带有降钙素基因相关肽衍生物及其制备方法 【技术领域】
本发明属遗传工程技术领域，具体涉及一种带有降钙素基因相关肽衍生物及其制备方法。
背景技术
降钙素基因相关肽(CGRP)广泛分布于人体中枢神经系统、周围神经系统、心血管系统、泌尿系统等组织器官中。它在动物体内具有多方面的生理功能，是强有力的血管舒张剂，能扩张血管、降低血压，增强心肌收缩能力，提高血液输出量。具有治疗高血压，调节心律不齐，治疗心衰、心绞痛、冠心病及心肌坏死等心血管疾病的巨大临床应用价值。但是CGRP本身是小肽，在动物体内易被降解，作用时间短、生产成本高、价格贵，因而限制了CGRP在医疗实践中的应用价值。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种带有降钙素基因相关肽衍生物及其制备方法。
本发明的目的是另一个目的是上述带有降钙素基因相关肽衍生物的治疗心血管疾病的药物。
本发明提供的带有降钙素基因的相关肽衍生物，是采用重组基因技术，将降钙素基因CGRP转入大肠杆菌细胞，经发酵后，从大肠杆菌细胞中分离到的CGRP衍生物，它由A和B两部分肽段组成，其中，A段肽为CGRP，共有37个氨基酸，氨基酸序列为SEQ.ID.NO1，B段肽共有230个氨基酸，氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2，其结构形式如图1所示。记为降钙素基因相关肽衍生物I：GST-CGRP。其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.3。该衍生物的分子量为30.6Ku。
本发明还提供降钙素基因相关肽衍生物II：即在上述衍生物I中的A段肽的C端接上具有降压功能地小肽HHL，记为C段肽，该C段肽由5个氨基酸组成，其序列为SEQ.ID.NO4，其结构形式如图2所示。该衍生物II的分子量为31.2Ku。记衍生物II为：GST-CGRP-HHL。
此外，本发明还提供降钙素基因相关肽衍生物III：即在上述衍生物I中的A段肽的C端接上具有降压功能的小肽RPLKPW，记为D段肽，该D段肽由8个氨基酸组，其序列为SEQ.ID.NO5。其结构形式如图3所示。该衍生物III的分子量为31.6Ku。记衍生物III为：GST-CGRP-RPLKPW。
本发明中提供的CGRP衍生物I，衍生物II和衍生物III都含有CGRP基因。
由该基因编码37个氨基酸的多肽，人的CGRP有α和β两种。其中α-CGRP的第3位、22位、25位分别是Asp、Val、Asn，即如SEQ.ID.NO1所示；β-CGRP中第3位、22位、25位分别是Asn、Met、Ser、而其余序列相同。
上述带有降钙素基因相关肽即CGRD衍生物的制备方法，包括CGRP基因的制备、分离、提取等，具体步骤如下：
(1)化学合成的人CGRP基因，或与有降压功能的小肽HHL或RPLKPW的基因连接后，再与大肠杆菌表达载体相连并转入大肠杆菌菌株；
(2)将菌株置于细菌培养基中，培养温度在28-42℃之间，培养时间8-25小时，然后收集菌体细胞；
(3)破碎细胞，将细胞中的目的蛋白通过阴离子交换柱或凝胶层析柱或亲和层析柱纯化融合蛋白，得到CGRP衍生物I、得到CGRP衍生物II和CGRP衍生物III，测定蛋白浓度。
基因克隆时将α-CGRP基因或β-CGRP基因化学合成，然后将CGRP基因插入大肠杆菌质粒载体pGEX-4T-2，这种重组质粒命名为pGEX-CGRP。经过亚克隆，然后将这种重组质粒转入大肠杆菌受体菌。这种受体菌制成感受态细胞可以是C600、TG1、MC1061、JM101等。用双酶切或PCR扩增及核苷酸序列分析，确证转化子的序列与所设计序列一致。转化子在LB培养基上即可培养，于28℃～42℃的温度培养8-15小时，然后收集细菌细胞；破碎菌体，从上清液中收集融合蛋白。然后将融合蛋白经加热45℃～90℃，用30％～50％的(NH4)2SO4沉淀。再将初步纯化的融合蛋白通过Q-Sepharose柱和Glutathione Sepherose4B层析柱便得到CGRP衍生物I。
制备CGRP衍生物II是从pGEX-CGRP质粒上用PCR方法扩出CGRP基因，再加入化学合成编码HHL的基因，退火后与pGEX-4T-2载体连接，构建成质粒pGEX-CGRP-3AA，转入大肠杆菌受体菌。这种受体菌是感受态细胞，他们可以是C600、TG1、MC1061、JM101等菌株。用双酶切与PCR扩增及核苷酸序列分析，确证转化子的序列与所设计的序列一致。转化子在LB培养基上培养，于28℃～42℃的温度下培养8-15小时，然后收集细菌细胞，破碎菌体，收集融合蛋白。然后将融合蛋白悬浮于PBS，超声，离心后收集上清。上清中加入Triton-100至终浓度为1％，混匀，再加入一定量的Glutathione Sepharose 4B，亲和吸附0.5h，用10倍体积PBS洗3次，去上清，最后用洗脱液(10mmol/L reducedglutathione，50mmol/L Tris-Cl pH8.0)洗脱并收集目的蛋白，便得到CGRP衍生物II。将CGRP衍生物II中化学合成的编码HHL的基因换成编码RPLKPW的基因，即可以得到CGRP衍生物III。CGRP衍生物I共有267个氨基酸，分子量为30.6ku。CGRP衍生物II共含有272个氨基酸，与天然CGRP相比它的N端增加230个氨基酸，C端增加5个氨基酸，其分子量为31.2ku。衍生物III与天然CGRP相比它是由三个肽段组成，它的N端增加了230个氨基酸，C端增加8个氨基酸。共含有275个氨基酸，其分子量为31.6ku。
本发明设计的基因结构充分考虑到CGRP扩张血管，降低血压、增强心肌收缩力，提高血液输出量的作用，又改善了CGRP作用时间短的不足。作为治疗心血管疾病的药物，本发明的CGRP衍生物十分有利于高效、方便地治疗高血压，心率不齐，心衰，心绞痛心血管系统疾病。
本发明利用基因工程技术，设计基因结构，通过细菌发酵和不同的分离纯化过程，得到三种CGRP衍生物。这些CGRP衍生物可通过注射、口腔滴喷、鼻腔滴喷、粘膜等途径为病人供药。单独或混合为病人供给CGRP衍生物后，非但在体内产生和天然CGRP一样的功能，而且作用时间更为持久。
上述三种CGRP衍生物具有和天然CGRP同样的生理功能。以自发性高血压大鼠(SHR)为动物模型，注射后都能引起血压下降。对收缩压而言，CGRP衍生物I、CGRP衍生物II、CGRP衍生物III的降压幅度均能达到2.7～4.0kPa，后两者维持时间与CGRP标准品相似，约为30min，但GST-CGRP维持时间稍短于CGRP标准品。对舒张压变化而言，CGRP衍生物II降压效果更为明显，在24min左右降幅达到8.0kPa，维持时间达70min以上，而CGRP衍生物I和CGRP衍生物III的降压幅度则与CGRP标准品相似，可是GST-CGRP的降压维持时间也稍短于CGRP标准品。
【附图说明】
图1为带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物I的结构形式。
图2为带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物II的结构形式。
图3为带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物III的结构形式。
图4SHR收缩压的变化曲线
1，标准CGRP；2，CGRP衍生物I；3，CGRP衍生物III；4，CGRP衍生物II；5，阴性对照
图5SHR舒张压的变化曲线(GST-CGRP-HHL与CGRP标准品比较，p＜0.01)。SHR舒张压的变化曲线(GST-CGRP-HHL与CGRP标准品比较，p＜0.01)
1，标准CGRP；2，CGRP衍生物I；3，CGRP衍生物III；4，CGRP衍生物II；5，阴性对照
【具体实施方式】
按权利要求1将用化学法合成的CGRP基因共编码37个氨基酸，然后将该基因插入大肠杆菌质粒载体pGEX-4T-2，这种重组质粒命名为pGEX-CGRP。经过亚克隆，然后将这种重组质粒转入大肠杆菌受体菌TG1。用双酶切和PCR扩增及核苷酸序列分析，确证转化子的序列与所设计序列一致。转化子在LB培养基上即可培养，挑取单菌落，37℃过夜培养，按1∶50接种到1L含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB中，25℃培养5h，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导9h。离心收集菌体，按1∶6加入PBS，超声，离心后收集上清。上清中加入Triton-100至终浓度1％，混匀，再加入一定量的Glutathione Sepharose 4B，亲和吸附0.5h，用10倍体积PBS洗3次，去上清，最后用洗脱液(10mmol/L reduced glutathione，50mmol/L Tris-Cl pH8.0)洗脱并收集目的蛋白.Glutathione Sepherose4B层析柱便得到CGRP衍生物I。CGRP衍生物I共有267个氨基酸，分子量为？ku。
制备CGRP衍生物II是从pGEX-CGRP质粒上用PCR方法扩出CGRP基因，再加入化学合成编码HHL的基因，退火后与pGEX-4T-2载体连接，构建成质粒pGEX-CGRP-3AA，转入大肠杆菌受体菌TG1。用双酶切与PCR扩增及核苷酸序列分析，确证转化子的序列与所设计的序列一致。转化子在LB培养基上培养，挑取单菌落25℃的温度下培养，然后收集细菌细胞，破碎菌体，收集融合蛋白。然后将融合蛋白悬浮于PBS，超声，离心后收集上清。上清中加入Triton-100至终浓度为1％，混匀，再加入一定量的Glutathione Sepharose4B，亲和吸附0.5h，用10倍体积PBS洗3次，去上清，最后用洗脱液(10mmol/L reducedglutathione，50mmol/L Tris-Cl pH8.0)洗脱并收集目的蛋白，便得到CGRP衍生物II。CGRP衍生物II共含有272个氨基酸，与天然CGRP相比它的N端增加230个氨基酸，C端增加5个氨基酸，其分子量为31.2ku。
将CGRP衍生物II中化学合成的编码HHL的基因换成编码RPLKPW的基因，即可以得到CGRP衍生物III。衍生物III与天然CGRP相比它是由三个肽段组成，它的N端增加了230个氨基酸，C端增加8个氨基酸。共含有275个氨基酸，其分子量为31.6ku。
这三种CGRP衍生物都有生物活性，以自发性高血压大鼠(SHR)为动物模型，检测三种CGRP衍生物的生物活性。
自发性高血压大鼠(SHR)的特点为：平均收缩压为220mmHg，舒张压为180mmHg。将SHR固定，样品采取腿部肌肉注射，待其静下来后，测量其尾动脉血压(大鼠电脑血压心率仪测)，反复数次。样品CGRP衍生物I，CGRP衍生物II，CGRP衍生物III，用BCA法测定浓度后，分别用生理盐水稀释到0.2μg/μl，每个样品分别注射100μl(三种衍生物中
CGRP目的蛋白的实际含量分别为2.03μg，2.0μg，1.47μg)。以标准CGRP为阳性对照，注射量约为2.0μg；以空载体pGEX-4T-2为阴性对照，分别测量收缩压和舒张压的变化。每个样品注射4只大鼠。注射后都能引起血压下降，见图4和图5所示。
从图1显示的收缩压变化曲线可以看出，3种蛋白衍生物的降压幅度均能达到2.7~4.0kPa，CGRP衍生物I的维持时间约为30min，CGRP衍生物II的维持时间约为50min，CGRP衍生物III的维持时间约为45min。从图2显示的舒张压变化曲线可以看出，衍生物II的降压效果更为明显，在24min左右降幅达到8.0kPa，维持时间达70min以上，而CGRP衍生物I与CGRP衍生物III的降压幅度则与CGRP标准品相似，可是CGRP衍生物I的降压维持时间也稍短于CGRP标准品.
总之，这三种CGRP衍生物都有生物活性，其降压特征如下表：
表1 三种CGRP衍生物降低收缩压的降压特征 种 类 给药浓度降低幅度药效维持时间CGRP衍生物I 20μg 2.7～4.0kPa 30分CGRP衍生物II 20μg 2.7～4.0kPa 50分CGRP衍生物III 20μg 2.7～4.0kPa 45分
表2三种CGRP衍生物降低舒张压的降压特征 种 类 给药浓度 降低幅度 药效维持时间CGRP衍生物I 20μg 5.5kPa 35分CGRP衍生物II 20μg 8.0kPa 70分CGRP衍生物III 20μg 4.0kPa 48分
序列表
SEQ.ID.NO1：
ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF
SEQ.ID.NO2：
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQS
MAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRL
CHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQ
GWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSIEGR
SEQ.ID.NO3
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQS
MAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRL
CHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQ
GWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSIEGRACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKA
F
SEQ.ID.NO4：
VDHHL
SEQ.ID.NO5：
VDRPLKPW