂的形成。通过改变氯化钙的浓度而控制离子强度，并且呈现出一般性的趋势，这种趋势表明离子强度降低导致溶剂中蛋白质的百分回收率降低。有机溶剂的选择是重要的，如采用CD测定发现CMT在非极性溶剂如异辛烷、declain和四氯化碳中为天然状的，但在更大极性的溶剂如二氯甲烷中具有少量或没有有机结构。
将在10mM的乙酸钠中的浓度为2mg/ml的CMT、pH7.0的5mM氯化钙、与50摩尔当量的在己烷中的浓度为1.778mg/ml的AOT混合。离心后，分离有机层，真空干燥并用BCA试验测定蛋白质浓度。计算表明80-90％的酶被提取到该溶剂中。
然后采用在有机溶剂中出现的TOAC重复该实验。将TOAC(60mg/ml，在丙酮中)加到CMT(2mg/ml，在己烷中)的HIP试样中，产生最终的在丙酮和己烷(1∶1)中的30mg/ml TOAC和1mg/ml CMT的组合物。TOAC的用量为酶用量的5-10倍。将所得溶液喷雾干燥形成干燥粉末组合物。
实施例2胰岛素
(i)将在pH为2的10mM乙酸钠缓冲剂中的胰岛素(5mg/ml)与在水中的4.5摩尔当量的AOT(10mg/ml)混合，导致该蛋白质的有效沉淀。离心分离该蛋白质并将所得的团丸再次溶于含有25mg/mlTOAC或TIBAC的丙酮和IPA(1∶2)的混合物中。BCA分析该干燥的混合物表明99％的蛋白质被回收到该溶剂中。喷雾干燥该溶液得到产率至多为43％，而采用DSC的喷雾干燥材料的早期分析表明玻璃的存在。
(ii)将胰岛素与在PH为11的10mM碳酸钠中的7.5摩尔当量苯甲烃铵氯化物进行疏水性离子配对，并将其再次溶于含有25mg/mlTOAC的丙酮和IPA(1∶2)。BCA分析该制剂表明92％的蛋白质被提取至溶剂。喷雾干燥该制剂得到18％的回收率。
(iii)还用2％FITC-标记的胰岛素掺加胰岛素，采用AOT将其提取至含有TOAC的IPA和丙酮(比率2∶1)，并喷雾干燥。在该溶剂中回收的蛋白质的百分率为96％，并喷雾，干燥得到35％回收率的物质。
实施例3α-L-磷脂酰肌醇(PPI)
最初进行实验以研究得到进入有机溶剂的高回收率胰岛素所需的最佳PPI数量。对于2mg的胰岛素试样，PPI的数量从5变化于7.5摩尔当量。将胰岛素溶于10mM乙酸钠缓冲剂，pH2.5(2mg/ml)，并在水中制备5mg/ml PPI的溶液。在将PPI加到各胰岛素试样时产生沉淀，在2500rpm下离心2分钟收集该沉淀。将该团丸再次悬浮在各种不的溶剂中，即丙酮、二氯甲烷、乙醇及其混合物。当采用二氯甲烷和乙醇(比率1∶1)时，在有机溶剂中得到90％的回收率。沉淀容易地溶解得到2mg/ml溶液。
实施例4有DPPA、DPPG的胰岛素
测试两种卵磷脂衍生物作为胰岛素HIP的可能表面活性剂。整个过程采用标准缓冲条件(10mM乙酸钠缓冲剂，pH2.5)。最优化采用DPPA.Na HIP胰岛素所需的条件包括将表面活性剂的摩尔当量由5改变至20。将沉淀溶于乙醇∶DCM(1∶1)，并且当使用9摩尔当量时，得到的回收率为71％。
待测试的第二卵磷脂衍生物为DPPG.Na。再次通过改变加入的相对于胰岛素的DPPG的数量而将反应条件最优化。研究数量的范围为5-12摩尔当量。在采用BCA试验分析以后，当用量为8摩尔当量时，在有机溶剂中回收大约88％的蛋白质。
实施例5亮丙瑞林
尝试扩大HIP的应用，研究额外试验分子。LHRH类似物亮丙瑞林乙酸酯具有两个可能的HIP部位。最初的实验比较在pH2.5的10mM乙酸钠缓冲剂和pH5的100mM柠檬酸钠缓冲剂中的反应。PPI用作表面活性剂，加入2摩尔当量产生澄清、粘性团丸，形成在乙酸盐缓冲剂中进行的试样。BCA分析悬浮在乙醇∶DCM(1∶1)中的团丸表明已在乙酸盐回收到66％的肽而在PH为5时仅回收到3％。建立采用leuprolide的BCA试验的标准曲线并重复反应。得到63-66％的回收率。
还尝试采用DPPG.Na进行反应。将缓冲剂保持为10mM乙酸钠，pH 2.5。由于DPPG.Na在水中相对于PPI的不溶性，测试一定范围的摩尔当量。DPPG.Na的用量范围为肽用量的1-5倍。结果表明DPPG.Na用量的增加导致肽的百分回收率增加。当用量为5摩尔当量时得到最高的回收率(65％)。
实施例6胰蛋白酶
还研究了胰蛋白酶作为酶的一个实例。其目的在于证明在HIP之后可以保持活性。将在PH2.5的10mM乙酸钠缓冲剂中的2mg/ml胰蛋白酶与变化的摩尔当量的DPPG(from 40x to 100x)混合并收集沉淀。再次悬浮在乙醇∶DCM(1∶1)中，然后用BCA试验分析表明回收率范围为72％-83％。与90和100当量的DPPG形成的沉淀不太溶于溶剂，这可能是由于存在的卵磷脂的数量。尝试用60摩尔当量的DPPG进一步优化。
将乙酸盐缓冲剂的PH从2.5改变到7.3来进一步研究反应。在PH 2.5进获得最好的回收率。吸收到有机溶剂的酶的数量为74％。最后，最初的酶的浓度从标准的2mg/ml增加到5和10mg/ml。BCA分析再次溶解的团丸表明当最初的酶浓度为5mg/ml时，大约86％已被回收。